基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨毛果鱼藤提取物抗痛风作用及机制

目的 通过网络药理学分析结合体内、外实验验证，探究毛果鱼藤对痛风的改善作用及机制。方法 利用数据库获取毛果鱼藤的化学成分及其候选靶标，通过蛋白质互作和网络分析，筛选毛果鱼藤治疗痛风的关键网络靶标和潜在活性成分，并进行生物功能富集及通路分析；小鼠腹腔注射次黄嘌呤复制高尿酸血症模型，观察毛果鱼藤醇提取物对高尿酸血症及正常小鼠尿酸水平的影响；大鼠足跖注射微晶型尿酸钠结晶，复制痛风性炎症模型，观察毛果鱼藤醇提物对痛风性炎症的影响；二甲苯诱导急性炎症模型，观察毛果鱼藤醇提物的抗炎作用；热板法、扭体法观察毛果鱼藤的镇痛作用。脂多糖诱导RAW264.7细胞复制体外炎症模型，观察毛果鱼藤醇提物对相关信号通路的影响。结果 通过构建毛果鱼藤-成分-痛风疾病靶点网络及分子对接分析，获得毛果鱼藤治疗痛风的12个关键网络靶标和15个潜在活性成分，发现其可以通过大黄素、白桦脂酸、美迪紫檀素等成分作用于Toll样受体4（TLR4）、NOD样受体蛋白3（NLRP3）、核转录因子-κB（NF-κB）等靶点发挥抗高尿酸血症、抗炎、镇痛等作用。与正常组比较，模型组小鼠血清尿酸水平显著增高（P<0.01）、大鼠肿胀度显著增高（P<0.05，P<0.01）、小鼠耳廓肿胀度降低（P<0.05）、小鼠扭体次数显著减少（P<0.05，P<0.01）、小鼠热板痛阈显著提高（P<0.05），细胞中TLR4 mRNA水平、TLR4、NF-κB、NLRP3的蛋白表达及细胞上清中TLR-4、NF-κB水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，毛果鱼藤醇提物（20、10、5 g·kg^-1）可以显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平（P<0.01），抑制大鼠足跖肿胀（P<0.05，P<0.01），降低细胞中TLR4 mRNA水平，降低细胞中TLR4、NF-κB、NLRP3的蛋白表达及降低细胞上清中TLR4、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、NF-κB、白细胞介素-6（IL-6）的水平（P<0.05，P<0.01）。结论 毛果鱼藤醇提物具有明显的抗痛风作用，作用机制可能与其对TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的影响有关。     

脑心安胶囊对慢性脑缺血致血管性认知障碍大鼠胶质细胞激活及炎性反应的调节作用

目的 以慢性脑缺血致血管性认知障碍（VCI）大鼠为模型,探讨脑心安胶囊对VCI大鼠脑内胶质细胞激活及炎性损伤的保护作用。方法 150只大鼠随机分为假手术组（20只）和造模组（130只）,采用双侧颈动脉结扎法（2-VO）造模。造模成功的87只大鼠,随机分为模型组、阳性药组（安理申,0.5 mg·kg^-1）,脑心安低、中、高剂量组（0.18,0.36,0.72 g·kg^-1）,每组17~18只大鼠。经灌胃给予脑心安8周后,采用Morris水迷宫和避暗箱实验检测脑心安对VCI大鼠记忆能力的影响,苏木素-伊红（HE）染色法观察大鼠大脑海马CA1区神经细胞结构变化,原位末端标记法（TUNEL）染色检测大鼠海马神经细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠脑内胶质纤维酸性蛋白（GFAP）,离子钙结合衔接分子-1（Iba-1）表达水平,测定p38有丝分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和核转录因子-κB（NF-κB）磷酸化水平,酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定脑内炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果 与假手术组比较,模型组大鼠空间学习记忆能力和记忆保持能力均明显下降（P<0.05,P<0.01）,大脑海马CA1区神经元出现明显损伤,细胞凋亡率显著升高（P<0.01）,GFAP,Iba-1表达均显著上调（P<0.01）,p38 MAPK,NF-κB磷酸化水平显著增加（P<0.01）,炎性因子IL-1β,TNF-α水平升高（P<0.01）。与模型组比较,脑心安各剂量组均能显著改善模型大鼠空间学习记忆能力和记忆保持能力（P<0.05,P<0.01）,改善海马CA1区神经元损伤,降低神经细胞凋亡率（P<0.05,P<0.01）,下调GFAP,Iba-1表达量（P<0.01）,降低p38 MAPK,NF-κB磷酸化水平（P<0.05,P<0.01）,降低TNF-α,IL-1β水平（P<0.01）。结论 脑心安胶囊通过抑制慢性脑缺血诱发的大鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化,抑制p38 MAPK和NF-κB激活导致的中枢神经炎性损伤,改善慢性脑缺血导致的VCI。     

大黄酸对脑缺血大鼠脑组织中AQP4和小胶质细胞介导炎症反应的影响

目的 本研究旨在探讨大黄酸对脑缺血损伤后水通道蛋白4（AQP4）与脑水肿的影响以及小胶质细胞介导的炎症在此过程中的作用。方法 选择改良线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞（MCAO）的脑缺血模型,并将其分为假手术组、模型组、米诺环素组和大黄酸高、中、低剂量组（3.46,1.73,0.865 mg·kg^-1）。通过改良神经行为学评分测量神经行为功能。采用干湿重法测定脑缺血损伤大鼠脑组织含水量变化。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠脑缺血周边区γ-干扰素（IFN-γ）,白细胞介素-2（IL-2）的表达变化。免疫荧光双标记法检测小胶质细标记物离子钙接头蛋白抗原-1（Iba-1）,AQP4蛋白的表达和定位。结果 与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分、脑组织损伤侧含水量明显增高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组大鼠神经功能评分、脑组织含水量均明显降低（P<0.05,P<0.01）;与假手术组比较,模型组IFN-γ,IL-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;与模型组比较,各药物组脑缺血周边区IFN-γ,IL-2蛋白水平均明显改善（P<0.05,P<0.01）。与假手术组比较,模型组可见激活的小胶质细胞上AQP4蛋白荧光表达明显增强;与模型组比较,各药物组可减少激活的小胶质细胞上AQP4蛋白荧光的表达,各组大鼠脑缺血周边区可见不同程度激活的小胶质细胞标记物Iba-1与AQP4共定位表达。结论 大黄酸可以减轻脑缺血损伤引起的脑水肿程度,其机制可能与其抑制小胶质细胞介导的神经炎症、下调AQP4蛋白表达有关。     

柴芍六君子汤通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抗溃疡性结肠炎的机制

目的 探究柴芍六君子汤对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜损伤的防治作用及机制。方法 50只Balb/c雄性小鼠,随机分为正常组、模型组、柴芍六君子汤低、高剂量组、柳氮磺吡啶组。除正常组外,其余各组自由饮用2.5% DSS,连续7 d,造模成功后给予药物连续干预7 d。每天记录小鼠体质量、粪便等一般生理状态,计算疾病活动指数（DAI）评分。测量结肠长度;苏木素-伊红（HE）染色观察结肠黏膜组织形态学变化;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中白细胞介素-1β（IL-1β）、髓过氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子-κB（NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）、NOD样受体蛋白3（NLRP3）蛋白表达水平。结果 与正常组比较,模型组小鼠体质量显著下降（P<0.01）,腹泻及便血严重,DAI评分显著增加（P<0.01）。与模型组比较,柴芍六君子汤治疗组小鼠体质量下降趋势得到显著缓解（P<0.01）,腹泻及便血状态显著改善,DAI评分显著下降（P<0.01）;结肠长度明显增加（P<0.05）;HE染色发现治疗组结肠黏膜损伤明显改善,炎细胞浸润减少;与正常组比较,模型组小鼠血清中IL-1β、MPO含量显著升高（P<0.01）,SOD含量显著降低（P<0.01）;与模型组比较,治疗组血清中IL-1β、MPO水平显著降低（P<0.01）,SOD水平显著升高（P<0.01）;Western blot检测结果显示,与正常组比较,模型组小鼠结肠组织TLR4、MyD88、NF-κB、Caspase-1、NLRP3蛋白表达水平显著增加（P<0.01）,IκB蛋白表达量显著降低（P<0.01）;与模型组比较,柴芍六君子汤治疗组小鼠结肠组织中炎症相关蛋白TLR4、MyD88、NF-κB、Caspase-1、NLRP3蛋白表达水平显著下降（P<0.01）,IκB蛋白表达量显著增加（P<0.01）。结论 柴芍六君子汤通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织的炎症性损伤。     

四神丸挥发油对慢性溃疡性结肠炎小鼠TLR/MyD88信号通路的调控作用

目的 从Toll样受体（TLR）/髓样分化因子88（MyD88）信号通路,探讨四神丸挥发油有效治疗慢性溃疡性结肠炎的可能机制。方法 将BALB/c小鼠随机分成正常组,模型组,四神丸挥发油组,二神丸挥发油组,五味子散挥发油组和美沙拉嗪组,采用葡聚糖硫酸钠（DSS）建立慢性溃疡性结肠炎小鼠模型,灌胃给药7 d后,通过体质量、结肠质量、结肠质量指数、结肠长度、结肠镜下损伤评分评价其疗效;用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测结肠组织上清液中白细胞介素-4（IL-4）,白细胞介素-10（IL-10）,白细胞介素-17A（IL-17A）,白细胞介素-21（IL-21）和γ干扰素（IFN-γ）水平,同时用蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测各组小鼠结肠黏膜中TLR/MyD88信号通路相关蛋白,包括TLR2,MyD88,Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）,白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK4）,白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK1）,肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）,转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白1（TAB1）,转化生长因子-β活化激酶1结合蛋白2（TAB2）,丝裂原活化蛋白激酶激酶6（MKK6）,p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的表达水平。结果 与正常组比较,模型组结肠长度显著降低,结肠质量、结肠质量指数和结肠镜下病理损伤评分均显著升高,IL-10水平显著降低,IL-4,IL-21和IFN-γ水平明显升高（P<0.05,P<0.01）,TLR2,MyD88,Rac1,IRAK4,IRAK1,TRAF6,TAB1,TAB2,MKK6,p38 MAPK和CREB蛋白表达量均显著升高（P<0.01）;与模型组比较,经四神丸挥发油干预后,小鼠结肠长度显著增加,结肠质量、结肠质量指数和结肠镜下病理损伤评分均显著降低,且小鼠结肠组织中IL-10水平明显升高,而IL-4,IL-17A,IL-21和IFN-γ水平明显降低（P<0.05,P<0.01）,同时小鼠结肠组中TLR2,MyD88,Rac1,IRAK4,IRAK1,TRAF6,TAB1,TAB2,MKK6,p38 MAPK和CREB蛋白表达量均明显下调（P<0.05,P<0.01）。结论 四神丸挥发油能有效改善慢性溃疡性结肠炎的炎性损伤,可能是通过抑制TLR/MyD88信号通路实现的。     

基于NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB信号通路探讨黄连解毒汤治疗急性痛风性关节炎的作用机制

目的 观察黄连解毒汤对急性痛风性关节炎（AGA）模型小鼠炎性损伤的影响，探讨黄连解毒汤治疗AGA的作用机制。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和黄连解毒汤组。采用踝关节注射单钠尿酸盐（MSU）晶体混悬液建立小鼠AGA模型，给药组分别给予黄连解毒汤水煎液（5 g·kg^-1）和秋水仙碱（0.83 mg·kg^-1），每天测量小鼠右踝关节肿胀程度，7 d后苏木素-伊红（HE）染色检测踝关节组织病理改变。另外40只C57BL/6J小鼠同样分组处理，造模18 h后，取右踝关节，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测关节炎症因子白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6和NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）mRNA的表达；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量；蛋白免疫印迹法（Western bolt）检测NLRP3炎性小体和Toll样受体4/核转录因子-κB（TLR4/NF-κB）信号通路蛋白的表达。结果 与正常组比较，模型组小鼠右踝关节显著肿胀（P<0.01），HE染色观察到踝关节明显异物肉芽肿，其间有炎症细胞浸润，黄连解毒汤干预后可以缓解踝关节肿胀（P<0.05，P<0.01），异物肉芽肿减小。与正常组比较，模型组踝关节组织中炎症因子IL-1β含量和IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达显著升高（P<0.01），NLRP3炎性小体、Caspase-1 mRNA表达明显升高（P<0.05，P<0.01），NLRP3、Caspase-1、TLR4和NF-κB蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，黄连解毒汤干预明显降低炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NLRP3炎性小体、Caspase-1 mRNA表达（P<0.05，P<0.01），显著降低关节组织中炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6含量（P<0.01），下调NLRP3、Caspase-1、TLR4、NF-κB蛋白的表达（P<0.05，P<0.01）。结论 注射MSU晶体导致AGA小鼠关节局部炎性免疫损伤，黄连解毒汤干预减轻炎性免疫损伤，可能与其调控NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB信号通路相关。     

脑心通胶囊“心脑同治”的免疫和炎症标志物研究

目的 探讨脑心通胶囊“心脑同治”的免疫和炎症标志物。方法 采用结扎左前降支冠状动脉（left anterior descending coronary artery ligation,LAD）模型为心肌缺血模型,大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型为脑缺血模型。雄性SD大鼠随机分为8组,包括用于心肌缺血研究的假手术组、LAD模型组、脑心通（110 mg/kg）组和卡托普利（10.125 mg/kg）组,以及用于脑缺血研究的假手术组、MCAO模型组、脑心通（220 mg/kg）组和银杏提取物（50 mg/kg）组,每组15只。药效学指标选择心电图、心肌酶谱、透射电镜等;生物信息学和蛋白质组学预测并筛选免疫炎症标志物;利用qRT-PCR和Western blotting验证关键备选标志物靶点的mRNA和蛋白相对表达量。结果 脑心通胶囊不仅降低LAD大鼠的心梗死率、心肌酶活性（P＜0.01）,改善心肌损伤,还能降低LAD大鼠的脑海马组织损伤和脑水肿（P＜0.05）。对于MCAO大鼠,脑心通胶囊显著降低脑梗死率、神经功能评分和脑组织含水率（P＜0.05、0.01）,同时减轻心肌组织和细胞损伤,降低心肌酶活性（P＜0.01）。根据生物信息学和蛋白质组学结果,Toll受体信号通路的相关靶点是“心脑同治”的关键所在,有成为标志物的潜力。在心肌缺血和脑缺血2种状态下,α-干扰素（interferon-α,IFN-α）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）、TLR7、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）共4个靶点的mRNA和蛋白相对表达量显著变化（P＜0.05、0.01）,表明LAD大鼠和MCAO大鼠的海马中出现炎症因子风暴和免疫反应瀑布。结论 IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α能够作为海马中“心脑互损”“心脑同治”的免疫和炎症标志物。     

白芍总苷调节TLR9/MyD88/NF-κB通路改善系统性红斑狼疮小鼠肾脏损伤

目的 基于Toll样受体9/髓样分化因子88/核转录因子-κB（TLR9/MyD88/NF-κB）信号通路研究白芍总苷（TGP）对MRL/lpr狼疮模型小鼠肾脏损伤的干预作用，探讨TGP防治系统性红斑狼疮（SLE）的部分免疫学机制。方法 将SPF级MRL/lpr雌性小鼠随机分为4组，模型组、地塞米松组（0.15 g·kg^-1）、TGP高、低剂量组（0.078、0.039 g·kg^-1），雌性C57BL/6J小鼠设为空白组，每组7只；各组小鼠每天同一时间段给予相应药物或生理盐水灌胃。4周后采集标本，称取肾脏、脾脏质量，计算脏器指数；生化分析法检测各组血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）水平；苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠肾脏组织病理学变化；马松（Masson）染色评估小鼠肾脏组织纤维化程度；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清白细胞介素（IL）-2、干扰素-α（IFN-α）、IL-4和抗核抗体（ANA）的水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肾组织中TLR9、MyD88、NF-κB p65的mRNA表达；免疫荧光法检测肾组织中TLR9、NF-κB p65蛋白表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾、脾组织中TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达水平。结果 与空白组比较，模型组小鼠SCr、BUN及脾脏指数和肾脏指数明显升高（P<0.05），肾组织病理损伤和纤维化程度明显增强；血清IFN-α、IL-4及ANA水平显著升高，IL-2水平明显降低（P<0.05）；肾脏和脾脏中TLR9、MyD88及NF-κB p65的mRNA和蛋白水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较，TGP高、低剂量组小鼠SCr、BUN及脾脏指数和肾脏指数明显降低（P<0.05），肾组织病理损伤和纤维化程度明显减轻；血清IFN-α、IL-4及ANA水平明显下降（P<0.05），IL-2水平明显升高；肾脏和脾脏组织中TLR9、MyD88和NF-κB p65等分子mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。结论 TGP可能通过调控TLR9/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制其下游相关炎症因子表达，发挥免疫调节及抗SLE肾脏损伤作用。     

温阳、解郁及温阳解郁方对LPS“二次应激”诱发的抑郁样行为小鼠海马小胶质细胞的影响

目的 观察母婴分离（MS）联合脂多糖（LPS）应激后抑郁样行为小鼠海马区小胶质细胞活化及炎症因子的表达情况,从温阳、解郁及温阳解郁二方合用的角度探讨温阳解郁法抗抑郁的可能机制。方法 将70只仔鼠随机分为正常组（10只）、LPS应激组（LPS,10只）和造模组（MS,50只）,造模组小鼠在产后第5天（PD₅）-PD₁₄进行8 h·d^-1的母婴分离,后将造模组分为母婴分离+脂多糖应激组（MS+LPS）,温阳组（WY）,解郁组（JY）,温阳解郁组（WYJY）及氟西汀组（FLU）,每组10只。将仔鼠出生日期记为PD₀,正常,LPS及MS+LPS组小鼠于PD₂₁-PD₉₀饲喂正常饲料,其余各组给予对应的药混饲料喂养,且于PD₉₁给予脂多糖腹腔注射7 d,建立抑郁症小鼠模型。采用旷场,O迷宫和社会交互实验检测各组小鼠抑郁样行为;免疫组化法观察海马组织小胶质细胞钙结合蛋白-1（Iba-1）蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测白细胞介素-1β（IL-1β）,白细胞介素-6（IL-6）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,Iba-1及糖皮质激素受体（GR） mRNA表达量。结果 与正常组比较,LPS组小鼠5 min中心区停留时间有减少趋势、运动总路程显著减少（P<0.01）,活动总路程显著减少（P<0.01）,MS+LPS组小鼠开放臂活动时间及活动总路程明显减少（P<0.05,P<0.01）,训练、辨别探查时间显著升高（P<0.01）,LPS,MS+LPS组小鼠海马CA1区Iba-1表达显著升高（P<0.01）;与LPS组比较,MS+LPS组小鼠5 min运动总路程明显增长（P<0.05）,训练、辨别探查时间明显升高（P<0.05,P<0.01）,海马CA1区Iba-1表达显著升高（P<0.01）;与MS+LPS组比较,各给药组小鼠5 min运动总路程均明显减少（P<0.01）,训练探查时间均显著降低（P<0.05,P<0.01）,JY,WYJY,FLU组小鼠辨别探查时间均显著降低（P<0.01）,各给药组小鼠海马CA1区Iba-1表达显著降低（P<0.01）。结论 温阳解郁法可能通过抑制抑郁症小鼠海马区小胶质细胞的激活,降低IL-1β,IL-6,TNF-α等炎症因子的表达,进而抑制抑郁症发生及发展。     

脑心通胶囊对血管性痴呆大鼠乙酰胆碱能神经的影响※

目的 研究脑心通胶囊对VD大鼠认知功能障碍的改善作用及对胆碱能神经环路的保护作用。方法 取48只SPF级SD雄性大鼠，采用改进的双侧颈总动脉反复缺血－再灌注（2VO）方法制备VD模型，并随机分为4组：VD模型组、假手术（Sham）组、脑心通胶囊治疗组、多奈哌齐阳性对照组，每组12只。采取Y迷宫法检查各组大鼠空间记忆能力；采用HE染色法进行组织病理学检查，电镜下观察大鼠海马CA1区的中段细胞水平和形态；应用免疫组化法检查大鼠胆碱乙酰转移酶（ChAT）的表达程度。结果 Y迷宫数据表明脑心通胶囊治疗组大鼠自发交替率明显比VD模型组高（P<0.05）；组织病理学检查方面，脑心通胶囊治疗组大鼠海马CA1区的中段细胞数量显著比VD模型组高（P<0.05）；脑心通治疗组大鼠海马区ChAT阳性细胞数明显多于VD模型组（P<0.05）。结论 脑心通胶囊对VD大鼠胆碱能神经环路中ChAT蛋白水平的表达起促进作用，能帮助其恢复空间记忆能力。     

灭幽汤对幽门螺杆菌相关性胃炎脾胃湿热证模型小鼠Toll样受体2、4的影响

目的探讨灭幽汤治疗幽门螺杆菌(Hp)相关性胃炎脾胃湿热证的作用机制。方法将70只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、胃三联组和灭幽汤高、低剂量组(中药高、低剂量组),每组14只,采用复合因素建立BALB/c小鼠Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型。成模后各给药组给予相应药物,连续14 d,采用免疫组化检测Toll样受体(TLR)2、TLR4蛋白表达,实时荧光定量PCR检测TLR2、TLR4基因表达,ELISA检测血清白细胞介素(IL)-6、IL-8的表达。结果模型组TLR2、TLR4蛋白和基因表达水平及血清IL-6、IL-8含量均高于对照组(P0.01);中药高、低剂量组和胃三联组TLR2、TLR4蛋白和基因表达及血清IL-6、IL-8含量均低于模型组(P0.01);中药高剂量组TLR2、TLR4蛋白和基因表达水平及血清IL-6、IL-8含量虽低于胃三联组,但差异无统计学意义(P0.05)。结论灭幽汤可能通过抑制TLR2、TLR4及下游炎症因子的表达达到治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的目的。     

青藤碱对类风湿关节炎患者外周血树突状细胞TLR2和TLR4表达的影响

目的:观察中药单体青藤碱对类风湿关节炎患者外周血树突状细胞toll样受体(toll like receptor,TLR)2和TLR4表达的影响。方法:分离10例类风湿关节炎患者的单核细胞,采用细胞因子刺激分化为树突状细胞。分别采用青藤碱高(5mM)、中(2mM)、低(1mM)剂量和空白对照干预。实时荧光定量PCR检测各组树突状细胞TLR2和TLR4 mRNA的表达,Western-blot检测树突状细胞TLR2和TLR4蛋白的表达。结果:与对照组相比,经青藤碱高(P<0.01)、中剂量(P<0.01)干预后的树突状细胞TLR2和TLR4 mRNA表达明显降低,青藤碱干预后的树突状细胞(DC)中TLR2、TLR4表达均有所有降低。结论:青藤碱可能通过抑制树突状细胞TLR介导的炎症信号转导,而产生治疗类风湿关节炎的作用。     

固本防哮饮对小鼠哮喘缓解期TLR4及TLR7的调节作用

目的:观察固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠模型Toll-样受体(TLR) 4,TLR7,核转录因子-κB p65(NF-κB p65),NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的调节作用,探讨固本防哮饮治疗哮喘缓解期的机制。方法:呼吸道合胞病毒(RSV)联合鸡卵蛋白(OVA)对3周龄BALB/c小鼠制备哮喘缓解期模型,将60只小鼠分为空白组、模型组、地塞米松组(0. 001 g·kg~(-1))以及固本防哮饮低、中、高剂量(6. 5,13,26 g·kg~(-1))组,分别进行干预,共给药28 d,每天1次。给药结束后处死小鼠,苏木素-伊红(HE)染色观察哮喘小鼠肺组织病理形态学变化,并对肺部炎症情况进行评分;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠肺组织TLR4,TLR7,IκBα及肺组织细胞核内NF-κB p65蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦观察NF-κB p65在细胞核表达情况。结果:与空白组比较,模型组小鼠肺组织有明显炎症细胞浸润及支气管狭窄(P 0. 01),同时小鼠肺组织细胞核内NF-κB p65分布显著增多(P 0. 01),表达明显增高(P 0. 05),TLR4,TLR7,IκBα蛋白表达明显降低(P 0. 05);与模型组比较,固本防哮饮各剂量组能显著缓解小鼠肺组织炎症浸润(P 0. 01),降低肺组织核蛋白NF-κB p65的表达(P 0. 01),核蛋白NF-κB p65入核情况减轻(P 0. 01),同时显著增加TLR4,TLR7,IκBα蛋白的表达(P 0. 01)。结论:固本防哮饮能够缓解气道炎症,并且可能是通过调节TLR4,TLR7,NF-κB p65,IκBα实现其治疗作用。     

溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜Toll样受体2、4基因表达的影响

目的:观察溃结灵对溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型结肠粘膜Toll样受体(TLR)2、4基因表达的作用。方法:用三硝基苯磺酸(TNBS)法制备UC大鼠模型,将48只大鼠分为正常组、模型组、溃结灵低、中、高三个剂量组和柳氮磺胺吡啶(SASP)组,分别检测肠粘膜TLR2、TLR4基因表达水平。结果:模型组TLR2、TLR4基因相对表达量均明显高于正常组(P<0.01);溃结灵中、高剂量组TLR2相对表达量明显低于模型组(P<0.05);溃结灵高剂量组TLR4相对表达量明显低于模型组(P<0.05)。结论:UC大鼠结肠粘膜TLR2、TLR4基因高表达,溃结灵对TLR2、TLR4基因表达有抑制作用,这可能是其抗UC作用的机理之一。     

基于TLR3/TLR9介导巨噬细胞自噬/极化效应探讨血管软化丸抗AS的作用机制

目的:观察血管软化丸通过对TLR3的影响,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而对巨噬细胞自噬产生影响,以及观察血管软化丸通过对TLR9的影响,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,影响巨噬细胞M2/M1平衡,探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化(AS)的分子机制。方法:体外实验,将巨噬细胞随机分为6组,即对照组(空白血清),血管软化丸高剂量组、血管软化丸中剂量组、血管软化丸低剂量组、ODN组(TLR9激动剂:ODN1826)、poly组(TLR3激动剂:poly(I:C))。体内实验,将ApoE~(-/-)小鼠分为6组,对照组(生理盐水,灌胃)血管软化丸高剂量组(浓度为3.456 g/mL),血管软化丸中剂量组(浓度为1.728 g/mL)、血管软化丸低剂量组(浓度为0.864 g/mL)、ODN组(ODN1826,腹腔注射)、poly组(poly(I:C),腹腔注射),腹腔注射每周两次,灌胃每日1次,连续给药8周后取材进行检测。观察血管软化丸含药血清和TLR9对巨噬细胞的极化状态的影响,对动脉斑块iNOS和CD206的表达的影响,对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响和对巨噬细胞(M1/M2)平衡相关炎症因子的影响;采用ELISA法检测细胞分泌炎性因子相关水平,采用Western blot检测和RT-PCR法检测血管软化丸对主动脉斑块TLR9和TLR3及其下游信号分子表达的影响,观测指标:采用Western blot检测各组细胞TLR9的蛋白含量,及主动脉TLR9及其下游的分子MyD88,p-NF-κB和IRF7的蛋白含量;采用流式细胞术和免疫化学荧光检测各组细胞M1型和M2型的比例;采用RT-PCR和ELISA法检测各组细胞TNF-α的表达;采用RT-PCR和免疫荧光检测RAW264.7细胞和动脉斑块的M1型和M2型巨噬细胞的相关标志性因子和炎症因子;病理学检测验证血管软化丸抗动脉粥样硬化的疗效。结果:血管软化丸含药血清可以诱导巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞的标志CD206;中药组斑块中iNOS的荧光密度表现为低表达(P0.05),而斑块中CD206的荧光密度则表现为高表达(P0.05);血管软化丸含药血清调低IL-1β、iNOS、Ciita表达(P0.05),调高Ym1、Fizz1表达水平(P0.05);能够改善细胞分泌炎性因子IFN-γ和IL-10相关水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9蛋白和TLR3蛋白表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR9下游信号MyD88、p-NF-κB、IRF7 mRNA表达水平(P0.05);血管软化丸含药血清调低TLR3下游信号LC3Ⅱ、Beclin、Akt、mTOR mRNA表达水平(P0.05)。结论:血管软化丸通过影响TLR9,调控下游NF-κB和IRF7信号途径,进而调节巨噬细胞M2/M1平衡;通过调控TLR3影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而调节巨噬细胞自噬,抑制动脉粥样硬化的发生发展。     

松针对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织TLR3、TLR4表达的影响

目的:通过观察松针对呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织Toll样受体3(TLR3)及Toll样受体4(TLR4)蛋白表达的影响,探讨其治疗呼吸道合胞病毒感染的可能免疫调节机制。方法:采用美国癌症研究所(Institute of Cancer Research)培育的ICR小鼠60只随机分为6组:正常对照组、模型组、利巴韦林组、松针高剂量组、中剂量组呼、低剂量组,呼吸道合胞病毒滴鼻后给药,观察肺组织TLR3及TLR4蛋白的表达。结果:松针高剂量组可降低小鼠肺组织TLR3及TLR4蛋白的表达,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:松针可抑制呼吸道合胞病毒感染小鼠肺组织中TLR3及TLR4蛋白的表达,可能为其免疫调节作用的机制之一。     

加味黑布膏对大鼠痤疮模型组织TLR2、TLR4表达的影响及其作用机制探讨

目的:观察加味黑布膏对大鼠耳廓复合痤疮模型组织Toll样受体(TLR)2、TLR4表达水平的影响,初步探讨其治疗轻度增生性痤疮瘢痕的作用机制。方法:抽取10只大鼠为空白组,剩余大鼠参照Kligman法建立大鼠耳廓复合痤疮模型后随机被分为加味黑布膏低、中、高剂量组,阳性对照组和模型组,治疗21d后,观察治疗前后皮损变化、大鼠耳廓造模区域组织病理变化,并以RT-PCR及Western Blot测定大鼠耳廓造模区域组织TLR2、TLR4的表达水平。结果:加味黑布膏高剂量组皮损已基本接近空白组,其余各治疗组皮损均有不同程度的改善,其中加味黑布膏高剂量组皮肤角质层接近空白组;RT-PCR及Western Blot检测:模型组耳廓组织TLR2、TLR4的表达显著高于空白组(P<0.01);除加味黑布膏低剂量组外,其他3组耳廓组织TLR2、TLR4的表达均低于模型组(P<0.05);加味黑布膏高剂量组优于阳性对照组(P<0.05)。结论:加味黑布膏对轻度增生性痤疮瘢痕有较好的治疗作用,其有效性可能与降低局部组织TLR2、TLR4的表达水平有关。     

和厚朴酚通过PI3K/Akt信号通路对哮喘小鼠的作用及其对TLR2、TLR4表达的影响

目的探讨和厚朴酚通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对哮喘小鼠的作用及其对Toll样受体2(TLR2)、TLR4表达的影响。方法 50只ICR小鼠随机分为对照组、哮喘模型组、阳性对照组(地塞米松10 mg/kg)及和厚朴酚高、低剂量(50、10μg/kg)组。采用卵清蛋白(OVA)+氢氧化铝致敏法诱导哮喘模型,随后ip相应的药物进行干预,连续给药7 d,于末次给药后24 h取肺泡灌洗液进行白细胞分类并计数;取左侧肺组织进行HE、PAS、Masson染色常规病理组织学检查;采用Western blotting法检测小鼠肺组织PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、TLR2、TLR4蛋白的表达水平;采用RT-PCR法检测小鼠肺组织中TLR2、TLR4 mRNA的表达水平。结果与模型组比较,和厚朴酚50μg/kg组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞计数均减少(P0.01);肺组织病理明显改善,炎症细胞浸润减少,气管壁及肺泡损伤明显缓解;肺组织PI3K、Akt、p-Akt、TLR2、TLR4蛋白及TLR2、TLR4 mRNA表达水平下调(P0.05)。结论和厚朴酚对OVA致哮喘小鼠的炎症反应具有较好的抑制作用,其机制可能与作用于TLR2、TLR4受体进而抑制PI3K/Akt信号通路有关。     

TLR4基因结构和功能的生物信息学分析

目的运用生物信息学的各种方法,对TLR4基因的结构和功能进行深入分析。方法依托生物信息学的各种软件,对TLR4基因启动子及其所编码的氨基酸理化性质、信号肽、跨膜结构、蛋白质的二级结构、蛋白质三级结构、蛋白质翻译后修饰、蛋白质相互作用进行生物信息学分析。结果 TLR4基因只有一个启动子;TLR4蛋白属于亲水的不稳定蛋白,等电点为5.88;TLR4蛋白大多数位于膜外的分泌蛋白并且有信号肽;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;三级结构稳定可靠;N-糖基化位点和O-糖基化位点各有10和4位;磷酸化的位点有Ser:21,Thr:6,Tyr:7;TLR4蛋白可以与10个蛋白发生作用。结论深入分析TLR4基因的结构和功能,研究其与肝脏疾病之间的关系有很大的意义。     

CD_(133)~+、TLR2和TLR4表达水平对老年陈旧性心肌梗死患者细胞心肌成形术早期预后的影响

目的探讨循环CD133+、Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)表达水平对老年陈旧性心肌梗死患者细胞心肌成形术早期预后的影响。方法采用流式细胞仪检测经皮冠状动脉介入治疗(PCI)+支架植入术患者和PCI+支架植入术+人脐带造血干细胞(hUCM-SCs)移植术患者循环CD133+、TLR2和TLR4的表达水平与心肌梗死面积和左心室射血分数(LVEF)的关系。评估CD133+、TLR2和TLR4对细胞心肌成形术早期预后的影响。结果 PCI+支架植入术后8周CD133+(0.05±0.02)%、TLR2(5.9±2.2)荧光强度(MFI),TLR4(3.7±1.8)MFI;PCI+支架植入术+hUCM-SCs移植后8周CD133+(0.07±0.01)%,TLR2(3.6±0.3)MFI,TLR4(2.2±1.3)MFI。2组患者治疗8周后CD133+、TLR2和TLR4水平比较均有显著性差异(P均<0.01)。结论 CD133+、TLR2和TLR4表达水平可能影响老年陈旧性心肌梗死患者细胞心肌成形术的早期预后。