老年原发性直肠癌组织中miRNA-143和miRNA-221的靶基因预测及相关生物信息学分析

目的 探讨miRNA-143和miRNA-221在老年直肠癌中的诊断价值及临床意义。 方法 收集2015年9月-2016年12月蚌埠医学院第一附属医院老年直肠癌患者标本50例和健康人群标本30例,使用高通量测序技术、荧光定量PCR检测验证直肠癌及正常组织中miRNA差异表达;Pearson检验对miRNA-143和miRNA-221进行相关性分析;miRBase数据库预测两者miRNA的靶基因;R 3.4.0软件绘制差异miRNA热图聚类图,miRNet数据库和cytoscape 3.5.1绘制miRNA与mRNA表达调控网络。 结果 对比正常组织,miRNA-143和miRNA-221在老年原发性直肠癌组织中均下调(P<0.001,P=0.009),两者表达水平呈正相关(r=0.517,P=0.003)。GO功能注释主要富集于MAPKK活性、干细胞发育、STAT蛋白酪氨酸磷酸化调控、蛋白质磷酸化氨基酸结合、酪氨酸磷酸化肽、调节脂质激酶活性、磷蛋白聚合、核转录mRNA聚A尾缩短等生物学过程和分子功能(P<0.01);KEGG信号通路富集主要涉及TP53基因调节细胞死亡基因转录、VEGF信号通路、IL-4信号通路、抑瘤素M信号通路(P<0.01)。调控网络表明miRNA-143和miRNA-221之间有少许靶基因重合,两者之间具有协同作用。 结论 miRNA-143和miRNA-221作为直肠癌抑癌因子,为临床老年直肠癌的诊断提供一定的临床意义。      

Alport综合征iPSCs差异性表达新小核糖核苷酸的分析

目的 构建Alport综合征(AS)与正常对照者(NC)诱导多能干细胞(iPSCs)新核糖核苷酸(novel microRNA)差异性表达谱,分析其靶基因功能。方法 采用前期工作成功从尿肾状杆细胞诱导成的iPSCs,运用高通量测序平台获得AS与NC的差异性表达谱,使用靶基因预测软件TargetScan进行靶基因预测,靶基因与参考基因比较后,在候选靶基因找到显著富集的GO条目及KEGG通路。结果 在AS与NC中发现49个有意义的差异性表达novel microRNAs,其中33个表达上调,16个表达下调。在GO靶基因富集分析中,靶基因主要富集于生物调节、生物新陈代谢、细胞组成、细胞信号传导、酶催化反应、分子转运等过程。在KEGG通路分析中,靶基因主要参与代谢通路、嘌呤代谢、癌症转录调节等过程。结论 来源于AS与NC的iPSCs存在较大的差异性表达novel microRNA,其靶基因在分子功能、细胞组成、生物过程起着重要作用。这些差异性表达的novel mciroRNAs与靶基因可能是AS发病机制的潜在位点。     

miR-30b-5p在乳腺癌中的表达及靶基因预测与生物信息学分析

目的 为深入研究miR-30b-5p在乳腺癌形成和发展中的作用提供理论依据.方法 原位杂交法(ISH)检测乳腺癌与癌旁组织中miR-30b-5p的表达.探针荧光定量PCR比较乳腺癌细胞系miR-30b-5p表达情况.软件预测miR-30b-5p的靶基因,进行KEGG及GO富集分析.结果 ISH显示乳腺癌组织中miR-30b-5p表达明显下调,与癌旁组织相比差异有统计学意义(P<0.01);miR-30b-5p的表达水平与 TNM 分期及远处转移等有关(P< 0.01),而与年龄和淋巴结转移无关(P>0.05).比较MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-415,MDA-MB-453,和 MDA-MB-468这5株乳腺癌细胞系miR-30b-5p表达情况,发现较正常乳腺组织呈不同程度的低表达,并且以侵袭性最强的MDA-MB-231细胞的表达最低(P<0.01).在乳腺癌中,KEGG分析显示miR-30b-5p的靶基因参与了Pathways in cancer、P53 signaling pathway、Wnt signaling pathway、Cell cycle等通路,GO分析显示miR-30b-5p具有细胞代谢调控、基因表达调控、RNA代谢调控等生物功能.结论 miR-30b-5p在乳腺癌中表达明显下调,可能通过参与Pathways in cancer、P53 signaling pathway、Wnt signaling pathway、Cell cycle等通路,对乳腺癌细胞的代谢、基因表达等功能具有重要影响.     

网络药理学常见不同富集方法比较研究——以当归补血汤治疗贫血为例

目的:以当归补血汤治疗贫血为例比较常见网络药理学不同富集方法的差异,并对当归补血汤的活性成分和核心靶点进行分子对接,为后续网络药理学研究提供参考。方法:从TCMSP数据库、Uni Prot数据库、Gene Cards数据库获取当归补血汤活性成分、作用靶点及贫血相关靶点,用在线Venny 2.1.0平台对活性成分作用靶点和贫血靶点取交集,用Cytoscape 3.7.1绘制药物-活性成分-靶点-疾病网络。交集靶点导入STRING蛋白互作数据库构建PPI网络,取DC值的2倍中位数得到核心靶点。使用Auto Dock软件对活性成分和核心靶点进行分子对接、验证成分和靶点的结合性。用Metascape数据库、DAVID数据库、Cytoscape软件的Glue GO插件及R语言的“cluster Profiler”程序包对核心靶点进行基因本体论(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,取KEGG通路分析结果前20条信号通路进行比较。结果:当归补血汤活性成分共22个,对应...     

双启动子DNA疫苗载体pCMVnir的构建及其启动子的活性

目的：研制携带CMVie和NirB两种双启动子的DNA疫苗新型载体pCMVnir(pCN)。方法：设计细菌IVI启动子nirB，置换pTfiEx-4中plO和T71ac启动子，获得pCN，将报告基因pEGFP-N1和pDsRed2-N1分别插入pCN构建成pCN—EGFP和pCN—DsRed两种报告质粒，转化减毒沙门菌Salmonella SL3261和大肠杆菌DH5d；同时采Fugene脂质体，转染Hela细胞和前列腺细胞，检测pCN启动子的活性。结果：pCN的两个启动子都可高效转录和表达两种荧光报告基因，并且nirB是温和厌氧依赖性的。结论：成功构建了一种双启动子DNA疫苗表达载体pCN。     

小鼠Reelin 基因启动子克隆鉴定及生物信息学分析

目的克隆小鼠Reelin基因启动子区并分析其潜在DNA甲基化位点和转录因子结合位点。方法根据NCBI上小鼠Reelin 5’非翻译区序列设计引物,利用高保真PCR方法克隆昆明小鼠Reelin启动子区序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对Reelin启动子-636 bp至-135bp序列甲基化情况分析。应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。结果成功克隆了小鼠Reelin基因启动子区0至-450片段。甲基化测序分析小鼠Reelin启动子区-636 bp至-135 bp序列没有CpG二核苷酸被甲基化。小鼠Reelin翻译起始点0至-450片段利用CpG岛序列分析软件分析显示,该区域C+G含量高达78.71%,CpG含量为14.44%。该区域有120多个潜在转录因子结合位点。结论在小鼠Reelin基因启动子区0～-450发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠Reelin基因表达调控起重要作用。     

冠心病急性心肌梗死患者外周血差异基因表达分析及功能

目的 探讨冠心病急性心肌梗死患者外周循环血单核细胞中差异基因表达及功能。方法 收集2020年9月至2021年9月在昆明市第一人民医院接受冠脉造影的患者,提取外周血单核细胞总RNA,使用DNBSEQ平台进行第2代高通量测序。检测并筛选差异表达基因,进行KEGG及GO富集分析。结果 冠心病急性心肌梗死组与冠脉正常组对比,其中差异基因89个,上调基因67个,下调基因22个;其中差异lncRNA14个,差异mRNA72个,差异circRNA3个。完成KEGG pathway富集分析、KEGG disease富集分析、KEGG molecular富集分析。完成GO cell composition富集分析、GO cell function富集分析、GO biological process molecular富集分析。结论 筛选出显著差异的10个mRNA、6个lncRNA、2个circRNA。富集分析中涉及感染、转录失调、PI3K-Akt信号通路、脂类合成、吞噬泡腔、细胞外基质、脂多糖结合等,与冠状动脉粥样硬化的发生与发展及急性血栓事件的发生可能相关。     

肾素基因启动子区域甲基化水平与精神分裂症患者认知损害的关联

目的：探索肾素基因启动子甲基化水平与精神分裂症可能的相关性及潜在的生物学作用。方法：利用外周血单个核细胞基因组,采用Massarray飞行时间质谱法,测定肾素基因启动子CpG位点的甲基化水平。采用剑桥神经心理自动化成套测试中的快速视觉信息处理(rapid visual information processing, RVP)和延迟匹配(delayed matching to sample, DMS)评估受试者注意力及视觉记忆。结果：发现两组间肾素基因启动子甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05)。以性别、年龄、患病状态作协变量,CpG位点[chr1:204166158(hg38)]的甲基化比例与RVP总正确反应数(r=-0.68, P=2.42×10-7),RVP A’(r=-0.61, P=6.94×10-6),DMS总正确数(r=-0.55, P=1.02×10-4),DMS延迟正确数(r=-0.54, P=1.52×10-4)显著相关。结论：肾素基因可能通过启动子甲基化在精神分裂症病理中发挥一定的作用。     

妊娠期糖尿病患者外周血长链非编码RNA表达谱的差异性分析

目的 探讨妊娠期糖尿病(GDM)患者外周血中长链非编码RNA(lncRNAs)的差异表达谱及其功能。方法 分别收集2020年7月至2021年12月在宣汉县人民医院妇产科入院治疗的妊娠期糖尿病患者(GDM组)、门诊健康体检孕妇(对照组)外周血标本各3例。使用高通量测序技术筛选获得差异表达的lncRNA,并通过GO富集分析和KEGG Pathway富集分析查明差异表达的lncRNAs靶向调控的m RNA转录本的生物信息学功能。结果 与对照组比较,GDM组共筛选出差异表达的lncRNAs 333个,mRNA 2 036个,其中上调的lncRNAs 169个,m RNA645个;下调的lncRNAs 164个,m RNA 1 391个;GO生物学功能富集分析结果显示：差异表达的lncRNAs靶向调控的mRNA转录本主要富集在转录因子AP-1复合物、蛋白质复合物分解的调控、免疫系统调节、防御反应、细胞解剖实体、大分子代谢过程的调控、氮化合物代谢过程的调控、胞浆、代谢过程调节等;KEGG信号通路富集分析结果显示：差异表达的lncRNAs靶向调控的m RNA转录本参与的信号通路主要包括B细胞受体信号...     

小鼠PP1基因启动子克隆鉴定及潜在甲基化位点分析

目的 PP1分子是一种与学习记忆相关的分子,目前对其表达调控尚未有系统的研究。为了研究小鼠PP1基因启动子区甲基化潜在的位点和转录因子结合位点而克隆小鼠PP1启动子区。方法本实验利用NCBI上小鼠PP15’非翻译区序列设计引物,使用高保真Taq酶,利用PCR方法扩增昆明小鼠PP1启动子0至-320序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对PP1启动子0至-320序列甲基化情况分析。然后再应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。利用CpG岛序列分析软件分析。结果成功克隆得到PP1基因启动区0到-320 bp片段。甲基化测序分析该片段只有一个CpG位点被甲基化。软件分析表明小鼠PP1翻译起始点到-320 bp区域C+G含量高达70.25%,CpG含量为11.75%,含有70个潜在的转录因子结合位点。结论在小鼠PP1基因启动子区0～-320发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠PP1基因表达调控起重要作用。     

基于TMT定量蛋白质组学对白蛋白结合型紫杉醇所致周围神经病变的机制研究

目的 基于串联质谱标签(tandem mass tag, TMT)定量蛋白质组学技术探究白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel, nab-PTX)导致周围神经病变的作用机制。方法 将6只雄性成年SD大鼠随机分为实验组与对照组,实验组大鼠分别于第1,3,5,7天腹腔注射白蛋白结合型紫杉醇(10 mg/kg体质量),建立周围神经病变大鼠模型,对照组大鼠不进行特殊干预继续正常培养,期间观察两组大鼠状态、饮食及粪便情况,并隔日称量体质量。末次给药48 h后取L_4-6脊髓提取蛋白酶切后TMT标记。通过MaxQuant软件对TMT标记蛋白质进行鉴定及分析得出实验组与对照组的差异蛋白,对差异蛋白进行基因本体分析(gene ontology, GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析。结果 蛋白质组学共鉴定蛋白5 519种,对4 730种蛋白进行定量分析,筛选出370种差异蛋白,如组蛋白H2B(histone H2B)、载脂蛋白D(apolipoprotein D)、激肽原-1...     

Klotho基因启动子区域定位及活性分析

目的构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性。方法以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性。结果双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01)。结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因。     

人Smac基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的分析线粒体促凋亡蛋白(Smac)基因启动子区结合蛋白,预测其转录调控因子。方法从基因参考序列数据库获取Smac基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果成功获得了长度为2 kb的人Smac基因启动子区序列。该启动子区Threshold score≥90的共有71个转录因子结合位点,涉及STAT家族、bZIP家族、叉头蛋白家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、MYB家族、GATA结合蛋白家族、SOX家族、同源异型框基因家族10个家族的转录因子和1个TATA box。结论 Smac表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Smac的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

清道夫受体B1基因启动子甲基化与冠心病的关联分析

目的 探讨清道夫受体B1(SCARB1)基因启动子区域甲基化与冠心病发病的关联性。方法 选取2018年12月至2020年5月在上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的120例冠心病患者作为病例组,并随机选取同期健康体检人群中性别和年龄匹配的140名健康受试者作为对照组,进行病例对照研究。采用亚硫酸盐转化,扩增目标区域后采用高通量测序对基因组进行甲基化检测,分析两组SCARB1基因启动子区域CpG位点的甲基化差异。结果 病例组SCARB1+67基因的甲基化水平显著高于对照组(P<0.001),SCARB1+134基因的甲基化水平显著低于对照组(P<0.001),且在男性(P均<0.001)、女性(P均<0.001)冠心病患者中与对照组比较差异有统计学意义。病例组SCARB1基因的平均甲基化水平显著低于对照组[(80.27±2.14)%比(81.11±1.27)%;P=0.006],且只在男性冠心病患者中差异有统计学意义(P=0.002)。结论 SCARB1基因的甲基化水平与冠心病的发病存在关联,可能参与其发生发展过程。     

不同启动子对癌胚抗原DNA疫苗在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫的影响

目的比较含不同启动子的癌胚抗原DNA疫苗pCEA和pLCEASN在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫的差别。方法将7天前肌肉注射0.75%布比卡因的小鼠分成4组,每组5只,分别将含不同启动子的重组质粒pCEA、pLCEASN及阴性对照质粒pcDNA3、pLXSN注射于小鼠的舌肌内,每周1次,每次100/μg,共5次;最后1次注射7天后,眼球内眦静脉取血测抗-CEA滴度,处死小鼠并取其舌用放免法测其CEA的含量。结果用pLCEASN和pCEA质粒DNA免疫的小鼠舌肌的CEA含量(ng/mg舌肌)分别为1.85±0.11和2.48±0.09(P<0.001),血清(1:200稀释)抗-CEA滴度(OD490)分别为0.42±0.04和0.59±0.06(P <0.001)。结论启动子对癌胚抗原DNA疫苗在小鼠体内表达CEA及诱导体液免疫方面具有重要作用。