人牙周膜成纤维细胞与牙龈成纤维细胞差异表达基因的批量克隆及其特征分析

目的：克隆人牙周膜成纤维细胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＰＤＬＦ）与牙龈成纤维细胞（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＧＦ）差异表达基因并初步分析其中已知基因的功能特征。方法：采用基于ＰＣＲ和消减杂交的基因克隆技术构建人ＰＤＬＦ与ＧＦ差异表达基因的扣除文库，克隆人ＰＤＬＦ与ＧＦ差异表达基因，对已知基因的功能特征进行分析。结果：成功克隆到１４个人ＰＤＬＦ与     

成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞群及克隆钙化的作用

目的观察碱基成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）对牙周膜（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ，ＰＤＬ）细胞克隆体外钙化的作用。方法对３颗前磨牙的牙周膜细胞进行细胞克隆化，观察ｂＦＧＦ对ＰＤＬ细胞克隆钙化能力的影响，测定细胞牙骨质附着蛋白（ｃｅｍｅｎｔｕｍｄｅｒｉｖｅｄａｔａｃｈｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＡＰ）的结合力及碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）的表达。结果ｂＦＧＦ使ＰＤＬ细胞克隆钙化率增加了１１％。ｂＦＧＦ依赖性钙化克隆与非ｂＦＧＦ依赖性钙化克隆相比具有较低的ＡＬＰ表达率和较高的ＣＡＰ结合力。结论ｂＦＧＦ可在体外促进ＰＤＬ细胞克隆钙化的形成，ｂＦＧＦ依赖与非依赖性钙化克隆是不同的细胞种群。     

转化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞的生物学作用

目的 研究转化生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β,ＴＧＦ－β）对人牙周膜成纤维细胞（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ,ＨＰＤＬＦｓ）的生物学作用。方法 原代培养ＨＰＤＬＦｓ,并观察ＴＧＦ－β对ＨＰＤＬＦｓ的增殖、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ,ＡＬＰ）活性、骨钙素（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ,ＯＣ）合成及矿化结节形成的作用。结果 ０．００５０～０．１０００ｍｇ／ＬＴＧＦ－β可明显刺激ＨＰＤＬＦｓ的增殖,０．００５０ｍｇ／ＬＴＧＦ－β可显著提高ＨＰＤＬＦｓ的ＡＬＰ活性,０．０００５～０．１０００ｍｇ／ＬＴＧＦ－β对ＨＰＤＬＦｓ合成ＯＣ和矿化结节的形成无明显影响。结论 ＴＧＦ－β对ＨＰＤＬＦｓ的作用呈剂量依赖性。ＴＧＦ－     

固齿散对体外培养人牙龈成纤维细胞的影响

通过体外培养人牙龈成纤维细胞（ｈｕｍａｎ ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＨＧＦｓ），对固齿散的作用机理进行了初步探讨。结果表明，０．０１ｇ／Ｌ和Ｉｇ／Ｌ的固齿散浸出液对ＨＧＦｓ的生长和形态无明显影响，１ｇ／Ｌ的固齿散浸出液对ＨＧＦｓ的分裂指数和ＤＮＡ含量有一定促进作用（Ｐ〈０．０５）。无研究提示，固齿散中含有可刺激ＨＧＦｓ分裂促进其ＤＮＡ合成的物质。     

碱性成纤维细胞生长因子对人牙髓细胞增殖和分化的作用

目的 探讨碱笥成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ｂＦＧＦ）对培养人牙髓细胞增殖和分化的效应。方法 采用四唑盐法、^3Ｈ－ＴｄＲ掺入法、图象分析,检测重组人ｂＦＧＦ（ｈｂＦＧＦ）对细胞ＤＮＡ、胶原蛋白、纤维为连蛋白、碱笥磷酸酶、骨形成蛋白合成和凝集素表达的影响。结果 ｈｂＦＧＦ浓度在１～１０μｇ／Ｌ时显著促进细胞增殖,浓度为１～１００μｇ／Ｌ）,Ⅰ型胶原     

咬合力丧失对大鼠磨牙牙周膜bFGF表达的影响

目的 研究咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ，ＰＤＬ）内碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了ｂＦＧＦ与Ⅱ型胶原ｍＲＮＡ表达的关系。方法 采用拔牙法建立咬合力丧失的动物模型，应用免疫组织化学法研究其磨牙牙周膜内ｂＦＧＦ表达的动态变化。结果 在１天、２天、３天、１周与     

牙龈成纤维细胞的肝细胞生长因子分泌方式的实验观察

目的：观察牙龈成纤维细胞的肝细胞生长因子（ＨＧＦ／ＳＦ）的分泌方式。方法：培养牙龈成纤维细胞;制作该细胞胶原网架（ＦＰＣＬｓ）,将ＦＰＣＬｓ分组,从ＦＰＣＬ形成后的０～７ｄ,每天从３个不同角度测量ＦＰＣＬ的直径缩小值。结果：不含血清培养液（ＳＦＭ）组与ＳＦＭ＋ｒＨＧＦ组ＦＰＣＬ的收缩变化都很小,两组间无差异（Ｐ〉０．０５）;而含血清培养液（ＳＣＭ）组的收缩变化非常大,与其它两组间具有极显著差异（Ｐ     

人牙周膜成纤维细胞与牙龈成纤维细胞差异表达基因扣除文库的构建

目的建立人牙周膜成纤维细胞(periodontalligamentfibroblast,PDLF) 与牙龈成纤维细胞(gin-givalfibroblast,GF)差异表达基因的扣除文库。方法体外培养人PDLC和GF,分别提取mRNA,采用基于PCR和消减杂交的基因克隆技术构建人PDLC与GF差异表达基因的扣除文库。结果成功构建了人PDLF与GF细胞差异表达基因的扣除文库,文库容量为4×l02。结论基于PCR和消减杂交的基因克隆技术是构建细胞间差异表达基因扣除文库的较为简洁而有效的方法。     

胰岛素样生长因子—Ⅰ对培养人牙周膜成纤维细胞生物学活性？…

胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）可通过直接作用于成骨细胞或通过甲状腺素影响骨代谢过程而参与骨的改建。本文利用细胞增养技术观察了ＩＧＦ－Ｉ对培养人牙周膜成纤维细胞（ＰＤＬＦｓ）增殖、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性变化以及蛋白质含量改变的影响。结果显示，ＩＧＦ－Ｉ对ＰＤＬＦｓ有明显的促增殖作用，对ＰＤＬＦｓ的ＡＰＬ活性、蛋白质合成也具有较强的促进作用，表明ＩＧＦ－Ｉ可能通过ＰＤＬＦｓ发挥其调节牙槽骨改建的作用，从     

胰岛素样生长因子-Ⅱ对培养人牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响

目的：研究ＩＧＦ－ＩＩ对培养人牙周膜成纤维细胞（ＰＤＬＦ）生物学活性的影响,方法：接种一定量培养至第５代的人ＰＤＬＦ,用ＭＴＴ法和碱性磷酸酶比色法观察ＩＧＦ－ＩＩ作用下,ＰＤＬＦ的增殖和碱性磷酸酶活性的变化。结果：ＩＧＦ－ＩＩ在实验浓度范围内,对ＰＤＬＦ有较明显的促增殖作用,对ＰＤＬＦ的ＡＬＰ活性具有较强的促进作用。结论：ＩＧＦ－ＩＩ对ＰＤＬＦ的生物学活性有一定的影响,揭示其可能通过ＰＤＬＦ发挥其     

先天性牙根发育不良致病相关基因的筛选

目的:筛选先天性牙根发育不良的致病相关基因.方法:采用改良消减杂交技术,以先天性牙根发育不良患儿及其正常兄弟为研究对象,制备血液基因表达cDNA文库,构建两者的差异表达文库,采用反向点杂交技术剔除假性克隆,挑取部分克隆进行定性测序.结果:构建的差异表达基因文库浓度为4.0×102,反向点杂交检测发现基因文库质量较好:获得了11个与先天性牙根发育不良疾病相关的基因克隆.结论:成功构建了先天性牙根发育不良致病相关基因的消减cDNA文库,推测筛选出的ADAM28和MCPR1可能是牙根发育不良的致病相关基因.     

用消减杂交技术克隆人成骨样细胞机械牵张力敏感基因的研究

目的　对人成骨样细胞机械牵张力敏感基因进行克隆研究。方法　对人成骨样细胞Saos-2进行二维方向上的加载,变形幅度为12%,牵拉频率为6周期/分钟,加载12 h后分别提取牵张力作用后Saos-2细胞及未作处理的正常Saos-2对照细胞的mRNA,反转录制备cDNA,将cDNA进行消减杂交,构建加载细胞与未加载细胞的差异表达基因的扣除cDNA文库,克隆后进行序列测定。结果　克隆到的基因片段中,功能已知基因片段15个,功能未知基因片段2个,其中牵张力敏感基因1(SSG1)位于9号染色体上,功能未知;牵张力敏感基因2(SSG2)位于18号染色体上,与转录因子2,4高度同源。结论　用消减杂交技术可以对人成骨细胞样机械牵张力敏感基因进行有效的克隆研究。     

牙根发育不全疾病致病差异表达基因文库的建立

目的：建立先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟间致病差异表达基因的cDNA文库。方法：采用改良消减杂交技术，以先天性牙根发育不全疾病患儿与其正常兄弟外周静脉血的总mRNA为对比材料，筛选出候选相关致病基因差异表达的cDNA，将其与pGEM-T载体进行T／A连接构建文库，然后转化高效感受态大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取100个白色克隆进行酶切鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆，随机挑取的100个白色克隆经酶切后90％有插入片段。结论：用改良消减杂交技术成功构建了先天性牙根发育不全疾病致病差异表达基因的消减cDNA文库，该文库的建立为进一步筛选、克隆该疾病的候选致病相关基因奠定了基础。     

利用抑制消减杂交技术构建变形链球菌高毒力株特异的基因文库

目的　构建c血清型变形链球菌高毒力株特异的基因文库,为变形链球菌毒力基因的筛选奠定基础。方 法　从一对c血清型变形链球菌高、低毒力株中提取基因组DNA,用四碱基限制性内切酶酶切,以高毒力株的DNA 酶切产物为tester DNA,低毒力株的DNA酶切产物为driver DNA,tester DNA连接接头后与driver DNA进行抑制消减 杂交,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物与pCR2.1载体连接,转化E.coliTOP10F′感受态细胞, 进行蓝白筛选。结果　从识别四碱基序列的限制性内切酶中,筛选出AluⅠ,用于制备变形链球菌基因组DNA的 代表性片段,产生的酶切产物位于0·1~2.0 kb。tester DNA与接头的连接效率大于25%,抑制消减杂交后消减效率 检测显示,同时存在于tester与driver DNA中的23S rRNA基因在消减组中出现时间较未消减组晚6个循环,将消减 PCR产物克隆后,挑取96个转化子,构建高毒力株特异的基因文库。结论　利用抑制消减杂交技术,进行c血清型 变形链球菌高、低毒力株之间基因组DNA的比较,初次构建了高毒力株特异的基因文库。     

牙齿形状调控相关基因Wnt6的克隆

目的 :获得新生猪牙胚的差异表达基因。方法 :利用消减杂交方法获得新生猪前后恒牙胚的差异表达基因 ,并通过反向点杂交排除假阳性 ,尔后进行测序定性分析。结果 :通过消减杂交获得Wnt6基因。结论 :Wnt6可能在决定牙齿形状发育的分子调控网络中起重要作用     

人牙胚cDNA文库的筛选和Hevin cDNA的克隆

目的：筛选人牙胚cDNA文库,考察Hevin在牙齿发育过程中是否表达,方法：以Ｈevin的一段编码序列作为探讨筛选人牙胚cDNA文库,挑取阳性噬菌斑,将其转化为质粒ＤＮＡ,再通过限制性酶切和部分核苷酸序列分析的方法鉴定阳性克隆。结果：从人牙胚cDNA文库中筛选到一个阳性克隆,序列分析结果证实为Hevin的cDNA。结论：克隆到Hevin基因的部分cDNA序列,说明Hevin在牙胚发育过程中确有表达。     

Isolation and partial sequencing of potentially odontoblast-specific/enriched rat cDNA clones obtained by suppression subtractive hybridization

Odontoblasts, which are responsible for dentine formation, are known to synthesize unique gene products such as dentine sialophosphoprotein. To further identify and clone novel odontoblast-specific genes, a suppression subtractive hybridization technique was used here. Differentially or predominantly expressed cDNAs in odontoblasts of rat incisors were obtained by subtracting the common cDNAs expressed in odontoblasts, osteoblasts and pulp cells. Clones were then partially sequenced and analysed for nucleotide sequence homology by the basic local alignment search tool program. From a total of 1290 clones analysed, 538 odontoblast-enriched clones were identified in the subtracted cDNA library. Out of 538 clones, 498 clones (92.6%) demonstrated high identity with genes in the GenBank database. In contrast, 31 clones (5.7%) showed low sequence identity with known genes, among which 18 clones (3.3%) were observed more than once, thereby possibly representing odontoblast-specific/enriched genes. The majority (390 clones; 72.5%) of the clones with high homology to known genes were found to be the rat/mouse dentine sialophosphate by dot-blot analysis (326 clones) and sequencing (64 clones). The second highest enrichment (39 clones) was for phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X-chromosome, which codes for a neutral endopeptidase. After suppression subtractive hybridization, several cDNAs that are commonly present in osteoblasts and odontoblasts appeared unsuppressed. Therefore, a rat odontoblast-specific/enriched subtraction cDNA library has been created from which a number of potentially novel genes for odontoblasts could be identified.     

Identification of genes differentially expressed in cultured human periodontal ligament fibroblasts vs. human gingival fibroblasts by DNA microarray analysis

Despite their similar spindle-shaped appearance, periodontal ligament fibroblasts (PDLF) and gingival fibroblasts (GF) appear to display distinct functional activities in the maintenance of tissue integrity and during inflammatory/immune responses. We postulated that different characteristics of PDLF and GF are defined by the differential expression of specific genes. To test this, we investigated the possible variance of gene expression profile between cultured PDLF and GF, using DNA microarray technology. One hundred sixty-three genes were found differentially expressed by at least three-fold between PDLF and GF. Genes encoding transmembrane proteins and cytoskeleton-related proteins tended to be up-regulated in PDLF, whereas genes encoding cell-cycle regulation proteins and metabolism-related proteins tended to be up-regulated in GF. We concluded that PDLF and GF appear to display different gene expression patterns that may reflect intrinsic functional differences of the two cell populations and may well coordinate with their tissue-specific activities.