盐酸小檗碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的影响

目的探讨盐酸小檗碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移能力的影响。方法对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞株分为对照组(普通培养液)、紫杉醇组(培养液+100mg/L紫杉醇)、观察组(培养液+盐酸小檗碱),采用MTT法检测盐酸小檗碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响,依据细胞生长抑制率计算盐酸小檗碱对人乳腺癌MCF-7细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))值,参照IC_(50)值进行后续实验;采用划痕实验检测3组人乳腺癌MCF-7细胞迁移率;采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)1A1和CYP1B1 mRNA表达水平。结果盐酸小檗碱对人乳腺癌MCF-7细胞具有明显的增殖抑制作用,其IC_(50)值为(106±17)μmol/L;人乳腺癌MCF-7细胞迁移率在紫杉醇组[(45.50±4.30)%]和观察组[(37.50±3.43)%]均低于对照组[(84.60±6.88)%],且观察组低于紫杉醇组(P0.05);CYP1A1 mRNA表达量在紫杉醇组(247.69±59.67)和观察组(253.70±60.03)均低于对照组(512.31±76.53),且紫杉醇组低于观察组(P0.05);CYP1B1 mRNA表达量在紫杉醇组(139.09±18.82)和观察组(141.53±19.25)均低于对照组(224.63±33.89)(P0.05),观察组与紫杉醇组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论盐酸小檗碱具有抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移的作用,其机制可能与抑制CYP1A1、CYP1B1基因表达有关。     

靶向MMP小干扰RNA对视网膜母细胞瘤增殖和凋亡的影响

目的研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因沉默对人视网膜母细胞瘤(RB)增殖和凋亡的影响。方法设计并合成针对MMP-2和MMP-9的特异性小干扰RNA(siRNA)序列,按照实验要求进行分组:空白对照组(未转染的细胞);阴性对照组(转染空载体+阴性siRNA);干扰组(转染空载体+特异siRNA)。利用转染试剂转入体外培养人RB细胞,48 h后收集细胞,RT-PCR和Western blot验证siRNA的干扰效应,MTT法检测细胞增殖活性、Annexin V/PI检测细胞凋亡。结果 RT-PCR及Western检测结果显示,MMP-2 siRNA和MMP-9 siRNA转染后,与空白组、阴性对照组相比,干扰组MMP-2及MMP-9mRNA水平明显下降,其蛋白表达也明显下调(P0.05)。MTT结果显示,干扰组细胞OD值及增殖抑制率明显低于空白组及阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05)。细胞凋亡实验同样证实干扰组的细胞凋亡率明显高于空白组及阴性对照组(P0.05)。结论 siRNA沉默MMP-2和MMP-9的表达可诱导RB细胞凋亡,抑制细胞的增殖,为RB的临床治疗提出新的思路,可以作为RB治疗的一个新靶点。     

siRNA干扰β-catenin基因表达情况与喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的关系

目的探讨小干扰RNA(siRNA)干扰β-链蛋白(β-catenin)基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法前瞻性选取喉癌Hep-2细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,其中干扰组转染靶向β-catenin的siRNA,阴性对照组转染空白siRNA。采用荧光定量PCR和Western-blot检测β-catenin mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transell法观察细胞侵袭能力。结果干扰组β-catenin mRNA和蛋白相对表达量分别为(0.304±0.015)和(0.234±0.065),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组培养48 h和72 h吸光值分别为(0.721±0.250)和(0.942±0.321),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组细胞凋亡率为(19.10±1.24)%,明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组穿膜细胞数为(22.41±3.25)个,明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论干扰β-catenin基因,可抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。     

MMP-2基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因对前列腺癌细胞恶性表型的影响及其机制。方法 Western blot和RT-PCR检测人正常前列腺上皮RWPE-1细胞和前列腺癌PC3细胞中MMP-2的表达情况;以脂质体Lipfectamine 2000将MMP-2 siRNA和MMP-2 control质粒分别转染至siRNA MMP-2组和siRNA control组细胞中,以不做处理的细胞为对照组。Western blot和RT-PCR检测其转染效果;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞的侵袭和迁移;FCM检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)和Cleaved Caspase-8蛋白的表达。结果与RWPE-1细胞相比,PC3细胞中MMP-2蛋白和mRNA的表达水平显著升高(P0.05)。MMP-2在siRNA MMP-2组细胞中的蛋白和mRNA表达显著低于对照组(P0.05),而siRNA control组与对照组间MMP-2的蛋白和mRNA表达水平差异无显著性(P0.05)。siRNA MMP-2组细胞的OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数和VEGF蛋白的表达水平显著下降,而细胞凋亡率和Cleaved Caspase-8蛋白水平显著升高,差异均显著性(P0.05);对照组和siRNA control组间OD值、侵袭细胞数、迁移细胞数、细胞凋亡率、VEGF和Cleaved Caspase-8蛋白表达均未见显著差异(P0.05)。结论 MMP-2在前列腺癌PC3细胞中高表达,干扰其表达可抑制细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进细胞凋亡,其作用机制可能与下调VEGF蛋白和上调Cleaved Caspase-8蛋白的表达有关。     

基质金属蛋白酶-2与乳腺癌血管生成和肿瘤生物学行为的关系

目的:基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质和基底膜,在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。研究基质金属蛋白酶-2(matrixmetallopro-teinase2,MMP-2)及其mRNA在乳腺癌组织和细胞中的表达,探讨其与血管生成及肿瘤生物学行为的关系。方法:实验于2002-01/2004-01在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。应用免疫组织化学、免疫细胞化学、原位杂交、侵袭实验、明胶酶谱分析及形态定量分析方法,对76例乳腺癌组织和体外培养的MCF-7细胞中MMP-2及其mRNA、微血管密度(MVD)进行检测。结果:乳腺癌组织中MMP-2及其mRNA的表达均高于癌旁正常组织;MMP-2及其mRNA主要表达于肿瘤细胞胞浆中,其阳性率分别为77.63%和71.05%;MMP-2及其mRNA的表达均与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。MVD与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。MMP-2或其mRNA表达阳性组MVD值明显高于阴性组。MCF-7细胞中MMP-2及其mRNA均为阳性;MMP-2抗体可使MCF-7细胞侵袭细胞数由(56.21±3.68)个/400倍下降为(20.32±3.24)个/400倍;直接培养于培养瓶的MCF-7细胞可以分泌MMP-2酶原,培养于I型胶原包被培养瓶的MCF-7细胞MMP-2酶原表达增强并且出现活化形式。结论:乳腺癌组织和细胞具有较强的分泌MMP-2的能力,MMP-2促进肿瘤的侵袭和转移,     

下调ALDH1A1基因表达对体外培养的鼻咽癌细胞系迁移能力的影响

目的探讨siRNA干扰ALDH1A1基因表达对鼻咽癌5-8F和CNE2细胞迁移侵袭能力的影响。方法将鼻咽癌5-8F和CNE2细胞分为5-8F干扰组、5-8F空载组、CNE2干扰组、CNE2空载组,利用已构建的慢病毒pMagic 4.1-ALDH1A1siRNA载体和pMagic 4.1-shRNA空载体分别感染5-8F和CNE2细胞,建立稳定干扰ALDH1A1表达的鼻咽癌5-8F、CNE2细胞株和空载的5-8F和CNE2细胞株。4组采用Western blot法检测细胞ALDH1A1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9蛋白表达,采用Transwell小室实验检测各组迁移细胞数,采用Boyden小室实验检测各组侵袭细胞数。结果 5-8F干扰组ALDH1A1蛋白表达(0.34±0.01)低于5-8F空载组(0.75±0.03),CNE2干扰组ALDH1A1蛋白表达(0.24±0.03)低于CNE2空载组(0.71±0.03);5-8F干扰组鼻咽癌细胞迁移细胞数(35.0±2.6)、侵袭细胞数(32.7±2.1)均低于5-8F空载组(117.6±3.2,105.6±4.0),CNE2干扰组鼻咽癌细胞迁移细胞数(34.0±3.0)、侵袭细胞数(32.3±1.5)均低于CNE2空载组(121.0±4.0,108.0±1.7)(P0.01);5-8F干扰组VEGF(0.49±0.03)、MMP-2(0.36±0.04)、MMP-9(0.31±0.04)蛋白表达低于5-8F空载组(0.73±0.02、0.50±0.02、0.89±0.01)(P0.01),CNE2干扰组VEGF(0.48±0.02)、MMP-2(0.37±0.02)、MMP-9(0.41±0.02)蛋白表达低于CNE2空载组(0.78±0.05、0.67±0.05、0.76±0.04)(P0.01)。结论下调ALDH1A1基因表达可抑制鼻咽癌细胞迁移侵袭。     

碳酸酐酶Ⅸ抑制剂对乳腺癌细胞在低氧环境下的生长抑制作用及其机制

目的探讨碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydraseⅨ, CAⅨ)抑制剂对人乳腺癌MCF-7细胞在低氧环境中的增殖抑制作用和机制。方法人乳腺癌MCF-7细胞培养24 h后,采用实时定量PCR法检测细胞在1%低氧和21%正常氧气环境下CAⅨmRNA相对表达量;将对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞分为25、50、100μmol/L U-104组(分别加入含25、50、100μmol/L U-104的细胞培养液进行处理)和对照组(加入等量细胞培养液),低氧环境下培养48 h后,采用MTT法检测各组人乳腺癌MCF-7细胞的存活率,采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测对照组和100μmol/L U-104组细胞凋亡率;培养24 h后,采用Western blot法检测对照组和50、100μmol/L U-104组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相对表达量。结果培养24 h后,MCF-7细胞1%低氧环境中CAⅨmRNA相对表达量(23.93±4.02)高于21%正常氧环境(1.00±0.00)(P0.05);培养48 h后,对照组及25、50、100μmol/L U-104组细胞存活率[100%、(57.30±5.06)%、(28.84±3.52)%、(9.63±2.58)%]依次降低(P0.05),100μmol/L U-104组细胞凋亡率[(89.46±3.05)%]高于对照组[(6.54±0.92)%](P0.05);培养24 h后,对照组及50、100μmol/L U-104组细胞Bcl-2蛋白相对表达量(0.576±0.040、0.253±0.030、0.103±0.020)依次降低(P0.05),Bax蛋白(0.103±0.020、0.216±0.020、0.413±0.030)和caspase-3蛋白(0.216±0.020、0.373±0.010、0.540±0.020)相对表达量依次增高(P0.05)。结论 CAⅨ抑制剂U-104在低氧条件下对乳腺癌MCF-7细胞有明显增殖抑制作用,其机制可能是U-104抑制了CAⅨ在低氧状态下的活性,激活Bax、caspase-3和抑制Bcl-2,从而诱导乳腺癌细胞的凋亡。     

hTERT基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性及COX-2表达的影响

目的本研究探讨hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对hTERT mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 hTERT基因沉默48h后,hTERT转染组在沉默hTERT基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在hTERT转染组的增殖得到显著抑制(P0.05);小室侵袭实验结果表明,hTERT转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在hTERT转染组的表达明显降低,并与hTERT基因的表达相关联。结论 hTERT基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。     

基质金属蛋白酶—2与乳腺癌血管生成和肿瘤生物学行为的关系

目的：基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质和基底膜，在肿瘤的浸润和转移过程中起重要作用。研究基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)及其mRNA在乳腺癌组织和细胞中的表达，探讨其与血管生成及肿瘤生物学行为的关系。方法：实验于2002—01／2004—01在吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室完成。应用免疫组织化学、免疫细胞化学、原位杂交、侵袭实验、明胶酶谱分析及形态定量分析方法，对76例乳腺癌组织和体外培养的：MCF-7细胞中MMP-2及其mRNA、微血管密度(MVD)进行检测。结果：乳腺癌组织中：MMP-2及其mRNA的表达均高于癌旁正常组织；MMP-2及其mRNA主要表达于肿瘤细胞胞浆中，其阳性率分别为77．63％和71．05％；MMP-2及其mRNA的表达均与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。MVD与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。MMP-2或其mRNA表达阳性组MVD值明显高于阴性组。MCF-7细胞中MMP-2及其mRNA均为阳性；MMP-2抗体可使MCF-7细胞侵袭细胞数由(56.21&;#177;3．68)个／400倍下降为(20．32&;#177;3．24)个／400倍；直接培养于培养瓶的MCF-7细胞可以分泌MMP-2酶原，培养于Ⅰ型胶原包被培养瓶的MCF-7细胞MMP-2酶原表达增强并且出现活化形式。结论：乳腺癌组织和细胞具有较强的分泌MMP-2的能力，MMP-2促进肿瘤的侵袭和转移，促进乳腺癌血管生成，可作为判定乳腺癌生物学行为、临床治疗和预后的重要指标。     

TPX2-siRNA干扰对食管鳞癌EC9706细胞侵袭能力和细胞凋亡的影响

目的观察TPX2基因经特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)作用后对食管鳞癌细胞系EC9706的侵袭能力和细胞凋亡的影响。方法用脂质体lipofectamine 2000介导TPX2-siRNA(siTPX2)转染EC9706细胞,实验分为空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组。用western blot检测siRNA干扰效率,Boyden chamber法检测细胞侵袭能力,末端转移酶标记技术(TUNEL法)检测细胞凋亡情况。结果有效转染siTPX2 72 h后,siRNA干扰组TPX2蛋白表达水平为0.39±0.12,低于空白对照组1.00±0.01和阴性对照组0.98±0.11,P<0.05;Boyden chamber法检测结果,siRNA干扰组穿膜细胞数为45.30±8.08,少于空白对照组129.40±10.58和阴性对照组121.90±7.83,t分别为8.17和7.90,P<0.05;siRNA干扰组细胞侵袭抑制率为(71.42±9.12)%,明显高于阴性对照组(5.65±3.55)%,t=14.256,P<0.01。TUNEL结果表明,干扰组细胞凋亡指数为18.28±0.35,高于空白对照组4.07±0.26和阴性对照组4.13±0.22,t分别为60.61和53.32,P<0.01。结论 siRNA可以有效抑制EC9706细胞侵袭和转移,促进细胞凋亡,有望作为食管癌治疗的新途径。     

吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的探讨吉西他滨对乳腺癌细胞凋亡作用及其对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法应用MTT比色检测法测定不同浓度(0、5、10、100、250)μmol/L不同作用时间(24 h、48 h、72 h)下吉西他滨对MCF-7人乳腺癌不同时期细胞生长抑制作用,倒置显微镜观察吉西他滨对MCF-7细胞形态学的影响,流式细胞仪测定MCF-7细胞凋亡情况,应用Western blot法及免疫荧光法对Bcl-2、Bax蛋白进行定性及定量分析。结果 MTT结果显示,吉西他滨能有效抑制MCF-7细胞增殖,且呈剂量及时间依赖性。在倒置显微镜下观察吉西他滨作用MCF-7细胞后,细胞呈通透性增加,形态不规则,细胞脱落破碎等改变。MCF-7乳腺细胞培养24 h后应用流式细胞仪可观察到5μmol/L、10μmol/L吉西他滨组细胞凋亡率分别为(34.25±3.89)%、(45.89±4.32)%显著高于对照组(4.02±0.39)%,差异有统计学意义(t=5.269,7.452,P0.05)。Western blot法显示MCF-7细胞中Bax蛋白表达增多,而Bcl-2蛋白表达减少。免疫荧光法显示在细胞培养24 h后随着吉西他滨浓度增加,Bax蛋白表达强度增加,而Bcl-2蛋白表达强度减弱。结论吉西他滨能有效抑制乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白有关。     

vasohibin-2和血管内皮生长因子在乳腺癌中表达及分子机制

目的探讨vasohibin-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在乳腺癌组织中的表达及其分子机制。方法 30例乳腺癌患者手术切除的新鲜乳腺癌组织(乳腺癌组)和癌旁乳腺组织(癌旁组),18例乳腺纤维腺瘤患者手术切除的新鲜乳腺纤维腺瘤组织(腺瘤组)。3组采用反转录-PCR检测vasohibin-2和VEGF mRNA水平,采用Western blot检测vasohibin-2和VEGF蛋白表达水平。培养人乳腺癌细胞MCF-7,应用50μg/L VEGF刺激人乳腺癌细胞株MCF-7,于0、6、12、24、48h时采用跨膜迁移实验观察VEGF对乳腺癌细胞迁移的影响。结果乳腺癌组vasohibin-2和VEGF-C mRNA(15.35±1.31、10.75±1.34)和蛋白(2.01±1.29、2.89±1.06)表达水平明显高于癌旁组(mRNA为1.21±0.36、0.92±0.19,蛋白为0.56±0.22、0.83±0.31)和腺瘤组(mRNA为0.51±0.26、0.91±0.31),蛋白为(0.33±0.17、0.85±0.13)(P均0.05);乳腺癌组淋巴结转移者vasohibin-2和VEGF mRNA(20.19±2.57、16.32±2.24)和蛋白(2.95±1.66、3.66±1.89)表达水平高于未转移者(mRNA为10.22±1.86、8.42±2.16,蛋白为1.74±1.23、2.18±1.56)(P均0.05);加入VEGF后0、6、12、24、48h时,乳腺癌MCF-7细胞的细胞迁移率分别为3.51%、14.62%、37.18%、71.49%、95.43%,两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 vasohibin-2和VEGF在乳腺癌组织中表达上调且其表达与淋巴结转移有关,VEGF可促进乳腺癌细胞迁移并上调vasohibin-2基因表达。     

siRNA沉默VDAC1对MCF-7细胞增殖、周期的影响及其作用机制

[目的]观察siRNA沉默VDAC1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响.[方法]针对人VDAC1基因设计并合成siRNA,并将VDAC1-siRNA转染MCF-7细胞后,应用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测MCF-7细胞中VDAC1的表达水平,MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况,流式细胞术检测MCF-7细胞的周期分布,同时Western印迹法检测周期蛋白D1的表达.[结果]MCF-7细胞转染VDAC1-siRNA后能够有效抑制VDAC1的表达,显著抑制其增殖水平,促使MCF-7细胞发生G1期阻滞,同时下调Cyclin D1蛋白表达.[结论]VDAC1沉默能够有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,促使细胞发生G1期阻滞.VDAC1可作为乳腺癌治疗的新靶点.     

RNA干扰法对内皮细胞基质金属蛋白酶-2功能研究

本研究运用RNA干扰（RNAi）技术将内皮细胞MMP-2进行基因沉默，揭示MMP-2在内皮细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成以及细胞周期等方面的作用。采用脂质体法将MMP-2小干扰RNA（siRNA）转化内皮细胞EAhy926，通过RT—PCR及流式细胞术分别在基因和蛋白水平验证转化的效率。应用MTT比色法测定经MMP-2siRNA干扰不同时间EAhy926细胞的增殖能力；虎红染色测定光密度法观察干扰48小时后内皮细胞在两种趋化因子作用下的迁移及侵袭能力的变化；Matrigel胶三维培养法观察干扰48小时后内皮细胞血管形成能力的改变；流式细胞术及半定量RT—PCR法测定内皮细胞周期和相关基因的变化。结果表明：干扰因素施加后48小时MMP-2基因表达水平降低至谷底，较正常对照下降约82％；流式细胞术分析表明，干扰因素施加后60小时MMP-2蛋白表达水平降低至谷底，较对照下降约60％。旧法检测显示干扰前后内皮细胞增殖无明显变化。内皮细胞经MMP-2siRNA干扰48小时后在两种趋化因子作用下的迁移能力均受到抑制，且对COLⅣ的抑制作用强于Fn（Fn未干扰组0．581±0．012，干扰组0．261±0．002；COLⅣ未干扰组对干扰组为0．467±0．009vs0．110±0．010，P〈0．01）。侵袭实验也有相似的结果（Fn未干扰组对干扰组为0．365±0．012vs0．101±0．002；COLⅣ未干扰组对干扰组为0．317±0．009vs0．102±0．010，P〈0.01）。内皮细胞体外的血管形成能力在经siRNA干扰48小时后下降至正常的58．9％。内皮细胞经MMP-2siRNA干扰48小时及72小时后，有丝分裂后期细胞比例（G1）分别由对照组[（65．9±2．53）％；（63．2±1.89）％]上升至[（83．9±2．53）％，（89．2±1．24）％]（P〈0．01）；DNA复制期（S）和有丝分裂前期（G2）期细胞比例分别由对照组[（32．7±1．91）％，（37．1±2．65）％]下降至[（18．1±1.49）％，（10．2±0．     

Cdx2-siRNA对胃癌细胞Survivin和Caspase-9表达的影响

目的:观察Cdx2小分子干扰RNA(Cdx2-siRNA)对人胃癌MGC-803细胞凋亡及Survivin、Caspase-9表达的影响。方法:设计合成针对Cdx2基因的siRNA寡核苷酸以及阴性对照siRNA。将人胃癌MGC-803细胞接种于培养板中,分为3组,正常对照组不作处理,阴性对照组和Cdx2-siRNA组分别用LipofectamineTM2000将阴性对照siRNA或Cdx2-siRNA成功转染进细胞内。应用流式细胞仪检测转染24h时MGC-803细胞凋亡的变化,并应用RT-PCR和Western blot技术检测胃癌MGC-803细胞中Survivin和Caspase-9基因mRNA和蛋白的表达。结果:Cdx2-siRNA组MGC-803细胞的凋亡率为(12.5±0.6)%,明显高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);Cdx2-siRNA组Survivin mRNA和蛋白的表达量分别为(0.14±0.04)和(0.51±0.12),明显低于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);Cdx2-siRNA组Caspase-9 mRNA和蛋白的表达量分别为(0.98±0.24)和(1.78±0.41),明显高于阴性对照组和正常对照组(P<0.05);而阴性对照组和正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Cdx2-siRNA促进人胃癌细胞的凋亡,其机制可能与其抑制Survivin的表达、增强Caspase-9的活性有关。     

乳腺癌间质干细胞对紫杉醇诱导MCF-7细胞凋亡的作用

目的分离、培养、鉴定乳腺癌及癌旁组织来源的间质干细胞(BC-MSCs,BN-MSCs),探讨其对紫杉醇诱导的乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响。方法采用组织贴壁法分离培养MSCs,成骨成脂诱导法检测其分化能力,流式细胞术分析其表面标记。收集MSCs 48 h的培养上清液(BC-MSCs-CM,BN-MSCs-CM),分别与紫杉醇共同处理MCF-7细胞,MTT实验检测各不同处理组MCF-7细胞的抑制率及细胞生长状况,细胞分析仪检测MCF-7细胞凋亡及细胞活力情况。结果乳腺癌及癌旁组织中能够分离培养出MSCs,显微镜下观察细胞呈长梭形,诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞,该MSCs高表达CD29、CD90,不表达CD14、CD45表面分子标志;BC-MSCs-CM+紫杉醇处理组的细胞抑制率低于紫杉醇处理组;紫杉醇+BC-MSCs-CM处理组MCF-7细胞凋亡率(27.60%±2.12%)低于紫杉醇组(47.80%±2.59%),差异有统计学意义(P<0.05);紫杉醇+BC-MSCs-CM处理组MCF-7细胞活力(72.07%±2.09%)高于紫杉醇组(51.30%±2.35%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌组织中能够分离培养出BC-MSCs,和BN-MSCs相比,BC-MSCs能够显著减少紫杉醇诱导MCF-7细胞的凋亡,增加其活力。     

MK基因特异性siRNA对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制Midkine对人乳腺癌癌细胞株MCF-7细胞凋亡的影响。方法人工合成抑制Midkine基因的siRNA片段,通过脂质体转染到MCF-7细胞内,应用RT-PCR检测bcl-2mRNA表达,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化,通过测定光密度值检测Caspase-3活性。结果转染siRNA后的MCF-7细胞,bcl-2mRNA表达显著下降、细胞线粒体膜电位明显下降和Caspase-3酶活性升高。结论MK-siRNA通过下调hcl-2基因,而改变细胞线粒体膜电位使Caspase-3酶活性升高诱导细胞的凋亡。     

小飞蓬活性成分对乳腺癌MCF-7细胞的作用

目的通过体外实验研究小飞蓬（Erigeron canadensis L.）活性成分对乳腺癌MCF-7细胞生长、凋亡和侵袭的影响。方法以5-氟尿嘧啶（5-FU）作用组为阳性对照组,以不加药组为阴性对照组,小飞蓬组为实验组作用MCF-7细胞。采用CCK8试剂盒测定药物对MCF-7的生长抑制率。绘制在不同药物浓度作用下的细胞生长曲线。观察不同药物浓度作用下细胞的形态学变化。利用免疫细胞化学染色技术检测药物作用后MCF-7细胞Caspase-3、MMP-9表达情况。结果 （1）小飞蓬活性成分可抑制MCF-7细胞的生长,IC50为0.29 mg.mL-1;（2）生长曲线显示,药物作用后的MCF-7细胞生长较对照组缓慢,形态学观察显示细胞逐渐变为长,黏附性减弱;（3）药物作用后的MCF-7细胞Caspase-3的表达强于不加药物组（P〈0.001）,MMP-9的表达明显弱于对照组（P〈0.001）。结论小飞蓬活性物质可抑制MCF-7细胞生长、侵袭,诱导凋亡。     

基质金属蛋白酶-26促进乳腺癌细胞的黏附、迁移和侵袭

目的获得稳定表达MMP-26蛋白的乳腺癌细胞株,明确MMP-26蛋白在乳腺癌细胞黏附、迁移和侵袭中的作用。方法将含有MMP-26基因全长序列的pcDNA3.1质粒稳定转染人乳腺癌MCF-7细胞株,筛选阳性表达克隆扩大培养,对比其转染前后在Matrigel上的黏附和铺展能力以及在Boyden小室中的迁移和侵袭能力的差异。结果RT-PCR和细胞免疫荧光结果显示转染组MMP-26 mRNA及蛋白均稳定高表达;MMP-26转染细胞在Matrigel的黏附和铺展速度大于对照组,其黏附率与对照组比较差异有显著性,P〈0.01;MMP-26转染组细胞在Boyden小室中的迁移速度和侵袭能力明显增强,与对照组比较差异有显著性（P〈0.05）。而MMP-26抗体对其有明显的抑制作用。结论MMP-26能有效的促进乳腺癌细胞在Matrigel上的粘附、迁移和侵袭能力,其可能在乳腺癌的早期侵袭中发挥重要作用。     

NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬耐药中的作用及调控机制

目的探讨NKX2-5在乳腺癌患者他莫昔芬(TAM)耐药中的作用及调控机制。方法采用免疫组化染色检测乳腺癌组织和癌旁组织NKX2-5的表达。利用高通量基因表达数据库(GEO)分析乳腺癌患者的相关资料及NKX2-5表达与乳腺癌患者生存率的关系。构建乳腺癌TAM耐药细胞株(MCF-7/TAM),采用CCK-8试剂盒检测不同浓度TAM处理后细胞增殖的变化,免疫印迹法检测细胞相关蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞NKX2-5 mRNA的表达。结果癌旁组织NKX2-5表达明显高于癌组织(P<0.05)。TAM敏感组织NKX2-5表达明显高于TAM耐药组织(P<0.05)。NKX2-5低表达组总生存率和无病生存率明显低于NKX2-5高表达组(P<0.05);在接受TAM治疗的乳腺癌患者中,NKX2-5低表达组总生存率明显低于NKX2-5高表达组(P<0.05)。与MCF-7细胞比较,MCF-7/TAM细胞NKX2-5蛋白表达明显降低(P<0.05)。采用瞬时转染技术将NKX2-5过表达质粒(Ad-NKX2-5)、空载质粒(Ad-NC)转染MCF-7/TAM细胞(Ad-NKX2-5组、Ad-NC组),NKX2-5小干扰RNA质粒(NKX2-5-siRNA)、空白对照(NC-siRNA)转染MCF-7细胞(NKX2-5-siRNA组、NC-siRNA组)。采用50、100μmol/L TAM处理后,Ad-NKX2-5组细胞增殖抑制率明显高于Ad-NC组(P<0.05),NKX2-5-siRNA组细胞增殖抑制率明显低于NC-siRNA组(P<0.05)。MCF-7/TAM细胞磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白表达明显高于MCF-7细胞(P<0.05)。Ad-NKX2-5组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显低于Ad-NC组(P<0.05),NKX2-5-siRNA组p-P38、p-JNK、p-ERK蛋白表达明显高于NC-siRNA组(P<0.05)。结论乳腺癌TAM耐药细胞中NKX2-5表达下调。上调NKX2-5表达或许能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路逆转MCF-7细胞TAM耐药。