MDPC-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的：研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用，从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制。方法：培养MDPC-23细胞，通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响，实验数据采用单因素方差分析。结果：当Smad7启动子(-408bp至 112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时，其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加，而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)对其活性无明显影响。单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响。Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性，而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用。过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用。结论：在成牙本质细胞系MDPC-23内，TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录。     

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的：研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）基因表达中的调控作用。方法：PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体，通过瞬时转染入MDPC-23细胞后，检测报告基因活性。结果：在TGF-β1的作用下，Smad3可以发生转位表达，由细胞浆转入细胞核内。同时，过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控；在DSPP启动子-2525-＋54bp之间，存在TGF-β1／Smad3信号途径的结合位点，从而发挥对DSPP基因的调控作用。     

MDPG-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用,从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制.方法培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响,实验数据采用单因素方差分析.结果当Smad7启动子(-408 bp至+112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时,其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加,而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对其活性无明显影响.单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响.Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性,而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用.过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录.     

Cbfa1在Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因转录过程中的作用

目的：研究转录因子核心结合因子a1（Cbfa1）在Smad3分子调控牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达中的作用。方法：培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Cbfa1对TGF-β1调控目的基因dspp转录的影响。结果：Cbfa1可以抑制DSPP启动子的活性,TGF-β1可以降低Cbfa1对DSPP的抑制作用,当Cbfa1与Smad3共同作用于DSPP启动子时,对DSPP转录活性的抑制作用更强。Cbfa1的两个亚型Osf2和PEBP2αA在DSPP转录调控过程中可能发挥的功能不完全一致。结论：转录因子Cbfa1可以与Smad3共同作用,调控DSPP基因启动子的转录表达。     

MDPC-23细胞内核心结合因子A1增强Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因的表达

目的 :研究转录因子核心结合因子A1(CBFA1)在Smad分子调控牙本质涎磷蛋白 (DSPP)基因表达中的作用。方法 :细胞培养 ,基因转染和报告基因检测。结果 :转化生长因子 β1(TGF β1)抑制DSPP基因启动子活性的表达。Smad3过表达显著增强了TGF β1对DSPP基因表达的转录抑制。单独过表达CBFA1对DSPP基因启动子活性无明显影响。但是 ,CBFA1与Smad3共转染显著增强Smad3对DSPP基因启动子的抑制作用 ,在TGF β1存在时 ,其作用进一步增强。结论 :在成牙本质细胞系MDPC 2 3内 ,CBFA1可能作为一种转录因子协同调控Smad3对DSPP基因转录的调控。     

Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23中的表达及功能

目的研究Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23作为转化生长因子(TGF)β信号分子的作用。方法常规条件下培养MDPC-23细胞,在TGF-β1刺激培养1h后,观察细胞内Smad分子的定位变化。将Smads真核表达载体分别与报告基因载体p3TP-Lux瞬时共转染至MDPC-23,在TGF-β1刺激培养24h后,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。结果MDPC-23细胞表达Smad2和Smad3蛋白分子,主要定位于细胞质,在TGF-β1刺激1h后,Smad2和Smad3从胞质向胞核转位聚集。TGF-β1可诱导p3TP-Lux基础启动子活性,约增加13倍。过表达野生型Smad3蛋白可促进TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,但是过表达Smad3突变体抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导。和Smad3作用相比,过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1诱导p3TP-Lux启动子活性无明显影响。结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad信号途径存在并参与介导TGF-β1诱导的转录调控。     

TGF-β1调控小鼠成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的：探讨TGF-β1对Amelotin基因表达的影响及作用机制。方法：通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对釉成熟蛋白（Amelotin）基因表达的影响;利用TGFBR1小RNA干扰（siRNA）技术阻断TGF-β受体I（TGFBR1）表达,或在成釉细胞中过表达活化型TGF-β受体I（T204D）,观察Amelotin基因表达的改变;利用双荧光素酶基因报告系统观察TGF-β1和T204D对成釉细胞Amelotin启动子转录活性的调控作用。结果：TGF-β1刺激成釉细胞后,Amelotin基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使TGFBR1基因沉默,实时定量RT-PCR显示TGF-β1调控Amelotin基因表达的作用减弱,而pCDNA3.1-T204D转染成釉细胞促进了Amelotin基因表达。将pGL3-Amelotin启动子转染成釉细胞,并用TGF-β1刺激成釉细胞,Amelotin启动子的转录活性明显增强。TGFBR1小RNA干扰阻断了TGF-β1诱导的Amelotin启动子转录活性,而将pGL3-Amelotin与T204D共转染成釉细胞后,促进了Amelotin启动子的转录活性。结论：在牙釉质发育过程中,TGF-β1和活化型TGFBR1信号通路调控成釉细胞Amelotin基因表达。     

Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白启动子片段的调控

目的：在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析DSPP启动子活性,了解TGF-1的信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因启动子片段的调控作用。方法：瞬时转染和报告基因检测。结果：TGF-β1可以下调pGL3LUC-Pdspp-410～-176bp和pGL3LUC-Pdspp-410～＋54bp的活性,Smad3可以加强这种下调作用;它们对pGL3LUC-Pdspp-195～＋54bp的调控作用不明显。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控;在DSPP启动子-410～-176bp之间,存在着其它的启动元件,促使其启动活性。在DSPP启动子-195～＋54bp区域内,存在DSPP抑制子元件,发挥负调节作用,导致启动活性下降或丧失。     

Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子β信号转导中的作用

目的研究Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β)信号转导的作用.方法培养MDPC-23细胞,免疫组化法观察TGF-β1对MDPC-23细胞内Smad7分子定位改变.通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad7分子对TGF-β1调控目的基因转录的影响.结果MDPC-23细胞表达Smad7蛋白,主要定位于细胞胞浆,在转化生长因子β1刺激30 min后,Smad7从胞核向胞浆转位聚集.TGF-β1显著诱导p3TP-Lux基础启动子活性.过表达Smad7完全抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,而过表达Smad7反义cDNA载体则显著促进了TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad7可能作为一种抑制性Smad分子在拮抗TGF-β1信号转导过程中发挥重要的作用.     

TGF-β1调控成釉细胞ODAM基因表达的研究

目的:探讨TGF-β1对ODAM基因表达的作用。方法:通过实时定量RT-PCR法观察TGF-β1对成釉细胞ODAM基因表达的影响;利用c-jun小RNA干扰(siRNA)技术,阻断转录因子c-jun基因表达,观察c-jun基因沉默对TGF-β1诱导ODAM基因表达的影响;利用双荧光素酶基因报告系统研究成釉细胞中TGF-β1对ODAM启动子转录活性的调控作用。结果:TGF-β1刺激成釉细胞后,ODAM基因表达显著增强;利用小RNA干扰技术使c-jun基因沉默,实时定量RT-PCR法研究显示,TGF-β1调控ODAM基因表达的作用减弱。将pGL3-ODAM转染成釉细胞后,用TGF-β1刺激成釉细胞一定时间,ODAM启动子的转录活性增强。c-jun基因沉默抑制了TGF-β1对ODAM启动子的激活作用。结论:在釉质发育过程中,TGF-β1通过转录因子c-jun调控成釉细胞ODAM基因表达。     

转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用

目的 研究成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因转录调控中的作用, 探索成牙本质细胞内DSPP基因表达的调控机制。方法 细胞免疫组化观察MDPC-23细胞内c-Jun和c-Fos蛋白分子的表达。瞬时转染和报告基因检测c-Jun和c-Fos在DSPP基因转录中的作用。结果 MDPC-23细胞表达c-Jun和c-Fos蛋白,c-Jun和c-Fos主要分布在MDPC-23细胞胞核。c-Jun或c-Fos过表达均显著抑制DSPP基因启动子活性。结论 证实成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos参与下调DSPP基因表达。     

Smad3在转化生长因子β1调控人牙本质基质蛋白1基因表达中的作用

目的：观察Smad3在转化生长因子β1（TGF-β1）调控人牙本质基质蛋白1（DMP1）转录表达中的作用并对DMP1基因启动子上的结合位点进行初步定位。方法：将Smad3瞬时转染至具有矿化活性的人牙髓干细胞（HDPSC）中,观察Smad3蛋白表达和转位情况,并检测在有无TGF-β1的刺激下细胞中pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的变化。pGL3-P-505～＋86与Smad3共转染至细胞中,10ng/ml TGF-β1刺激2h后,提取细胞核蛋白,EMSA法检测DMP1基因启动子-505～-193bp区存在的Smad3结合位点。结果：HDPSC中瞬时转染Smad3后,其主要表达于细胞胞浆中,随着TGF-β1刺激不同时间后,Smad3在细胞中的表达出现从胞浆到胞核的转位。Smad3可明显加强TGF-β1下调pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的作用,在DMP1基因启动子-505～-193bp区至少有一个Smad3结合区域为-209～-201bp区的GTCTAGTCA序列。结论：Smad3是TGF-β1信号通路的下游作用分子,可介导TGF-β1下调D...     

Smad分子在骨形成蛋白2调控成牙本质细胞Ⅰ型胶原基因表达中的作用

目的　研究Smad蛋白在骨形成蛋白 2 (bonemorphogeneticprotein 2 ,BMP 2 )调控小鼠成牙本质细胞系MDPC 2 3内Ⅰ型胶原α2链 [collagenα2 (Ⅰ ) ,COL1A2 ]表达中的作用。方法　细胞免疫组化观察MDPC 2 3细胞内BMP 2细胞内信号分子Smad1、Smad5和Smad6的表达。瞬时转染和报告基因检测观察Smad1、Smad5和Smad6在BMP 2调控COL1A2基因转录中的作用。结果　MDPC 2 3细胞表达Smad1、Smad5和Smad6。BMP 2能诱导含COL1A2基因启动子的荧光素酶报告基因活性。Smad1或Smad5过表达增强BMP 2诱导的COLIA2基因启动子活性 ,而Smad6过表达抑制BMP 2诱导的COL1A2基因启动子活性。过表达Smad1或Smad5突变型载体可以阻断BMP 2的诱导能力。结论　在MDPC 2 3细胞内 ,Smad信号途径存在并发挥功能 ,参与调控BMP 2对COL1A2基因的转录。Smad信号途径可能在BMP 2调控成牙本质细胞分化和牙本质形成过程中发挥重要作用     

Runx2介导TGF-β1调控成釉细胞MMP20基因表达的研究

目的:研究Runx2在TGF-β1调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloprotei-nase 20,MMP20)基因表达中的作用。方法:首先利用双荧光素酶基因报告系统分析TGF-β1对MMP20基因启动子转录活性的影响;然后利用染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)方法观察Runx2与MMP20特异性结合位点之间的相互作用,并利用基因定点突变和双荧光素酶基因报告系统分析Runx2对MMP20基因启动子转录活性的影响;最后运用小RNA干扰技术使Runx2基因沉默,实时定量RT-PCR技术观察TGF-β1诱导MMP20基因表达的改变。结果:TGF-β1刺激成釉细胞后,MMP20启动子在-87～+23区域转录活性无明显变化外,其他各区域转录活性均增强。利用ChIP研究发现Runx2与MMP20基因核心启动子的特征性序列"TGTGGG"相互作用;将该特征性序列由"TGTGGG"突变为"TGTAAG"后,利用双荧光素酶基因报告系统发现Runx2对MMP20基因启动子转录活性的影响减弱;利用小RNA干扰技术使Runx2基因沉默后,TGF-β1上调MMP20基因表达的作用减弱。结论:TGF-β1通过转录因子Runx2调控成釉细胞MMP20的表达。     

转化生长因子β1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的影响

目的：观察具有矿化活性的人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，HDPSC）在重组人转录生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作用下对牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1，Dmp1）表达和Dmp1基因启动子转录活性的影响。方法：通过建立体外培养的HDPSC矿化诱导模型，经10ng／L重组人TGF-β1刺激后，运用RT-PCR、报告基因检测等方法检测细胞在TGF-β1作用后Dmpl mRNA表达变化以及对pGL3-P-193-＋86和pGL3-P505-＋86 2个启动子片段重组报告基因载体活性的影响。结果：诱导矿化后具有部分成牙本质细胞样细胞特征的HDPSC经TGF-β1刺激后，Dmp1 mRNA的表达水平明显下降，并存在时间依赖性。pGL3-P-193-＋86和pGL3-P-505-＋86相对荧光素酶活性均下降，以pGL3-P-505-＋86活性下降更明显，说明TGF-β1具有下调HDPSC Dmp1转录活性的作用。计算机分析结果发现，Dmp1基因启动子-505～＋86bp区存在多个TGF-β1下游作用分子Smads的结合位点。结论：TGF-β1可下调Dmpl mRNA的表达水平和转录活性，以pGL3-P-505-＋86活性下降更明显。启动子-505—-193bp区存在TGF-β1下游作用分子或转录因子的结合位点，从而参与下调Dmp1转录表达过程。     

Runx2介导TGF-β1调控成釉细胞MMP20基因表达的研究

首先利用双荧光素酶基因报告系统分析TGF-β1对MMP20基因启动子转录活性的影响;然后利用染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)方法观察Runx2与MMP20特异性结合位点之间的相互作用,并利用基因定点突变和双荧光素酶基因报告系统分析Runx2对MMP20基因启动子转录活性的影响;最后运用小RNA干扰技术使Runx2基因沉默,实时定量RT-PCR技术观察TGF-β1诱导MMP20基因表达的改变。结果:TGF-β1刺激成釉细胞后,MMP20启动子在-87～+23区域转录活性无明显变化外,其他各区域转录活性均增强。     

不同细胞类型对cbf α1调控DSPP基因转录的影响

观察核心结合因子α1（core binding factor α1,cbf α1）对不同细胞中牙本质涎磷蛋（dentin sialophosphopmtein,DSPP）基因转录调控的影响。方法：选择Hela和小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞;DSPP基因上游2.6kb片段为启动子。采用瞬时转染、报告基因等方法观察在两种细胞中,cbfα1对DSPP基因启动子启动活性的影响。结果：在MDPC-23及Hela细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3-cbfα1共转染组荧光素酶的表达量均小于pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3共转染组（P〈0.01）：在MDPC-23细胞中变化更为明显。结论：cbfα1对DSPP基因的转录调控作用受细胞类型的影响。     

ClC-3氯通道参与TGF-β通路调控PTH的促成骨分化作用机制研究

目的：：初步探究电压门控氯通道3(ClC-3)在甲状旁腺激素(PTH)调节成骨分化过程中的作用机制。方法：采用基因转染的方法,分别用特异性siRNA调节成骨细胞MC3T3-E1中转化生长因子β1(TGF-β1)及ClC-3基因的表达水平,采用实时定量RT-PCR检测ClC-3、TGF-β1及碱性磷酸酶(ALP)、骨唾液蛋白(BSP)、骨钙素(OC)、核心结合蛋白因子2(Runx2)等成骨相关因子的基因表达情况,并用Western blot及免疫荧光方法检测CLC-3和TGF-β1蛋白的表达情况。结果：在PTH间断刺激下,成骨细胞中仅干扰TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅干扰ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平升高。同样在PTH间断刺激下,在分别干扰ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成骨相关基因表达水平较对照组明显降低(P<0.05);然而共同干扰两者之后成骨相关基因表达较对照组无明显差异(P>0.05)。结论：ClC-3氯通道通过TGF-β通路参与介导了PTH在成骨细胞中促进成骨细胞分化的作用。     

辐照对MC3T3-E1细胞TGF-β1和Smads基因及蛋白表达的影响

目的:探讨放射线对成骨细胞系MC3T3-E1细胞增殖及TGF-β1和Smad3/P-Smad3表达的影响。方法:以小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,4MV直线加速器为放射源,给予单一剂量8Gy照射。照射后以CCK-8检测成骨细胞增殖情况,通过荧光定量PCR和Western免疫印迹分别检测TGF-β1、Smad3基因和蛋白的表达,并分别用2-ΔΔct法及光密度分析法分析基因及蛋白的表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:单次8Gy剂量照射的细胞组与对照组相比,生长速度明显减慢;Smad3及TGF-β1基因在照射后0.5 h,1 h组与对照组无显著差异(P>0.05),照射后1.5 h组Smad3及TGF-β1基因表达量与对照组存在显著差异(P<0.05);P-Smad3、TGF-β1蛋白表达在第1天明显上调;第3天、第5天照射组与对照组差异逐渐减小。8Gy照射后第1天,P-Smad3蛋白表达量最高,TGF-β1蛋白表达量第3天最高。结论:8Gy照射剂量可抑制MC3T3-E1细胞增殖,短时间内上调TGF-β1和Smad3/P-Smad3在基因及蛋白水平的表达。     

Cx43通过Erk1/2促进BMP-2诱导的人牙髓细胞成牙本质分化

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)-2和连接蛋白(Cx) 43在促进人牙髓细胞(hDPCs)成牙本质分化过程中的联系。方法:在hDPCs中过表达Cx43并施以300 ng/m L BMP-2刺激1 h,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光(IF)检测成牙本质分化标记物的表达变化;检测BMP-2介导的Smad1/5/9和Erk1/2通路活性,并施加PD98059(Erk1/2抑制剂)刺激1 h,检测抑制Erk1/2后过表达Cx43对BMP-2诱导的DSPP等的表达变化影响。结果:BMP-2上调hDPCs内osterix、DSPP、DMP-1、ALP和OCN RNA水平以及osterix蛋白表达,增强hDPCs中DSPP的荧光强度。过表达Cx43明显促进BMP-2诱导的hDPCs成牙本质分化。BMP-2激活hDPCs中的Smad1/5/9通路,过表达Cx43上调hDPCs中Erk1/2磷酸化水平。抑制Erk1/2明显减弱过表达Cx43对BMP-2诱导的osterix、DSPP、DMP-1、ALP、OCN mRNA表达以及osterix蛋白水平和DSPP染色强度的增强作用。结论...