黄芩-黄连抗神经炎症的配伍优势及其调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的潜在靶点

目的 探索黄芩-黄连防治神经炎症的配伍优势,并基于Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）通路,阐明黄芩-黄连配伍优势的作用特点及机制。方法 选取体外具有代表性的小鼠小胶质细胞（BV2）,将BV2分为8组,分别为正常组、模型组、黄芩-黄连组、吡拉西坦组、黄芩组、黄连组;利用细菌脂多糖（LPS）建立BV2细胞炎症模型,通过细胞增殖活性检测（CCK-8）试剂盒检测细胞活性;明场下观察细胞形态;酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫荧光法测定药物对BV2细胞促炎因子产生及释放的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达;细胞免疫荧光检测NF-κB p65核转位情况;通过TLR4信号转导抑制剂CLI-095、NF-κB阻断剂PDTC进行黄芩-黄连抗神经炎症作用靶点的确认。结果 与正常组比较,LPS诱导的模型组细胞大多处于激活状态,培养液及细胞内的IL-6、TNF-α、IL-1β含量显著升高（P<0.01）,TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65的mRNA表达显著升高（P<0.01）,NF-κB p65的入核现象明显;与模型组比较,黄芩-黄连、吡拉西坦组预处理后,BV2细胞形态大部分恢复,IL-6、TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.01）,TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65 mRNA表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,NF-κB p65大多存在于细胞质中;黄芩组、黄连组与模型组比较,细胞形态略有恢复,促炎因子水平及TLR4、MyD88、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA表达量有所降低;与黄芩-黄连组比较,黄芩组、黄连组的促炎因子抑制作用效果显著低于药对组;与模型组比较,应用信号通路特异抑制剂“黄芩-黄连+CLI-095”组、“黄芩-黄连+PDTC”组,能够明显降低TLR4、MyD88、NF-κB p50及NF-κB p65的mRNA表达（P<0.05,P<0.01）,并明显抑制NF-κB p65转入细胞核内。结论 黄芩与黄连相须配伍后的抗神经炎症作用明显优于单味黄芩或黄连;该药对的抗神经炎症优势与抑制小胶质细胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活密切相关;通过验证说明TLR4、MyD88、NF-κB为黄芩-黄连发挥药对配伍优势的潜在靶点。     

痰瘀同治调控TLR4/NF-κB/IκB通路对糖尿病大鼠心肌炎症反应的影响

目的 观察痰瘀同治对糖尿病大鼠心肌Toll样受体4（TLR4）/核转录因子-κB（NF-κB）/核转录因子-κB抑制蛋白（IκB）信号通路的干预作用,探讨其改善糖尿病大鼠心肌炎症病变的相关机制。方法 选取清洁级雄性SD大鼠45只,随机分为正常组、化痰组、化瘀组、痰瘀同治组、阿拉氯胺组、模型组。除正常组外,其余各大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）55 mg·kg^-1建立糖尿病模型,正常喂养3周后,化痰组、化瘀组、痰瘀同治组每日分别给予小陷胸汤（4.05 g·kg^-1）,血府逐瘀汤（7.02 g·kg^-1）,抵当陷胸汤（8.10 g·kg^-1）灌胃,阿拉氯胺组每日予阿拉氯胺（3 mg·kg^-1）灌胃,连续给药8周后麻醉取材。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测心肌组织TLR4蛋白及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平;免疫组化法检测NF-κB p65和NF-κB抑制蛋白α（IκBα）表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠心肌TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α的mRNA表达水平。结果 与正常组比较,模型组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平显著升高（P<0.01）;与模型组比较,各用药组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平均有不同程度下降（P<0.01）;组间比较发现,痰瘀同治组TLR4,NF-κB p65,IκBα及TNF-α蛋白和mRNA表达水平比化瘀组和化痰组下降更明显（P<0.05,P<0.01）。结论 痰瘀同治法能够改善糖尿病大鼠心肌炎症病变,且效果优于单独使用化痰法或化瘀法,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/IκB信号通路的激活有关。     

补肾化痰方对OVX诱导的骨质疏松大鼠血清LPS及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 研究补肾化痰方对双侧卵巢切除术（OVX）诱导的骨质疏松大鼠脂多糖（LPS）及Toll样受体4（TLR4）/髓样细胞分化蛋白88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响。方法 将60只SPF级6月龄的雌性大鼠随机分为假手术组,模型组,戊酸雌二醇组,补肾化痰方低、中、高剂量组,使用双侧OVX造模,造模后1周,每组中挑选8只,戊酸雌二醇组按0.184 mg·kg^-1,补肾化痰方低、中、高剂量组分别按4.7,9.4,18.8 g·kg^-1灌胃,假手术与模型组给予0.9%生理盐水4 mL灌胃,干预12周后处死取材。运用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清LPS含量,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测骨组织中TLR4,MyD88,磷酸化（p）-NF-κB p65的蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测骨组织中TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平及通路相关炎症因子白细胞介素（IL）-1β,IL-6 mRNA的表达。结果 与假手术组比较,模型组的血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65蛋白表达水平,TLR4,MyD88,NF-κB p65,IL-1β,IL-6 mRNA水平均明显升高（P<0.05）;与模型组比较,戊酸雌二醇组和补肾化痰方高剂量组血清LPS水平,骨组织中TLR4,MyD88,p-NF-κB p65的蛋白表达,TLR4,MyD88,NF-κB p65 mRNA水平,以及下游炎症因子IL-1β,IL-6 mRNA水平有不同程度降低（P<0.05）。结论 补肾化痰方可以降低血清LPS含量,调控TLR4/MyD88/NF-κB通路中TLR4,MyD88,NF-κB p65,p-NF-κB p65的mRNA水平及蛋白表达,降低骨组织中IL-1β,IL-6 mRNA水平,改善骨微结构,抑制绝经后骨质疏松症的病情发展。     

基于NF-κB信号通路探讨苓桂术甘汤对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的抗炎保护作用

目的 观察苓桂术甘汤对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（ALI）模型小鼠的疗效及相关作用机制。方法 将72只7周龄SPF级C57BL/6小鼠按体质量随机分为正常组、模型组、地塞米松组（5 mg·kg^-1）、苓桂术甘汤高、中、低剂量组（9.36、4.68、2.34 g·kg^-1）,每组12只。除正常组外,其余各组采用鼻滴法予LPS（50 μg/只）构建小鼠ALI模型。给药组分别在造模前连续灌胃给药7 d。造模后12 h取小鼠肺组织,测定双肺湿/干质量比（W/D）;苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织病理形态学变化;支气管肺泡灌洗液（BALF）采用细胞计数仪计算总细胞数,瑞氏吉姆萨染色检测炎性细胞的分类（中性粒细胞、巨噬细胞）与数量;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测BALF中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的表达水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测核转录因子-κB（NF-κB）炎症通路中NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、NF-κB p65及二者磷酸化蛋白的表达,并计算磷酸化蛋白/总蛋白比值。结果 与正常组比较,模型组小鼠肺组织严重损伤,肺泡完整结构被破坏,肺泡壁增厚,大量炎性细胞与红细胞浸润,肺水肿显著加重（P<0.01）。BALF中总细胞与炎性细胞数量,IL-6、TNF-α及肺组织NF-κB p65、IκBα磷酸化蛋白表达显著上调（P<0.01）;与模型组比较,苓桂术甘汤高、中、低剂量组与地塞米松组小鼠肺损伤明显缓解,肺水肿显著减轻（P<0.01）。BALF中总细胞与中性粒细胞数量,IL-6、TNF-α及肺组织NF-κB p65、IκBα磷酸化蛋白表达显著下调（P<0.01）,巨噬细胞数量明显减少（P<0.05）。结论 苓桂术甘汤对LPS-ALI小鼠具有抗炎保护作用,能有效减轻炎症、利水消肿,其机制可能与抑制NF-κB通路活化有关。     

五味消毒饮对脂多糖诱导大鼠肾系膜细胞NF-κB信号通路的影响

目的 观察五味消毒饮对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肾系膜细胞（HBZY-1）核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响，并探讨其作用机制。方法 将大鼠肾系膜细胞随机分为正常组、模型组、贝那普利组（50 μmol·L^-1）、五味消毒饮高、低剂量组（2.75、0.69 g·kg^-1）。正常组、模型组、贝那普利组使用10%正常大鼠血清，五味消毒饮高、低剂量组使用10%含药血清。除正常组外，其余4组给予LPS（100 μg·L^-1）以体外干预。倒置显微镜观察细胞形态的变化；免疫荧光法（IF）检测NF-κB p65的表达；噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活力；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞中白细胞介素-1β（IL-1β）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、层粘连蛋白（LN）和纤连蛋白（FN）的含量；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测细胞中IL-1β、FN、NF-κB p65 mRNA的表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶β（p-IKKβ）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（p-IκBα）、NF-κB p65蛋白的表达。结果 与正常组比较，模型组细胞增殖显著增多（P<0.01），细胞上清中IL-1β、ICAM-1、LN、FN的含量显著增多（P<0.01），IL-1β、FN、NF-κB p65 mRNA表达显著升高（P<0.01），p-IKKβ、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组细胞增殖明显降低（P<0.05，P<0.01），细胞上清中IL-1β、ICAM-1、LN、FN的含量明显减少（P<0.05，P<0.01），IL-1β、FN、NF-κB p65 mRNA的表达明显降低（P<0.05，P<0.01），p-IKKβ、p-IκBα、NF-κB p65蛋白的表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 五味消毒饮可减轻由LPS诱导的肾系膜细胞损伤，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的启动有关。     

黄芩-黄连通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路稳定动脉粥样硬化的易损斑块

目的 观察黄芩-黄连对动脉粥样硬化（AS）小鼠斑块稳定性的影响,并基于Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路探讨其可能的作用机制。方法 10只正常C57BL/6J小鼠作为正常组,同品系的载脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠高脂饲料喂养12周构建动脉粥样硬化模型,随机分为5组,即模型组、阿托伐他汀组、黄芩-黄连低、中、高剂量组,每组10只。正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,黄芩-黄连低、中、高剂量组分别给予1.95、3.9、7.8 g·kg^-1药物灌胃8周。观察小鼠一般状态;苏木素-伊红（HE）染色观测主动脉根部斑块病理情况并计算斑块面积百分比;马松（Masson）染色、油红O染色联合F4/80、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化检测主动脉根部斑块组分并计算斑块易损指数;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）的表达水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠主动脉组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平。结果 与模型组比较,各用药组小鼠一般状态改善,未见明显不良反应;与模型组比较,黄芩-黄连中、高剂量组AS小鼠主动脉根部斑块面积百分比明显降低（P<0.05）;黄芩-黄连高剂量组斑块中胶原纤维及平滑肌细胞含量显著增多（P<0.01）,脂质及巨噬细胞含量明显减少（P<0.05）,黄芩-黄连各剂量组斑块易损指数明显降低,其中黄芩-黄连中、高剂量组显著降低（P<0.01）;黄芩-黄连中、高剂量组主动脉组织中MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达水平明显降低（P<0.05）;黄芩-黄连中、高剂量组AS小鼠血清中TNF-α、IL-6水平明显降低（P<0.05）;黄芩-黄连中、高剂量组主动脉组织中TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达水平明显降低（P<0.05）,其NF-κB p65磷酸化水平明显降低（P<0.05）。结论 黄芩-黄连可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗炎稳斑的作用。     

白芍总苷调节TLR9/MyD88/NF-κB通路改善系统性红斑狼疮小鼠肾脏损伤

目的 基于Toll样受体9/髓样分化因子88/核转录因子-κB（TLR9/MyD88/NF-κB）信号通路研究白芍总苷（TGP）对MRL/lpr狼疮模型小鼠肾脏损伤的干预作用，探讨TGP防治系统性红斑狼疮（SLE）的部分免疫学机制。方法 将SPF级MRL/lpr雌性小鼠随机分为4组，模型组、地塞米松组（0.15 g·kg^-1）、TGP高、低剂量组（0.078、0.039 g·kg^-1），雌性C57BL/6J小鼠设为空白组，每组7只；各组小鼠每天同一时间段给予相应药物或生理盐水灌胃。4周后采集标本，称取肾脏、脾脏质量，计算脏器指数；生化分析法检测各组血清肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）水平；苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠肾脏组织病理学变化；马松（Masson）染色评估小鼠肾脏组织纤维化程度；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清白细胞介素（IL）-2、干扰素-α（IFN-α）、IL-4和抗核抗体（ANA）的水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肾组织中TLR9、MyD88、NF-κB p65的mRNA表达；免疫荧光法检测肾组织中TLR9、NF-κB p65蛋白表达；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾、脾组织中TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达水平。结果 与空白组比较，模型组小鼠SCr、BUN及脾脏指数和肾脏指数明显升高（P<0.05），肾组织病理损伤和纤维化程度明显增强；血清IFN-α、IL-4及ANA水平显著升高，IL-2水平明显降低（P<0.05）；肾脏和脾脏中TLR9、MyD88及NF-κB p65的mRNA和蛋白水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较，TGP高、低剂量组小鼠SCr、BUN及脾脏指数和肾脏指数明显降低（P<0.05），肾组织病理损伤和纤维化程度明显减轻；血清IFN-α、IL-4及ANA水平明显下降（P<0.05），IL-2水平明显升高；肾脏和脾脏组织中TLR9、MyD88和NF-κB p65等分子mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。结论 TGP可能通过调控TLR9/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制其下游相关炎症因子表达，发挥免疫调节及抗SLE肾脏损伤作用。     

基于TLR4/NF-κB通路探讨蛤蚧提取物对利血平诱导抑郁大鼠神经炎症的影响

目的 观察蛤蚧提取物的抗抑郁作用,并探讨其作用机制。方法 腹腔注射利血平（0.5 mg·kg^-1）诱导大鼠抑郁模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组,氟西汀组（1.8 mg·kg^-1）,蛤蚧提取物高、低剂量组（12,6 g·kg^-1）,分别给予相应剂量药物,1次/d,连续给药10 d。给药结束后,通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测大鼠血清和前额皮层中神经递质及炎症因子的水平;通过苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠海马组织中细胞的变化情况;通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠海马组织中白细胞介素-6（IL-6）,核转录因子-κB（NF-κB）,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的水平;通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠海马组织中Toll样受体4（TLR4）,NF-κB蛋白水平。结果 与正常组比较,蛤蚧提取物能明显缩短大鼠的悬尾不动时间和游泳不动时间;与模型组比较,蛤蚧提取物能明显减少大鼠眼睑下垂现象和圈内保留时间（P<0.05）;升高血清中5-羟色胺（5-HT）,多巴胺（DA）的水平（P<0.05）,降低血清和前额皮层中MAO,IL-6,TNF-α的水平（P<0.05）;降低大鼠海马组织中炎症因子IL-6,NF-κB,TNF-α mRNA的水平以及TLR4,NF-κB蛋白的表达（P<0.05,P<0.01）;改善大鼠海马组织的病理症状。结论 蛤蚧提取物通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低大鼠海马组织中NF-κB,IL-6等炎症因子的表达,减轻抑郁病理损伤,从而减轻抑郁症状。     

基于NF-κB炎症通路探讨五味消毒饮对IgA肾病大鼠的抗炎机制

目的 观察五味消毒饮对免疫球蛋白（Ig）A肾病（IgAN）大鼠核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响，并探讨其治疗IgA肾病的作用机制。方法 将40只SD大鼠随机分为正常组，模型组，贝那普利组（10 mg·kg·d^-1），五味消毒饮组（2.75 g·kg·d^-1），每组10只。采用牛血清白蛋白（BSA）灌胃，四氯化碳（CCl₄）皮下注射以及脂多糖（LPS）尾静脉注射方法共9周建立IgAN大鼠模型，各组给予相应剂量的药物灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水，连续给药28 d。检测大鼠24 h尿蛋白（UTP），血肌酐（SCr），尿素氮（BUN），血清白蛋白（ALB）水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1β（IL-1β），白细胞介素-6（IL-6）的含量，苏木素-伊红（HE）染色，免疫荧光及透射电镜观察肾脏病理改变，免疫组化法（IHC），实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测肾组织中IL-6，IκB激酶β（IKKβ），磷酸化IκB激酶β（p-IKKβ），NF-κB抑制蛋白α（IκBα），磷酸化NF-κB抑制蛋白α（p-IκBα），NF-κB p65，磷酸化NF-κB p65（p-p65）的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠UTP水平显著升高（P<0.01），肾小球系膜细胞增生，系膜基质增多，系膜增厚，电子致密物沉积增多，大量IgA沉积于肾小球系膜区并呈现不规则颗粒及团块状分布；血清中TNF-α，IL-1β，IL-6水平显著升高（P<0.01）；肾组织中IL-6，IKKβ，p-IKKβ、IκBα，p-IκBα，NF-κB p65，p-p65的表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠UTP水平显著降低（P<0.01），肾组织损伤情况均有所减轻；血清中TNF-α，IL-1β，IL-6水平显著降低（P<0.01）；肾组织中IL-6，IKKβ，p-IKKβ，IκBα，p-IκBα，NF-κB p65，p-p65的表达显著降低（P<0.01）。各组间SCr，BUN，血清白蛋白相比无明显差异。结论 五味消毒饮可降低IgAN大鼠的蛋白尿，其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路及其相关炎症因子的过度表达有关。     

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨通络蠲痹颗粒对骨关节炎炎症损伤和细胞凋亡的影响

目的 观察通络蠲痹颗粒对膝骨关节炎（KOA）兔软骨细胞凋亡及Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响,研究其防治KOA的作用机制。方法 30只新西兰兔按随机数字表法分为假手术组、模型组、通络蠲痹颗粒低、高剂量组（4.1、8.2 g·kg^-1·d^-1）、塞来昔布组（10.9 mg·kg^-1·d^-1）,每组6只。采用内侧半月板失稳法（DMM）建立兔KOA模型,造模6周后给药,干预8周,每日1次。用苏木素-伊红（HE）染色和番红O-固绿染色观察关节软骨病理改变;原位末端标记法（TUNEL）荧光染色检测关节软骨细胞凋亡;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测关节液中白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果 与假手术组比较,模型组关节软骨退变严重,Mankin评分升高（P<0.01）,关节液IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.01）,软骨细胞凋亡数量增加（P<0.01）,软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA和蛋白表达上调（P<0.01）,而Bcl-2的mRNA及蛋白表达下调（P<0.01）;与模型组比较,通络蠲痹颗粒低、高剂量组软骨退变得到改善,Mankin评分降低（P<0.01）,IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.01）,软骨细胞凋亡数量减少（P<0.01）,软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65的mRNA和蛋白表达下调（P<0.01）,Bcl-2的mRNA及蛋白表达上调（P<0.01）,且在上述观察指标中通络蠲痹颗粒高剂量组均明显优于低剂量组。结论 通络蠲痹颗粒可抑制KOA兔关节软骨细胞凋亡,改善软骨退变,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。