转化生长因子β1在调节小细胞肺癌耐药细胞对化学治疗药物耐药性中的作用及临床意义

目的： 探讨转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)在调节小细胞肺癌多药耐药中的作用， 并分析其表达与临床预后的关系。 方法：采用实时荧光定量PCR法及Western印迹检测小细胞肺癌敏感细胞株H69和 耐药细胞株H69AR中TGF-β1的表达，应用siRNA抑制耐药细胞株H69AR中的TGF-β1表达，采用CCK8检测细胞对各 种化学治疗药物的敏感性；应用实时荧光定量PCR及免疫组织化学方法检测小细胞肺癌患者组织标本及癌旁组织中 TGF-β1的表达，并分析TGF-β1与小细胞肺癌患者预后的关系。结果：与细胞株H69比较，TGF-β1 mRNA在细胞株 H69AR中的表达升高了(5.93±0.47)倍(t=8.986，P<0.01)；TGF-β1蛋白在细胞株H69AR中的表达明显增加了(8.49±1.92) 倍(t=4.127，P<0.01)。转染siRNA后，细胞株H69AR中TGF-β1的表达下降了70.432%(F=21.20，P<0.01)；细胞对化学治 疗药物的敏感性增加(t=4.576，P<0.05)；与癌旁组织比较，TGF-β1在小细胞肺癌组织中的表达明显增高(t=13.925， P<0.01)。TGF-β1的表达与疾病的分期、患者的生存时间及化学治疗的敏感性有关(均P<0.05)；与患者的性别、年龄无 关(均P>0.05)。结论：TGF-β1参与了调节小细胞肺癌的多药耐药，TGF-β1可作为评估小细胞肺癌化学治疗敏感性及临床 预后的潜在靶基因。     

同源异型盒基因HOXA5对小细胞肺癌细胞多药耐药性的影响

目的研究同源异型盒基因HOXA5的变化对小细胞肺癌多药耐药性的影响,并探讨其作用机制,评价其作为小细胞肺癌
临床治疗靶点的可能性。方法实时荧光定量PCR 和免疫印迹法检测小细胞肺癌细胞H69 和多药耐药细胞株H69AR中
HOXA5 mRNA和蛋白水平,采用表达质粒和siRNA升高或降低HOXA5基因表达水平,CCK8法分析细胞对小细胞肺癌常用
化疗药物顺铂（Cisplatin,DDP）和足叶乙甙（Etoposide,VP-16）敏感性的变化。结果H69细胞中HOXA5 mRNA水平是耐药细
胞株H69AR中的8.99倍。HOXA5 siRNA显著降低H69细胞中HOXA5的表达水平,降低了H69细胞对DDP和VP-16的敏感
性。将HOXA5表达质粒稳定转染入H69AR细胞,建立稳定转染细胞株,细胞对DDP和VP-16敏感性增加。结论HOXA5可
能参与了小细胞肺癌耐药过程,可能会成为小细胞肺癌临床治疗的新靶点。
     

人小细胞肺癌细胞新耐药基因的探索

【摘要]目的：筛选小细胞肺癌耐药相关的基因,为小细胞肺癌多耐药的诊断及治疗寻找理想靶标。方法：从基因芯片结果中筛选人小细胞肺癌多耐药细胞株H69AR相对亲本H69细胞高表达的基因FZD1、GLI1、FRZB,并使用QRT-PCR验证,QRT-PCR分析三种基因在6例化疗前与产生耐药时小细胞肺癌患者血液标本中的表达状况。结果：基因芯片证实FZD1、GLI1、FRZB在H69AR细胞相对H69细胞高表达9.19、4.33、6.88,QRT-PCR验证得出一致的结果,6例小细胞肺癌患者耐药时血液标本的FZD1、GLI1、FRZB表达水平明显高于化疗前。结论：FZD1、GLI1、FRZB基因可能做为逆转小细胞肺癌多耐药的理想靶点。     

E2F-1与小细胞肺癌多药耐药及预后的相关性

摘要：目的  探讨E2F-1在小细胞肺癌（SCLC）多药耐药中的作用及其与预后的关系。方法  检测92例SCLC患者肿瘤组织中E2F-1的表达，分析E2F-1 mRNA表达对患者生存时间的影响，培养人SCLC敏感细胞株H69和多药耐药细胞株H69AR，分为E2F-1过表达组、阴性对照组和空白对照组，检测不同转染组细胞药物敏感性。结果  SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P <0.05）；低表达组患者中位生存时间与高表达组比较，差异有统计学意义（P <0.05）；E2F-1过表达组H69细胞对阿霉素、顺铂和依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05），而E2F-1干扰组H69AR细胞对阿霉素、顺铂及依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P <0.05）。结论  E2F-1在SCLC组织中呈高表达，下调E2F-1可增强多药耐药细胞株H69AR对化疗药物敏感性。

     

小细胞肺癌Nrf2与c-myc癌基因表达的相关性研究

目的：探讨小细胞肺癌c-myc癌基因的表达对Nrf2表达的影响,分析c-myc与Nrf2表达的相关性。方法：选用两株耐药性不同的肺小细胞癌肿瘤细胞株,小细胞肺癌药物敏感株H69及耐药株H69AR,Westem-B10t方法比较Nrf2,c-myc在两株细胞间的表达差异;H69细胞通过Lipofectamine2000脂质体转染过表达c-myc,Western-Blot方法检测过表达c-mvc前后Nrf2蛋白表达变化;H69AR细胞通过Lipofectamine2000脂质体转染c-mvcsiRNA,Westel33-B10t方法检测c-mycsiRNA前后Nrf2的蛋白表达变化。结果：与H69细胞相比,H69AR细胞株中c-myc及Nrf2高表达;H69细胞c-myC转染后,Nrf2表达上调;H69AR细胞c-mycsiRNA干扰后,Nrf2表达下调。结论：小细胞肺癌中Nrf2的表达与c-mvc表达呈正相关。     

抑制miR-21对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡的影响及可能机制探讨

目的:探讨抑制miR-21表达对非小细胞肺癌耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡的影响及可能的机制?方法:应用Real-time PCR技术分别检测人非小细胞肺癌细胞株A549及其耐药株A549/DDP中miR-21的表达;将miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor) ASO-21转染至A549/DDP中,下调其miR-21的表达,在不同时间点使用MTT检测细胞的增殖,流式细胞仪Annexin-FITC检测细胞凋亡;使用生物信息学和miR的预测软件预测miR-21在非小细胞肺癌中的可能靶点?结果:①miR-21在A549/DDP细胞株的表达均为A549的3倍;②A549/DDP细胞株中转染ASO-21孵育,加入顺铂后,与对照组相比,其凋亡增加,增殖能力明显降低;③生物信息学软件分析后发现miR-21在非小细胞肺癌A549有多个调节靶点,一些蛋白分子可以调节miR-21的表达,组成肿瘤细胞的调节网络而影响肺癌细胞对顺铂的敏感性?结论:抑制miR-21可以促进顺铂耐药细胞A549/DDP的凋亡增加及抑制其增殖,miR-21可能成为逆转肺癌对顺铂耐药的新靶点?     

MRP的表达与非小细胞肺癌耐药性的关系

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)的化疗耐药性和参与介导多药耐药的相关基因和蛋白(MRP)的表达,对比分析非小细胞肺癌的多药耐药性与三种耐药相关基因表达的关系。方法应用肿瘤细胞体外培养和药敏实验法对91例未经化疗的非小细胞肺癌进行体外化疗药物敏感性测试,观察非小细胞肺癌分别对环磷酰胺、阿霉素、顺铂 氟尿嘧啶三种单药和联合用药方案耐药情况和总的耐药情况,并用免疫组织化学方法对其进行MRP基因表达的检测,并将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关分析。结果91例NSCLC化疗敏感性检测结果显示:53例(58.2%)对环磷酰胺耐药,51例(56.0%)对阿霉素耐药,42例(46.2%)对顺铂 氟尿嘧啶耐药。其中,19例(20.9%)对三种用药均敏感,27例(29.8%)对三种用药均耐药,尚不能认为其耐药性与组织学类型和分化程度有关(P>0.05)。MRP在91例非小细胞肺癌中总的阳性表达率为73.6%。鳞癌和腺癌相比MRP的表达差异无统计学意义(P>0.05),而且MRP的表达与对三种化疗用药的耐药性均呈正相关(P<0.05),并且不同表达程度间差异也有统计学意义(P<0.05)。结论MRP在非小细胞肺癌中均有较高的阳性表达并共同介导参与了非小细胞肺癌固有的多药耐药机制。     

LRP的表达与非小细胞肺癌耐药性的关系

目的探讨非小细胞肺癌的化疗耐药性和参与介导多药耐药的相关基因LRP和蛋白的表达,对比分析非小细胞肺癌的多药耐药性与LRP的关系。方法应用肿瘤细胞体外培养和MTT法对91例未经化疗的非小细胞肺癌进行体外化疗药物敏感性测试,观察非小细胞肺癌分别对环磷酰胺、阿霉素、顺铂 氟尿嘧啶三种单药和联合用药方案耐药情况和总的耐药情况,并用免疫组织化学方法对其进行LRP表达的检测,并将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关分析。结果91例NSCLC化疗敏感性检测结果显示:53例(58.2%)对环磷酰胺耐药,51例(56.0%)对阿霉素耐药,42例(46.2%)对顺铂 氟尿嘧啶耐药。其中,19例(20.9%)对三种用药均敏感,27例(29.8%)对三种用药均耐药,其耐药性与组织学类型和分化程度无关(P>0.05)。LRP在91例非小细胞肺癌中总的阳性表达率为53.8%鳞癌和腺癌相比LRP的表达无显著性差异(P>0.05)。且LRP的表达与三种化疗用药的耐药性均呈显著正相关(P<0.05),并且不同表达程度间也有显著差异性(P<0.05)。结论LRP在非小细胞肺癌中均有较高的阳性表达并参与介导了非小细胞肺癌固有多药耐药机制。     

Thapsigargin逆转K562/A02细胞多药耐药性的实验研究

目的 探讨内质网Ca^2 -ATP酶抑制剂thapsigargin对白血病多药耐药细胞株K562／A02化疗敏感性的影响。方法 用MTT比色法检测K562／A02细胞耐药性、thapsigargin的增殖抑制活性及其对K562／A02细胞化疗敏感性的影响；丫啶橙(AO)／溴化乙锭(EB)染色荧光显微镜观察thapsigargin处理后K562／A02细胞形态改变；流式细胞仪(FCM)检测P-糖蛋白(P-gp)表达；荧光显微镜检测Pgp功能。结果 ①thapsigargin对K562和K562／A02细胞的增殖抑制活性呈剂量和时间依赖性，K562／A02细胞较K562细胞对thapsigargin更敏感，thapsigargin诱导K562／A02细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变。②K562／A02细胞对阿霉素(ADM)、柔红霉素(DNR)、长春新碱(VCR)、依托泊苷(VP-16)、高三尖杉酯碱(HHT)和米托蒽醌(MXT)均出现不同程度的耐药性；thapsigargin抑制K562／A02细胞P-gP功能而对其表达无影响，thapsigargin能增加K562／A02细胞对ADM、DNR、VCR、VP-16、HHT和MXT的化疗敏感性。结论 Thapsigargin能诱导白血病多药耐药细胞株K562／A02细胞凋亡并能部分逆转K562／A02的多药耐药性；thapsigargin的多药耐药逆转功能可能与其凋亡诱导作用和抑制PgP功能有关。     

miR-145对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药逆转的作用机制研究

目的:探讨miR-145对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR阿霉素耐药的影响及可能的作用机制。方法:采用实时定量PCR方法检测miR-145在乳腺癌细胞株MCF-7及MCF-7/ADR中的表达差异;脂质体转染法将构建好的miR-145 mimics,miR-145inhibitor成功转染进MCF-7/ADR细胞中,MTT法检测转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,流式细胞仪检测耐药细胞对阿霉素诱导凋亡的影响,Western blot检测转染前后抗凋亡蛋白Bcl-2、多药耐药基因MDR1表达蛋白P-gp的表达差异。结果:miR-145在人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中表达下降;上调miR-145可以增强MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性,显著抑制MCF-7/ADR细胞增殖,并促进阿霉素诱导的细胞凋亡,同时显著抑制了耐药细胞中Bcl-2和P-gp的表达。结论:miR-145通过抑制Bcl-2和P-gp蛋白的表达来增加MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性和凋亡。     

bcl-2基因表达与小细胞肺癌对抗机体免疫所致细胞凋亡的关系

目的 观察小细胞肺癌细胞株bcl-2基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫攻击的关系,探索应用bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2SON)治疗肺癌的途径。方法 bcl-2SON处理小细胞肺癌细胞株NCI-H69,Westernblotting检测其对bcl-2表达作用;分别把bcl-2表达不同的小细胞肺癌细胞株与肺癌标本分离出来的TIL共同培养,并通过JAM试验观察TIL诱导肺癌细胞凋亡的情况。结果 经bcl-2SON处理后NCI-H69细胞的bcl-2表达明显受抑制。JAM试验结果显示,bcl-2SON处理的H69细胞及无bcl-2表达的NCI-H82细胞在与TIL混合培养中,随着TIL浓度增加,凋亡细胞也增加;对照的NCI-H69可见bcl-2表达,JAM试验中随着TIL浓度增加,凋亡细胞的量无明显变化。结论 表达bcl-2的肺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击,bcl-2SON可作为治疗肺癌的新途径。     

bcl-2基因表达与小细胞肺癌对抗机体免疫所致细胞凋亡的关系

目的 观察小细胞肺癌细胞侏bcl-2基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）免疫攻击的关系，探索应用bcl-2硫代反义寡核苷酸（bcl-2 SON）治疗肺癌的途径。方法 bcl-2 SON处理小细胞肺癌细胞株NCI-H69，Western blotting检测其对bcl-2表达作用；分别把bcl-2表达不同的小细胞肺癌细胞株与肺癌标本分离出来的TIL共同培养，并通过JAM试验观察TIL诱导肺癌细胞凋亡的情况。结果 经bcl-2 SON处理后NCI-H69细胞的bcl-2表达明显受抑制。JAM试验结果显示，bcl-2SON处理的H69细胞及尢bcl-2表达的NCI-H82细胞在与TIL混合培养中，随着TIL浓度增加．凋亡细胞也增加；对照的NCI-H69可见bcl-2表达，JAM试验中随着TIL浓度增加，凋亡细胞的量无明显变化。结论 表达bcl-2的肺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击，bcl-2 SON呵作为治疗肺癌的新途径。     

非小细胞肺癌体外药敏试验研究

目的通过体外药敏试验,检测目前常用化疗药物对体外培养的非小细胞肺癌细胞的敏感性,为临床对化疗药物的选择提供参考,从而减少临床对化疗药物选择的盲目性,更好地实行个体化治疗。方法通过改良四氮唑盐（tetrazolium salt,MTT）比色法进行肺癌细胞体外药敏试验,对41例肺癌患者的新鲜肿瘤标本进行体外培养和化疗药物敏感性检测,并对其结果进行比较。结果 PTX、NVB、DDP、L-OHP的敏感率均在40%以上,提示非小细胞肺癌对以上药物敏感,而CPT-11、VCR、THP、ADM、EPI、IFO、CBP的敏感率均低于30%,提示在非小细胞肺癌化疗过程中应用以上药物可能存在耐药,非小细胞肺癌中腺癌和鳞癌对16种化疗药物的敏感性也有一定的差异性。结论术后肺腺癌的辅助化疗中应首选PTX、5-FU、DDP、L-OHP、CPT、VP-16、Docetaxel;肺鳞癌的辅助化疗中应首选PTX、DDP、L-OHP、NVB,VCR、THP、ADM均100%耐药,临床应用中应注意避免应用这些药物。     

MT1X siRNA对肺癌A549/DDP细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨金属硫蛋白1X（MT1X）在肺癌耐药细胞株（A549／DDP）顺铂耐药中的作用。方法通过化学合成针对MT1X的siRNA段抑制其在A549／DDP中的表达,实时定量聚合酶链反应（PCR）及WB检测干扰效果,M1Tr及平板克隆形成实验检测干扰前后细胞对顺铂的药物敏感性变化;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果针对MT1X的siRNA片段能在RNA及蛋白水平有效抑制其在A549／DDP中的表达;与对照组相比,MT1X表达被抑制后,肿瘤细胞对顺铂的敏感性明显升高;增殖被抑制,平板克隆形成率明显降低（P〈O．05）,细胞凋亡率显著增高（P〈0．05）。结论针对MT1X的siRNA片段可部分逆转肺癌细胞（A549／DDP）对顺铂的耐受,为提高肺癌的化疗效率提供了一种新方法。     

小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

 目的 明确能否以表面黏附分子CD133为干细胞标志物,使用免疫磁珠分选（magnetic cell separation,MACS）法分离小细胞肺癌细胞系H446细胞中的肿瘤干细胞。方法 以CD133为特异性分子标志物,使用MACS方法分选H446细胞,比较CD133阳性（CD133+）细胞与CD133阴性（CD133-）细胞在集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面的不同。结果 CD133+细胞和CD133-细胞在集落形成能力、自我更新能力、增殖能力、分化能力、侵袭能力和耐药性方面基本相同。集落形成和成瘤性实验结果显示：CD133+或CD133-细胞中40%以上的细胞都能够形成含有100个细胞以上的大集落,增殖成为与未分选细胞相同的细胞群,并能在裸鼠身上成瘤。结论 表面黏附分子CD133不能作为分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞的分子标志物,分选后的CD133+与CD133-细胞中含有相同的肿瘤干细胞。     

流式细胞术检测EGFL7在肺癌不同细胞株中的表达差异

目的 探讨不同类型肺癌细胞株中EGFL7（类表皮生长因子域7）蛋白的表达差异,为进一步研究EGFL7在肺癌发病机制中的作用奠定基础.方法 选取三种常用的细胞株A549（肺癌腺）、H446（小细胞肺癌）和H69（小细胞肺癌）,采用流式细胞仪检测它们的EGFL7的表达,并比较三者之间的差异是否具有统计学意义.结果 流式细胞仪检测结果显示,EGFL7在肺腺癌细胞株A549细胞内的表达（18.17%）明显低于小细胞肺癌细胞株H446（31.20%）和H69（34.33%）细胞内的表达（P＜0.01）,两种小细胞肺癌细胞株H446和H69细胞内的表达差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 EGFL7可能在小细胞肺癌的发病机制中发挥重要作用.