miR-296抑制自噬促进角膜新生血管生成

目的 本研究探讨miR-296在角膜新生血管生成中的作用以及其对自噬蛋白LC3B-Ⅰ/Ⅱ、p62的调控作用。方法 利用血管内皮生长因子诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立体外角膜新生血管模型。实验分为6组(Control组、模型组、VEGF+miR-296 mimic NC组、VEGF+miR-296 mimic组、VEGF+miR-296 inhibitor NC组、VEGF+miR-296 inhibitor组)。采用RT-qPCR检测miR-296在体外新生血管中的表达;转染过表达或者低表达miR-296,采用CCK-8、划痕实验、成管实验探究miR-296在体外角膜新生血管生成中的作用;采用KEGG和GO分析预测miR-296参与的通路及其靶基因的作用;采用Western blot检测miR-296对自噬蛋白LC3B-Ⅰ/Ⅱ、p62表达的影响。结果 RT-qPCR结果显示,与Control组相比,模型组中miR-296表达升高[(2.84±0.23)比(1.32±0.04),t=6.42,P<0.01];与VEGF+miR-296 mimic NC组相比,VEGF+m...     

晚期氧化蛋白产物调节人肾小管上皮细胞自噬的研究

目的 探讨晚期氧化蛋白产物(AOPPs)对人肾小管上皮细胞(HK-2)自噬的影响.方法 AOPPs刺激HK-2细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和p62的表达;Western blot检测p38 MAPK通路的激活;加入p38 MAPK抑制剂(SB203580)与AOPPs共处理,观察自噬的改变,加入自噬诱导剂雷帕霉素与AOPPs共处理,并用RT-qPCR和Western blot检测细胞周期抑制蛋白p27的表达,用BCA法检测细胞总蛋白,观察细胞肥大的改变.结果 AOPPs下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1,上调p62的表达,并激活p38 MAPK通路;与AOPPs单独处理组相比,SB203580与AOPPs共处理组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin升高而p62降低;雷帕霉素与AOPPs共处理组p27的表达和细胞总蛋白下调.结论 AOPPs通过激活p38 MAPK通路抑制HK-2细胞自噬,自噬抑制参与HK-2细胞肥大.     

tRF-013354介导阿霉素诱导的足细胞损伤的机制研究

目的:探究tRNA衍生片段013354(tRF-013354)在阿霉素(ADR)诱导的足细胞损伤中的作用及相关机制。方法:用ADR诱导足细胞损伤模型,tRF-013354 mimic和tRF-013354 NC-mimic分别转染足细胞,Real-time PCR(RT-PCR)验证转染效率,CCK-8检测足细胞存活率,免疫荧光检测足细胞损伤标志物Nephrin、Podocin的定位和表达水平,Western blot检测Nephrin、Podocin和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白非磷酸化β-catenin、Wnt1的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达;用Wnt信号拮抗剂Dickkopf-1(DKK1)阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot检测非磷酸化β-catenin和Nephrin、Podocin的蛋白表达水平,RT-PCR检测tRF-013354的表达。结果:1μg/mL ADR干预足细胞24 h,可成功构建ADR诱导足细胞损伤模型,Wnt/β-catenin信号通路被激活,tRF-013354下调(P<0.05...     

miR-486-5p/PINK1通路调控线粒体自噬拮抗SK-N-SH细胞氧糖剥夺/复糖复氧损伤

目的 探究微RNA-486-5p/PTEN诱导激酶1(miR-486-5p/PINK1)通路调控线粒体自噬对SK-N-SH细胞糖氧剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的影响及机制。方法 实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测45例缺血性卒中(IS)患者和45例健康体检者血清miR-486-5p表达。双荧光素酶报告基因验证SK-N-SH细胞中miR-486-5p对PINK1的靶向关系。取对数生长期SK-N-SH细胞分为：Control、OGD/R、OGD/R+miR-486-5p mimic、OGD/R+miR-NC、OGD/R+miR-486-5p mimic+OE-NC、OGD/R+miR-486-5p mimic+OE-PINK1组。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,RT-qPCR检测miR-486-5p、PINK1、帕金蛋白(Parkin) mRNA表达,Western blot检测PINK1、Parkin、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、p62、Beclin1、半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9、细胞色素C(CytC)蛋白表达,流式细胞术...     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

姜黄素通过增强Rab7的表达促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流

目的:观察姜黄素(curcumin)对稳定表达APP695swe的Neuro-2a小鼠脑神经瘤细胞(N2a/APP695swe)中自噬流的作用;再进一步深入探讨其作用于N2a/APP695swe细胞中自噬流的可能机制.方法:首先将细胞分成4组:野生型对照组(WT组)、空白对照组(Control组)、溶剂对照组(Sham组)、姜黄素组(Curcumin组).透射电镜观察各组中自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ的表达;并分别运用Western blot及免疫荧光检测Rab7蛋白表达,实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测Rab7 mRNA表达.在N2a/APP695swe细胞中分别过表达及沉默Rab7后,将细胞分成5组:Control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Rab7组、NC-siRNA组和Rab7-siRNA组.再运用透射电镜观察各组自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ蛋白表达.结果:经姜黄素处理后,透射电镜观察到细胞中的自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,同时,自噬活性关键性蛋白LC3Ⅱ的表达增加(P=-0.000),而自噬底物蛋白p62的表达减少(P=0.000);Rab7在蛋白水平及mRNA水平均明显升高(P=0.000、0.000).过表达Rab7后,自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,p62蛋白表达明显减少(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.669).沉默Rab7后,自噬体主要为双层膜结构的早期自噬体形态,p62蛋白表达明显增加(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.622).结论:姜黄素促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流,其作用机制可能与增强Rab7表达有关.     

棕榈酸通过cGAS-STING-IRF3通路降低心肌细胞的自噬功能

目的 探究棕榈酸（PA）对心肌细胞自噬功能的影响及潜在机制。方法 提取大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）并体外培养24 h,分别加入 10%BSA 以及不同浓度的 PA（0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L）共培养 24 h。Western blotting 检测 NRCMs 中自噬指标（PINK1、Parkin、p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）以及cGAS、STING、p-IRF3/IRF3的蛋白表达水平。CCK8法检测细胞活性,筛选0.7 mmol/LPA用于后续实验。进一步将cGAS siRNA转染入NRCMs中以敲降cGAS的表达,将NRCMs细胞分为：空白对照组（Control组,无特殊处理）、阴性对照组（NC组,转染NC序列）、cGAS siRNA组（转染cGAS-siRNA敲降cGAS）、PA组（0.7 mmol/L PA处理24 h）、cGAS siRNA+PA组（转染cGAS-siRNA后予以0.7 mmol/L PA处理24 h）。Western blot检测NRCMs自噬相关蛋白指标表达变化,CCK8法检测细胞活性,免疫荧光检测p62和LC3阳性着色情况。结果 经不同浓度PA作用24 h后,NRCMs中PINK1、Parkin,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ+Ⅱ蛋白表达量明显降低（P<0.05）,p62蛋白表达量明显增高（P<0.05）,且心肌细胞活性明显下降（P<0.05）。将cGAS敲降后,可明显逆转PA诱导的NRCMs自噬功能降低,并改善心肌细胞活性（P<0.05）。结论 PA通过介导cGAS-STING-IRF3通路激活,抑制心肌细胞的自噬功能,导致细胞活性降低。     

Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

目的：探讨Tob1对肾上腺皮质癌细胞自噬的作用及其影响。方法：将体外培养的SW-13细胞分为对照组、空载质粒转染组以及pcDNA3.1-Tob1质粒转染组。实时荧光定量PCR检测各组细胞中Tob1的mRNA表达。Western blot检测Tob1以及自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin 1的表达。LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。随后在转染pcDNA3.1-Tob1质粒的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理,CCK-8检测细胞增殖,Tunel检测细胞凋亡。结果：pcDNA3.1-Tob1质粒转染显著上调SW-13细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达,提升LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1水平,降低p62蛋白表达,并显著提升细胞自噬水平(P<0.05)。与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组SW-13细胞增殖降低,细胞凋亡增加;与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖提升,细胞凋亡降低(P<0.05)。结论：Tob1能够通过激活细胞自噬降低人皮质癌细胞SW-13增殖并促进其凋亡。     

千金藤素对乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬降解的影响

目的 探讨千金藤素对乳腺癌细胞MDA-MB-231自噬的影响及其机制.方法 激光共聚焦显微镜观察千金藤素对转染了EGFP-LC3、tfLC3(mRFP-EGFP-LC3)质粒的MDA-MB-231细胞自噬体形成及自噬流变化的影响;Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、p62以及Beclin1的表达水平.激光共聚焦显微镜观察千金藤素、Bafilomycin A1、Rapamycin分别对转染了EGFP-LC3、tfLC3(mRFP-EGFP-LC3)质粒的MDA-MB-231细胞自噬体形成及自噬流变化的影响;Western blot检测溶酶体相关膜蛋白LAMP1、LAMP2的表达.结果 千金藤素处理后细胞中的自噬体(EGFP-LC3荧光团)数量明显多于对照组[(30.40 ±6.42)vs(5.00±2.12),P＜0.01],自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、p62的表达也呈量效和时效增多.转染ffLC3质粒后,千金藤素组和Bafilomycin A1组红绿荧光重叠呈现较多的黄色荧光团,而Rapamycin组出现较多的红色荧光团.千金藤素联用Bafilomycin A1并未进一步升高p62和LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平,但联用Rapamycin明显升高了LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平,同时,逆转了Rapamycin导致的p62蛋白表达水平减少.千金藤素既不影响对溶酶体的染色,也不减少LAMP1、LAMP2蛋白的表达水平,但影响了mRFP-LC3和mGFP-LAMP1的共定位.结论 千金藤素通过阻断自噬体与溶酶体的融合抑制MDA-MB-231细胞自噬体降解.     

lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病中的作用

目的 探究lncRNA MEG3调控mTOR介导的自噬在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)中的作用。方法构建C57BL/6 DCM小鼠模型,设置正常组和DCM组,心脏超声和Masson染色检测小鼠左心房功能结构变化。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测lncRNA MEG3在小鼠心肌组织中的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR表达量。分离C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞,高糖诱导心肌细胞损伤。转染si-NC、si-MEG3后高糖处理,设置为正常组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-MEG3组,RT-qPCR检测lncRNA MEG3在心肌细胞的表达水平,Western blot法检测p62、LC3-Ⅱ、Beclin1、p-mTOR、mTOR、p-ERK、ERK表达量。CCK-8、LDH、ROS、GSH-Px试剂盒检测心肌细胞损伤。结果 DCM小鼠心功能出现异常。与正常组比较,DCM组小鼠心肌细胞p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR表达升高。细胞实验中,高糖诱导的心肌细胞比正常组p62表达显著升高,LC3-Ⅱ和Beclin1表达显著降低,p-mTOR和p-ERK表达升高;细胞活力和GSH-Px活性降低,LDH和ROS活性显著升高。下调lncRNA MEG3后,高糖+si-MEG3组逆转了高糖+si-NC组自噬相关蛋白以及细胞损伤指标的变化。结论 下调lncRNA MEG3抑制了ERK/mTOR信号通路的激活,高糖诱导的心肌细胞自噬得以恢复,且糖尿病心肌损伤被缓解。     

内质网应激诱导的自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的影响

目的 探讨抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)诱导的自噬对新生大鼠坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)的影响。方法 首先建立新生大鼠NEC模型,然后从中分离提取出肠上皮细胞,分为对照组、抑制组、诱导组。对照组正常培养,抑制组加4-苯基丁酸,诱导组加衣霉素处理24h。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组细胞炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、肠脂酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)的表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测各组细胞ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、氧调节蛋白150(oxygen-regulated protein 150,ORP150)的mRNA表达水平;Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达水平。结果 与对照组比较,抑制组p62表达明显增高,TNF-α、I-FABP、GRP78、ORP150、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低,而诱导组p62表达明显降低,TNF-α、I-FABP、GRP78、ORP150、LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著增高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 抑制ERS诱导的自噬激活可减轻NEC新生大鼠肠黏膜损伤和炎性反应,改善肠道屏障功能。     

桃红四物汤促进自噬抑制氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡的实验研究

目的探讨桃红四物汤(TST)对氧糖剥夺(OGD)诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、OGD模型组、OGD+TST含药血清组、OGD+TST含药血清+雷帕霉素组、OGD+TST含药血清+氯喹组。采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹法(Western blot)检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ/3Ⅰ(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)比值及核孔糖蛋白62(p62),B-细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和B-细胞淋巴瘤因子2相关X蛋白(Bax)表达量。结果与对照组比较,OGD模型组细胞活力显著下降[(42.23±3.19)%比(100.00±1.54)%,P0.05],细胞凋亡比例显著增多[(32.14±2.88)%比(3.54±0.23)%,P0.05],p62和Bax蛋白表达增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bcl-2蛋白表达减少;与OGD模型组比较,OGD+TST含药血清组细胞活力显著升高[(80.04±5.19)%比(42.23±3.19)%,P0.05],细胞凋亡明显减少[(10.01±1.04)%比(32.14±2.88)%,P0.05],LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Bcl-2表达增多,p62和Bax蛋白表达减少。与OGD+TST含药血清组比较,OGD+TST含药血清+雷帕霉素组细胞活力显著升高[(89.01±5.35)%比(80.04±5.19)%,P0.05],细胞凋亡比例显著减少[(7.45±0.13)%比(10.01±1.04)%,P0.05],LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Bcl-2表达增多,p62和Bax蛋白表达减少;OGD+TST含药血清+氯喹组细胞活力下降[(53.13±4.13)%比(80.04±5.19)%,P0.05],凋亡细胞比例升高[(17.42±1.93)%比(10.01±1.04)%,P0.05],LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Bcl-2表达减少,p62和Bax蛋白表达增多。结论桃红四物汤可能促进氧糖剥夺H9C2心肌细胞自噬,抑制心肌细胞凋亡,对心肌缺血起保护作用。     

京尼平苷通过AMPK/mTOR通路抑制帕金森模型氧化应激及细胞凋亡的机制研究

目的 探究京尼平苷(geniposide, GP)通过AMP依赖的蛋白激酶［Adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK］/哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路对1-甲基4-苯基-四氢吡啶离子(1-methyl-4-phenyl 1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPP+)诱导人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞获得的帕金森细胞模型细胞凋亡及氧化应激损伤的影响。 方法 以SH-SY5Y细胞为研究对象,按照处理方法将其分为Control组(正常培养)、MPP+组(在Control组基础上添加1 mmol/L MPP+)、GP组(在Control组基础上添加100 μmol/L GP)、MPP++GP组(在MPP+组基础上添加100 μmol/L GP)。使用丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的酶联免疫吸附测定试剂盒、流式细胞术及Western blot法检测各组细胞氧化应激损伤、细胞凋亡及AMPK、mTOR、LC3蛋白相关表达水平的差异。应用AMPK激活剂、mTOR抑制剂处理后,再次使用Western blot检测MPP+组及MPP++GP组细胞上述蛋白表达水平的变化。 结果 相较于Control组,MPP+组细胞凋亡率、LDH活性、MAD含量、AMPK磷酸化水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显增加,SOD活性及mTOR磷酸化水平明显降低(P＜0.01)。相较与MPP+组,MPP++GP组细胞凋亡率、LDH活性、MAD含量、AMPK磷酸化水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显降低,SOD活性及mTOR磷酸化水平明显增加(P＜0.01)。而添加AMPK激活剂或mTOR抑制剂后,MPP+组及MPP++GP组细胞AMPK磷酸化水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高,mTOR磷酸化水平明显降低(P＜0.05)。 结论 GP部分通过调控AMPK/mTOR信号通路抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、氧化应激损伤及自噬。     

辣椒素对体外肝细胞脂质代谢的影响研究

目的 探讨辣椒素对脂肪变肝细胞内脂质沉积的影响及自噬表达情况,为脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶点.方法 用油酸(40 μg/mL)诱导肝原代细胞LO2细胞株建立非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型.实验分为空白对照组、油酸组、辣椒素组[油酸+辣椒素(100 μmol/L)].油红O染色和三酰甘油试剂盒检测肝细胞内脂肪变程度;Western blot检测自噬体标记分子p62和LC3的表达水平并计算LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值.结果 40 μg/mL油酸处理LO2细胞24h后,油红O染色观察,油酸组肝细胞中可见大小不等的橘红色脂滴.而空白对照组无明显橘红色脂滴形成,油酸在体外成功建立NAFLD模型.与油酸组相比,辣椒素组肝细胞内三酰甘油水平显著降低(P＜0.05),脂滴明显减少,p62蛋白水平明显降低(P＜0.05),而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显上调(P＜0.05).结论 在体外利用油酸诱导LO2细胞株建立NAFLD模型,辣椒素刺激NAFLD细胞,上调NAFLD细胞自噬水平,减少细胞内脂质沉积,但具体机制还需进一步研究.     

创伤后应激障碍小鼠海马神经细胞内 FoxO3a和LC3蛋白的表达变化

目的 研究创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)小鼠海马神经细胞内FoxO3a和LC3蛋白表达的变化。方法 采用单一连续刺激(single prolonged stress,SPS)方法建立PTSD小鼠模型,应用旷场实验、高架十字迷宫、Morris水迷宫3种行为学检测方法测试SPS刺激后小鼠的空间记忆能力和焦虑水平,通过Western blot法检测海马神经细胞自噬相关蛋白LC3、p62以及信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a的表达,并利用免疫荧光染色方法观察FoxO3a、LC3的表达水平。结果 行为学实验检测结果显示,与Control组比较,PTSD组小鼠焦虑水平升高及空间记忆受损(P＜0.01);Western blot法和免疫荧光染色结果显示,PTSD组小鼠海马神经细胞p-Akt蛋白水平增加,FoxO3a蛋白表达增加,p-FoxO3a蛋白表达减少,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,p62蛋白水平降低(P＜0.05);海马神经细胞内FoxO3a和LC3荧光表达强度增加。结论SPS刺激后PTSD小鼠海马神经细胞自噬增多,FoxO3a表达增加。     

黄连素对脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用研究

目的探讨黄连素（BBR）对脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）损伤的保护作用及其机制。方法体外培养HUVECs,分为正常对照组(Control组)、LPS组、LPS+细胞自噬诱导剂雷帕霉素（RAPA）组、LPS+细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和LPS+BBR组,置于含相关药物的培养基中继续培养。采用EdU染色法检测细胞活性变化,荧光显微镜观察自噬流变化,Westernblot法检测自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平变化。结果与Control组比较,LPS组EdU染色阳性细胞率明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;与LPS组比较,LPS+RAPA组EdU染色阳性细胞率明显下降,而LPS+3-MA组EdU染色阳性细胞率明显上升,LPS+BBR组EdU染色阳性细胞率明显上升,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与Control组比较,LPS组自噬小体和自噬溶酶体数量均增加,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均上升（均P＜0.05）;与LPS组比较,BBR组自噬小体和自噬溶酶体数量均减少,p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平均下降（均P＜0.05）。结论LPS诱导HUVECs产生自噬,BBR通过抑制由LPS诱导产生的自噬来减轻LPS诱导的HUVECs损伤。     

自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤的影响研究

目的 研究自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响,探讨自噬对小鼠睾丸组织缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法 以小鼠精原细胞系GC1 spg为研究对象构建H/RI模型,雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别作为自噬激动剂和抑制剂,设置对照组、模型组(H/RI)、自噬激动剂干预组(H/RI+自噬激动剂)、自噬抑制剂干预组(H/RI+自噬抑制剂)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)释放水平和凋亡水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果 与对照组比较,模型组增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA相对表达水平明显上升(P<...     

Tristetraprolin通过NF-?B通路抑制肺腺癌细胞自噬

目的研究RNA结合蛋白tristetraprolin在肺腺癌中的表达及抑制自噬作用的分子机制。方法瞬时转染tristetraprolin过 表达质粒,分别在转染tristetraprolin 24、48 及72 h 后采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot 检测肺腺癌细胞中 tristetraprolin表达及自噬相关分子Beclin1、LC3II/LCI及p62的表达变化。瞬时转染tristetraprolin过表达质粒及加入TNF-α,将 肺腺癌细胞分为空载组、tristetraprolin 组、空载+TNF-α组及tristetraprolin+TNF-α组,应用免疫荧光和Western blot检测NF-ĸB p65、c-rel、p50分子在细胞核中表达情况。共转染tristetraprolin过表达质粒及IκBα-mut质粒,将肺腺癌细胞分为tristetraprolin 空载组、IκBα-mut 空载组、tristetraprolin 组、IκBα-mut 组及tristetraprolin+IκBα-mut 组,采用RT-qPCR 和Western blot 检测 tristetraprolin表达及自噬相关基因表达变化。结果Tristetraprolin在肺腺癌细胞中RNA及蛋白水平表达低（P<0.001）。过表达 tristetraprolin 后,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达均较空载组降低（P<0.001）。同时,过表达 tristetraprolin后,细胞核内的p65及c-rel蛋白表达较空载组及空载+TNF-α组减少（P<0.05）,但p50表达无明显变化（P>0.05）。 过表达tristetraprolin后,p65及c-rel核移位较空载组减少。共转染IκBα突变质粒及tristetraprolin过表达质粒后,NF-κB信号通 路被阻断,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达较tristetraprolin过表达组升高（P<0.05）,NF-ĸB信号 通路被阻断后tristetraprolin对自噬的抑制作用减弱。结论Tristetraprolin在肺腺癌细胞中低表达,过表达tristetraprolin可能通 过抑制NF-ĸB p65及c-rel核移位而抑制肺腺癌细胞自噬。     

miR-199a-3p靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响

目的 探究miR-199a-3p过表达靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响。方法 通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p和CD151的靶向关系。构建CD151 pcDNA载体过表达CD151,将miR-199a-3p mimic与pcDNA-CD151单独或联合转染至B-CPAP细胞,将细胞随机分为4组：Control组、miR-199a-3p mimic组、pcDNA-CD151组和miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组。BrdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;流式分选检测细胞周期分布;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blot检测MMP-2、Ki-67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果 CD151与miR-199a-3p存在靶向作用关系。与Control组比较,miR-199a-3p mimic组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G₂/M、G₁期比例降低,S期比例...     

Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin (终浓度为1 000 nmol·L-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1 000 nmol·L-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。