microRNA-616在肝细胞癌侵袭转移中的作用机制研究

目的探讨microRNA-616（miR-616）在肝细胞癌（HCC）中的表达及其在HCC侵袭转移中的作用机制。方法通过qRT-PCR检测miR-616在60例HCC及癌旁组织中的表达,同时检测miR-616在不同肝癌细胞系中的表达情况;免疫组织化学染色检测miR-616在HCC及癌旁组织中波形蛋白（vimentin）、上皮型钙黏素（E-cadherin）及同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）的表达情况;qRT-PCR检测miR-616在人正常永生化肝细胞（LO2）及5种不同肝癌细胞系（HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Hu7）中的表达水平;使用miR-616抑制物作用Hep3B细胞,TranswellTM实验检测miR-616抑制后Hep3B细胞侵袭能力变化;应用miR-616抑制物及PTENsiRNA转染Hep3B细胞,qRT-PCR检测Hep3B中miR-616、vimentin、PTEN、E-cadherin的mRNA水平,Westernblot法检测癌细胞中vimentin、PTEN、E-cadherin的蛋白水平。结果miR-616在HCC组织中表达水平高于对应癌旁组织;miR-616在不同肝癌细胞系中表达均高于LO2细胞;miR-616高表达与低表达在血管侵犯、Edmonson-Steiner分级、TNM分期比较差异均有统计学意义(均P＜0.05);miR-616高表达肝癌组PTEN及E-cadherin水平低于miR-616低表达肝癌组,而vimentin水平高于miR-616低表达肝癌组,相关性分析结果显示HCC组织中miR-616与E-cadherin、PTEN水平呈负相关,与vimentin水平呈正相关;在肝癌细胞中抑制miR-616后PTEN及E-cadherin表达水平上调,而vimentin表达降低,Hep3B细胞的侵袭能力明显降低。结论miR-616在HCC组织中表达上调,其表达与HCC恶性临床病理特征有关,miR-616促进肝癌细胞侵袭转移的作用可能与其抑制PTEN表达及诱导上皮间质转化有关。     

长链非编码RNA HCG18对肝癌细胞生物学活性的影响

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)人类白细胞抗原复合体(HCG18)在肝癌细胞中的表达及作用。方法选取23对来自郑州大学第一附属医院的肝癌、癌旁组织和购自中国科学院细胞库的人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H和正常肝细胞LO2作为研究对象。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝癌和癌旁组织及肝癌细胞系和正常肝细胞中HCG18的表达。采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默MHCC97H和Hep3B细胞中HCG18的表达,同时分别设置阴性对照组,采用si-NC对其进行转染。采用克隆实验、Transwell体外迁移实验、流式细胞周期和凋亡实验检测细胞增殖能力、侵袭能力、细胞周期和凋亡率。结果肝癌组织中HCG18表达量较癌旁组织高,差异有统计学意义(P<0.001),肝癌细胞系Hep3B、MHCC97H中HCG18表达量均较正常肝细胞LO2高,差异有统计学意义(均P<0.01)。转染HCG18 siRNA后,肝癌细胞MHCC97H和Hep3B的增殖、侵袭能力均低于转染si-NC的阴性对照组。HCG18 siRNA转染的MHCC97H和Hep3B细胞被阻滞在G_0/G_1期,凋亡率高于转染si-NC的阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 HCG18在肝癌细胞中高表达,其可促进肝癌细胞的增殖和侵袭,有望成为肝癌治疗的新靶点。     

慢病毒介导的FHIT基因过表达调控人肝癌细胞株生长实验研究

［摘要］目的　探讨过表达FHIT基因对FHIT基因含量不一致的人肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7的增殖、凋亡和细胞侵袭以及细胞周期的影响,以期证实FHIT基因在肝癌细胞株的表达差异与肝癌细胞的分化有密切相关性．方法　体外成功构建pLVX-IRES-FHIT慢病毒重组载体转染FHIT基因含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7,以MTT法、FCM法、Annexin V/PI双染色法、细胞周期检测技术和Transwell侵袭实验分析过表达的FHIT基因对三系肝癌细胞的增殖活性、凋亡、细胞侵袭性和细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系．结果　体外成功构建重组慢病毒载体pLVX-IRES-FHIT转染FHIT含量不一致的肝癌细胞株HepG2、Hep3B 和 Huh7．（1）MTT法检测显示三系肝癌细胞株的pLVX-IRES-FHIT组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显著,在48 h达到高峰,此后到72 h进入平台期,对照组细胞增殖抑制不明显（P＜0.05）．AnnexinV/PI双染色法检测发现pLVX-IRES-FHIT组三系肝癌细胞48 h凋亡率较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）．三系肝癌细胞中对pLVX-IRES-FHIT组转染致FHIT基因过表达抑制增殖活性大小的顺序依次是HepG2＞Hep3B＞Huh7;（2）经过Transwell侵袭实验表明对FHIT基因过表达对三系肝癌细胞的pLVX-IRES-FHIT组侵袭性均有明显的抑制作用（P＜0.05）,而对照组未见明显差异（P＞0.05）．三系肝癌细胞的侵袭性顺序依次为HepG2＞Hep3B＞Huh7;（3）细胞周期检测发现pLVX-IRES-FHIT组G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,增殖指数减低,在HepG2细胞中与对照组间有统计学意义（P＜0.05）,在HepB和Huh7细胞中与对照组间无统计学意义（P＞0.05）．FHIT基因的过表达对三系肝癌细胞的细胞周期影响为细胞周期停滞于S期,且G0/G1期细胞增多的顺序依次是HepG2＜Hep3B＜Huh7．结论　FHIT基因在肝癌细胞株中的表达差异可能与肝癌细胞的恶性分化有密切正相关性,FHIT基因有可能成为原发性肝癌的基因治疗的基因靶标之一．     

FAM83B对肝癌细胞的作用及机制研究

目的 探讨具有序列相似性的家族83成员B(FAM83B)对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）、Western blotting、免疫组织化学法检测肝癌组织、癌旁正常组织、人类肝癌细胞系（HepG2、Hep3B）、正常人类肝细胞系（LO2）中FAM83B mRNA和蛋白的表达。采用靶向siRNA敲低HepG2细胞系中FAM83B作为si-FAM83B组,HepG2细胞转染si-NC慢病毒载体作为siNC组。分别用PBS、40 ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理si-FAM83B组细胞48 h,并将细胞分为siFAM83B+PBS组和si-FAM83B+IGF-1组,分析敲低FAM83B对肝癌细胞增殖、侵袭、细胞周期和凋亡的影响,并研究敲低FAM83B对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素哺乳动物靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号通路的影响。结果 肝癌组织FAM83B m RNA和蛋白相对表达量高于癌旁正常组织（P <0.05）。HepG2、Hep3B细胞FAM83B mRNA和蛋白相对表达量高于LO2细...     

lncRNA SH3BP5-AS1在肝癌中的差异表达及促进肝癌发生机制

目的 探究lncRNA SH3BP5-AS1在肝癌中的差异表达及促进肝癌发生的可能机制。方法 qRT-PCR法检测SH3BP5-AS1在肝癌组织/癌旁组织(n=91)中表达;TCGA数据库可视化软件UALCAN分析SH3BP5-AS1在大样本肝癌组织(n=371)中表达;qRT-PCR检测SH3BP5-AS1在正常肝细胞THLE-2和肝癌细胞系Huh 7、BEL-7405、SNU-387、Hep 3B中表达。siRNA技术沉默SH3BP5-AS1表达后,CCK-8法、细胞克隆形成实验、Edu法检测沉默SH3BP5-AS1对Hep 3B细胞增殖的影响,流式检测沉默SH3BP5-AS1对Hep 3B细胞凋亡、周期的影响。基于肝癌组织中SH3BP5-AS1和TM6SF2表达量,统计并分析表达相关性。结果 SH3BP5-AS1在肝癌组织中高表达;SH3BP5-AS1在TCGA数据库中大样本肝癌组织中高表达;SH3BP5-AS1在不同肝癌细胞系Huh 7、BEL-7405、SNU-387和Hep 3B中均不同程度高表达。siRNA沉默SH3BP5-AS1抑制Hep 3B细胞的增殖能力,促进细胞凋...     

泛素特异性蛋白酶18在肝癌细胞中的表达及其对生物学活性的影响研究

目的 检测泛素特异性蛋白酶18（USP18）在肝癌细胞中的表达及其对生物学活性（细胞增殖、细胞克隆、细胞周期、细胞凋亡）的影响。方法 2013年7月—2014年7月选取5种肝癌细胞株（Hep G2、Hep G2.2.15、Hep 3B、Huh-7、SMMC-7721）,采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western blotting法分别检测USP18 mRNA和USP18表达水平,选择表达活性最强的细胞株进行小干扰RNA（siRNA）转染。利用LipofectamineTM 2000法将USP18 siRNA转染肝癌细胞,分为正常组、阴性对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组。采用RT-PCR和Western blotting法检测干扰效率,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验检测克隆形成率,流式细胞术检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 5种肝癌细胞株中USP18 mRNA和USP18表达水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中Hep 3B肝癌细胞株中USP18 mRNA和USP18表达水平高于其他4种肝癌细胞株（P＜0.05）,故选取Hep 3B肝癌细胞株进行后续实验。Hep 3B肝癌细胞株转染USP18 siRNA后48 h,转染效率达（91.00±5.67）%。5组干扰效率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组干扰效率高于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。转染后1、2、3 d,siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组吸光度低于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组克隆形成率低于正常组和阴性对照组,细胞凋亡率高于正常组和阴性对照组（P＜0.05）。5组细胞周期分布比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组与阴性对照组吸光度、克隆形成率、细胞周期分布、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 USP18在Hep 3B肝癌细胞株中的表达较高,USP18基因敲减可以抑制肝癌细胞增殖、减少细胞克隆、阻滞细胞周期进程,增加细胞凋亡。     

RECQL基因沉默对HCC细胞株体外增殖的抑制作用

目的观察RECQL基因沉默表达对人肝细胞癌(humanhepatocelullarcarcinoma,HCC)细胞株体外增殖的影响,探讨RECQL作为肝癌治疗潜在靶向基因的可能性。方法以BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B、SNU-761HCC细胞为研究对象,采用Westernblot和免疫组化法观察解旋酶RECQL蛋白的表达情况,通过RNA干扰技术抑制RECQL表达,测定HCC细胞和正常肝细胞（THLE-2细胞）的存活率和死亡率,并采用Westernblot法分析凋亡相关蛋白的变化,FACS法检测细胞周期分布。结果RECQL蛋白在BEL7404、SK-HEP-1、Hep3B中为阳性表达,SNU-761中为阴性表达。RECQL-siRNA在阳性表达组中抑制HCC细胞的增殖,引起细胞存活率降低和死亡率增加（均P＜0.01）,但对阴性表达组和THLE-2细胞存活率和死亡率无影响（均P＞0.05）。RECQL-siRNA处理的SK-HEP-1细胞中,剪切型凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3和cleavedPARP的表达变化不大,而G2/M期细胞的比例明显增加（P＜0.05或0.01）。结论RECQL基因沉默表达可以抑制HCC细胞的增殖,且这种抑制作用依赖于RECQL的高表达,并对正常肝细胞无影响,其可能机制是阻滞细胞G2/M期,可以作为治疗肝癌的潜在靶向基因。     

亚砷酸钠抑制肝癌细胞增殖与PML蛋白表达

目的：研究亚砷酸钠抑制肝癌（HCC）细胞增殖是否与早幼粒细胞白血病（PML）蛋白表达有关。方法免疫组织化学法、免疫荧光、蛋白免疫印迹法（Western blot）和荧光定量PCR检测HCC组织PML蛋白及基因表达。结果免疫组织化学分析显示随机选择15例高分化、中度分化和低分化HCC组织和细胞均不同程度表达PML蛋白。Western blot 分析发现24例HCC组织、HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721和 L02细胞均表达 PML 蛋白。免疫荧光提示 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721细胞核均有PML蛋白颗粒,其中 HuH7和 Hep3B细胞表达PML蛋白较 HepG2、SMMC‐7721细胞多。24例 HCC组织, Hep3B、HepG2、SMCC‐7721和HuH7细胞都表达PML基因。亚砷酸钠不仅可下调HuH7和原代 HCC细胞表达PML蛋白,而且亚砷酸钠抑制HuH7,HepG2,Hep3B和SMMC‐7721细胞生长,随着暴露时间延长亚砷酸钠对HCC细胞抑制作用增强。结论HCC 组织和细胞系普遍表达PML 基因和蛋白,PML 蛋白可能是砷剂直接靶向作用的分子基础。     

lncRNANEAT1与miR-342-3p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨长链非编码RNA（lncRNA）核富集转录本1（NEAT1）在肝细胞癌（HCC）组织和细胞株中的表达及临床意义，并验证NEAT1与miR-342-3p对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。方法收集2013年6月至2014年10月南京医科大学附属淮安第一医院接受手术的90例患者HCC组织和癌旁组织。采用qRT-PCR检测组织中NEAT1和miR-342-3p的表达，分析HCC组织中NEAT1的相对表达水平与患者临床病理参数、生存率以及预后的相关性。qRT-PCR检测HCC细胞株Hep3B、Huh7、HepG2和HCCLM3以及正常肝细胞株（LO2）中NEAT1的表达，Transwell实验检测HCC细胞迁移和侵袭能力，双荧光素酶报告实验验证NEAT1与miR-342-3p之间的调控关系。生存率差异比较采用log-rank检验，不良预后的危险因素分析采用Cox比例风险模型。结果NEAT1在HCC组织中的相对表达水平升高，并与肿瘤淋巴结转移及TNM分期密切相关，miR-342-3p在HCC组织中的表达较癌旁组织下调（P＜0.05）；根据NEAT1中位水平分为高表达NEAT1和低表达NEAT1，在TNMⅠ期、TNMⅡ期以及TNMⅠ～Ⅳ期HCC患者中，高表达NEAT1患者总体生存率较低表达NEAT1患者显著降低，NEAT1的表达水平是HCC患者预后较差的独立危险因素。NEAT1在HCC细胞株中较LO2细胞株表达升高（P＜0.05），下调NEAT1的表达能够抑制HepG2细胞的迁移和侵袭能力（均P＜0.05）。双荧光素酶报告实验表明NEAT1能够通过竞争性内源RNA机制调控miR-342-3p。Transwell实验表明下调miR-342-3p能够逆转NEAT1沉默介导的HCC细胞迁移和侵袭的抑制作用（均P＜0.05）。结论NEAT1的高表达与HCC患者的恶性程度以及不良预后密切相关，其能够调控miR-342-3p诱导HCC细胞的迁移和侵袭。     

PKM2抑制Hippo信号通路促进肝癌细胞增殖和侵袭迁移能力

目的：探讨PKM2对肝癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响及其机制。方法：定量PCR、Western blot和免疫组化检测肝癌组织及肝癌细胞系（HepG2、Hep3B、Huh7和SMMC?7721）PKM2的表达;采用小干扰RNA（siRNA）抑制肝癌细胞PKM2表达,分析其对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,并研究PKM2 siRNA对Hippo信号通路的影响。结果：定量PCR、Western blot和免疫组化显示PKM2在肝癌组织表达较癌旁组织表达明显升高,在肝癌细胞较肝细胞（L02）中表达明显升高;PKM2 siRNA可有效抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移,进一步证实肝癌细胞中Hippo信号通路被抑制,PKM2 siRNA可有效提高Hippo信号通路活性,且抑制Hippo信号活性能明显逆转PKM2 siRNA抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。结论：PKM2可能通过抑制LATS1和YAP磷酸化,进而抑制Hippo信号通路,促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

气血与足月妊娠分娩关系的探讨

论述足月妊娠分娩的发动和维持依靠气的推动、温煦、气化、固摄功能和血的营养、濡润功能。顺利分娩既要气血充足，还要气顺血和。临床研究结果表明调补气血，是促进产程，预防难产的重要手段。实验研究结果阐明调补气血中药加强产力、促进产程主要是从改善产妇全身情况，提高机体抗应激、抗疲劳、耐缺氧能力，即所谓使产妇气血充足调和，充分发挥气血在分娩过程中的生理作用。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。