cyclinD1/E2F通路在苯并(a)芘引起人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨细胞周期蛋白D1（cyclinD1）／细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4），E2F-1／4通路在苯并（a）芘[B（a）P]引起的人胚肺成纤维细胞（HELF）周期改变中的作用。方法分别用2μmol／L的B（a）P作用HELF24h和100μmol／LB（a）P作用3次，每次24h，细胞具有转化细胞的部分特征（THELF）。用转染反义cyclinD1和CDK4质粒的HELF（A-D1，A-K4）和T-HELF（T-A-D1，T-A-K4）研究cyclinD1／CDK4与E2F-1／4的上下游关系。用流式细胞仪和Western blot法检测细胞周期、cyclin D1、CDK4和E2F-1／4蛋白表达的改变。结果2μmol／LB（a）P作用24h HELF中G1期细胞数明显减少。在A-D1和A-K4的HELF中，cyclinD1和CDK4表达的抑制阻断了由B（a）P引起的细胞周期从G1期进入S期的变化。B（a）P刺激后HEIF中cyclinD1和E2F-1的表达明显增加。在A-D1中，E2F-1的高表达被抑制。B（a）P作用A-K4细胞后，CDK4表达明显升高，E2F-4表达明显降低。T-A-D1和T-A-K4的T-HELF多数停留在G1期。与HELF相比，T-HELF中cyclin D1的表达明显增加；与T-HELF相比，T-A．D1和T-A-K4中E2F-4表达明显增加。结论在2μmol／L B（a）P作用的HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-1／4信号转导通路引起细胞周期的改变。在T-HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-4信号转导通路引起细胞周期的改变。     

ERK和JNK/活化蛋白-1通路在苯并(a)芘诱导人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/转录因子活化蛋白-1(AP-1)信号通路在调控苯并(a)芘[B(a)P]致人胚肺成纤维细胞(HELF)周期改变中的作用。方法用AP-1荧光素酶报告基因技术检测AP-1荧光素酶活力,流式细胞术测定细胞周期时相分布,免疫印迹法检测MAPK[包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶]总量及磷酸化水平,用MAPK显性失活突变体(DN)(DN-ERK2、DN-JNK1和DN-p38)证明通路的上下游关系。结果2μmol/L B(a)P分别处理细胞0、6、122、4 h,AP-1活力在12 h达峰值,是对照组的2.22倍,差异有统计学意义(P<0.05);ERK1/2、JNK1/2和p38蛋白激酶的磷酸化水平明显提高,分别是对照组的2.5、14.0和2.1倍;B(a)P处理组S期细胞比例(50.2%±4.6%)与对照组(16.7%±8.1%)相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);ERK2和JNK1显性失活突变体的过表达均可明显降低B(a)P诱导的AP-1活力增强,并且明显降低B(a)P处理组S期细胞比例(分别为33.3%±1.7%,30.8%±3.9%),差异均有统计学意义(P<0.05);p38显性失活突变体的过表达对B(a)P引起的AP-1活力增强及S期细胞比例增加无影响。AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)可明显降低B(a)P引起的S期细胞比例增加(13.6%±2.9%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERK和JNK通过活化AP-1介导B(a)P诱导的细胞周期改变;而B(a)P诱导的AP-1活力增强及细胞周期改变与p38无关。     

Cyelin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的 研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系.方法 将反义cychn D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内.建立两种质粒稳定转染的细胞模型.用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h.用蛋白印迹方法检测cvclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响.结果 成功建立了反义cyelin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系.不同剂量B(a)P处理可引起cvclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5/μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响.结论 Cyelin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用.     

Cyclin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系。方法将反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内,建立两种质粒稳定转染的细胞模型。用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h,用蛋白印迹方法检测cyclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响。结果成功建立了反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系。不同剂量B(a)P处理可引起cyclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响。结论Cyclin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用。     

全反式视黄酸阻断苯并(a)芘致成纤维细胞周期改变的通路

目的 观察全反式视黄酸（ATRA）逆转苯并（a）芘诱导的人胚肺成纤维细胞（HELF）细胞周期紊乱过程中细胞周期素D1（cyclin D1）、细胞周期素依赖性激酶K4（CDK4）、转录因子E2F-1和E2F-4的作用.方法 用0.1 μmol/L ATRA预处理细胞后,再用2 μmol/L苯并（a）芘作用细胞,用Western blotting方法测定其蛋白表达水平;建立稳定转染了反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒的细胞系,应用反义技术证明上下游关系;用流式细胞技术 测定细胞周期.结果 2μmol/L苯并（a）芘作用于HELF24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显增高,CDK4和E2F-4蛋白表达水平无明显变化;用0.1 μmol/LATRA预处理24h后,cyclin D1、E2F-1蛋白表达水平明显下降;与相同作用的对照组相比,苯并（a）芘刺激反义cyclin D1或反义CDK4细胞后E2F-1表达增加的幅度明显降低;与相同作用的对照组相比ATRA预处理的反义cyclin D1或反义CDK4细胞中,苯并（a）芘诱导的E2F-1过表达水平降低的幅度明显降低;流式细胞术测定结果显示,苯并（a）芘诱导细胞从G1期进入S期,ATRA通过聚积G1期细胞而阻滞苯并（a）芘诱导的细胞周期进程.结论 ATRA通过cyclin D1/E2F-1途径阻断苯并（a）芘诱导的HELF的细胞周期改变.     

苯并(a)芘对雄性小鼠睾丸细胞周期的影响

目的研究苯并(a)芘对雄性小鼠睾丸细胞周期的影响.方法采用流式细胞术研究雄性小鼠睾丸细胞周期.结果不同剂量的苯并(a)芘可以使睾丸细胞各时相的细胞百分数发生变化,随着苯并(a)芘染毒剂量的增加,G0/G1、S时相的细胞百分数明显减少,5,10,20 mg/kg各剂量染毒组与阴性对照组比较差异具有显著性(P＜0.01).G2/M时相的细胞百分数逐渐增多,各剂量组与阴性对照组比较具有显著性差异(P＜0.01).结论苯并(a)芘可以抑制睾丸细胞的DNA合成,引起G2期细胞阻滞,使细胞有丝分裂延迟.     

苯并(a)芘对不同时相人胚肺成纤维细胞细胞周期的影响

目的研究不同细胞周期状态下,苯并（a）芘[B（a）P]对人胚肺成纤维细胞周期的影响。方法采用血清饥饿的方法使人胚肺成纤维细胞（HELF）同步于G0期,血清再刺激后细胞较为同步地进入周期,分别于G1、S和G2-M期细胞占多数的情况下对细胞进行B（a）P（2、10、50μmol/L）染毒处理,染毒方式分B（a）P经代谢活化和未经代谢活化两种。结果血清饥饿48h,细胞较好地同步于G0期,血清再刺激后10～12h、16～18h、22～24h为G1、S和G2-M期改变明显的时间。未经代谢活化的B（a）P对细胞周期的影响较弱,改良的代谢活化方法既能较好地代谢活化B（a）P,又尽可能避免了对细胞周期的干扰作用。除2μmol/L组在22h引起G1期细胞百分比下降和S期细胞百分比增加外,其他时点和剂量均有S期百分比下降的效应,随着剂量增加,该效应越明显,16h改变最明显;16h出现G2-M期细胞百分比增加的效应;10和22h出现G1期细胞百分比增加和G2-M期细胞百分比下降的效应。结论血清饥饿及再刺激方法能得到处于各时相的细胞;改良的代谢活化方法适合细胞周期研究;B（a）P在实验周期均能引起HELFS期细胞减少,作用于G1期可引起G1期阻滞,作用于S期可引起G2-M阻滞,作用于G2期可引起G1阻滞。     

维生素C逆转苯并(a)芘致细胞周期改变的E2F通路

目的探讨转录因子E2F1和E2F4在维生素C逆转苯并(a)芘引起人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变中的作用,及其与细胞周期蛋白D1(cyc lin D1)、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的上下游关系。方法接种细胞到培养瓶,待生长至70%~80%时,维生素C预处理细胞1 h后,用苯并(a)芘刺激细胞24 h,运用流式细胞术测定细胞周期时相分布,用免疫印迹法检测蛋白含量,用Gel-Pro 3.0软件对条带光强度进行分析,脂质体转染法建立稳定转染反义cyc lin D1或反义CDK4的HELF系,应用反义技术证明通路的上下游关系。结果苯并(a)芘诱导HELF中cyc lin D1、CDK4、E2F1和E2F4的蛋白表达升高,并伴随S期细胞百分率从(33.5±3.2)%上升至(41.1±0.2)%。维生素C可降低苯并(a)芘诱导的HELF S期细胞百分率至(33.2±0.6)%,并抑制苯并(a)芘诱导的HELF上述蛋白的表达。反义cyc lin D1和反义CDK4均可抑制苯并(a)芘诱导的HELF上述蛋白的表达,反义cyc lin D1可使苯并(a)芘诱导的HELF S期细胞百分率降低至(31.2±1.3)%。维生素C联合反义cyc lin D1与单独反义cyc lin D1相比,可进一步降低苯并(a)芘诱导的HELF上述蛋白的表达,且能够抑制苯并(a)芘诱导的HELF的S期细胞百分率,使其从(41.1±0.2)%下降为(34.0±0.3)%。维生素C联合反义CDK4可降低苯并(a)芘诱导的HELF的S期细胞百分率,使其从(41.1±0.2)%下降为(33.7±1.5)%,而且与单独反义CDK4相比,可进一步降低苯并(a)芘诱导的HELF的S期细胞百分率。结论维生素C可能通过cyc lin D1-CDK4/E2F-1/4通路逆转苯并(a)芘引起的细胞周期改变。     

030 苯并(a)芘对细胞周期、细胞增殖的影响及相关信号传导途径的作用

以苯并(a)芘及其代谢物为模式化学物,围绕着DNA损伤修复、细胞信号传导途径、细胞周期检测点调控等方面,从化学致癌物对细胞周期的影响角度来阐明化学致癌物的致癌机制已成为当前环境毒理学的热点问题与研究前沿.本文就苯并(a)芘对细胞周期分布与细胞周期调节因子的影响、以及相关信号传导途径在苯并(a)芘对细胞周期与细胞增殖影响中的作用等方面,对苯并(a)芘对细胞周期的影响进行了综述.     

苯并(a)芘通过活化蛋白-1非依赖性通路诱导细胞中p53蛋白过表达及高磷酸化

目的探讨苯并(a)芘[B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白、p53磷酸化水平及亚细胞分布和活化蛋白-1(AP-1)活性的改变,以及p53与AP-1的上下游关系。方法转染p53小干扰RNAp53 siRNA质粒(p53-H)、载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)和转染AP-1荧光报告质粒的HELF细胞(AP-H)无血清培养48h后,加入2μmol/L B(a)P作用24h,用Western blot及免疫荧光法检测细胞中p53蛋白及p53磷酸化的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位,用荧光检测法检测AP-1的相对活性。用AP-1的化学抑制剂curcumin抑制其活性,用p53的化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察了二者的上下游关系。结果2μmol/L B(a)P作用24h后细胞内p53蛋白及p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平增加,并且主要分布在细胞核内;AP-1的活性增加。抑制AP-1活性后,对B(a)P诱导的p53蛋白含量增加没有明显的影响;抑制p53表达后,对B(a)P诱导的AP-1活性的增加没有明显影响。结论B(a)P通过AP-1非依赖的信号通路引起人胚肺成纤维细胞p53蛋白含量的增加。     

p53蛋白在苯并(a)芘诱导的p21、E2F-1表达及细胞周期改变中的作用

目的 探讨p53蛋白在苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变中的作用及其与p21、E2F-1的关系.方法 转染p53 siRNA质粒(p53-H)和载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)无血清培养48 h后,加入2 μmol/L B(a)P作用24 h.用流式细胞仪检测细胞周期的变化.用Western blotting检测细胞中p53、p21蛋白含量的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位.用免疫荧光法观察E2F-1蛋白含量及细胞核、细胞浆分布.利用p53 siRNA质粒和化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察p53与p21、E2F-1的上下游关系以及其在B(a)P引起的细胞周期改变中的作用.结果 2 μmol/L B(a)P作用24 h后,G1期细胞比例由(71±5)%减少为(39±4)%;p53、p21以及E2F-1蛋白含量增加,并且主要分布在细胞核内.用p53 siRNA质粒和PFT抑制p53表达后,B(a)P诱导的p21高表达被抑制,细胞核内的含量明显减少;B(a)P诱导的E2F-1蛋白含量增加以及细胞周期的改变没有明显变化.结论 B(a)P通过p53非依赖的信号通路引起HELF细胞周期的改变;p53对p21的表达具有调节作用,而对E2F-1的表达不具有调节作用.     

苯并(a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化

以不同浓度的苯并 (a)芘代谢物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)多次处理人支气管上皮细胞 16HBE ,并观察转化细胞的恶性特征。发现BPDE可诱导 16HBE细胞恶性转化 ,形成转化灶。转化灶细胞失去接触抑制 ,排列紊乱 ,无方向性 ,交叉重叠生长。转化的细胞可在软琼脂上生长 ,各浓度处理组细胞集落形成率均显著高于对照组 ,有良好的剂量—反应关系。经BPDE处理的细胞在裸鼠体内成瘤 ,病理学诊断为鳞状细胞癌。本实验以反式BPDE成功地诱发了人支气管上皮细胞恶性转化 ,为后期进一步研究其致癌的分子机制、寻找致癌相关基因提供了理想的生物学材料。     

苯并芘诱导人胚肺成纤维细胞cyclinD1、CDK4和E2F-1/4的表达改变

目的建立苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞(T-HELF)模型,并观察T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。方法以200、100、50、25、5、1μmol/L的苯并芘处理人胚肺成纤维细胞(HELF)24小时,用噻唑蓝(MTT)比色法测定苯并芘的细胞毒性。根据MTT结果确定以100和200μmol/L苯并芘给HELF细胞染毒3次,染毒结束后培养6周观察细胞的形态变化,培养12周后观察其形态变化及软琼脂中细胞克隆的生长。用流式细胞仪检测T-HELF细胞周期的变化,用Western blot检测T-HELF细胞中cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达的改变。结果MTT结果显示苯并芘浓度在25~200μmol/L之间时,细胞存活率为78%~80%。苯并芘200μmol/L组染毒4周后细胞死亡。100μmol/L组染毒结束后培养6周,观察到细胞变大,核增大或多核;12周后,在软琼脂中可以生长为细胞克隆,说明HELF细胞具有了转化细胞的部分特征。T-HELF细胞在无血清培养时,细胞周期没有停滞。用Western blot检测发现和正常HELF细胞相比T-HELF细胞的cyclin D1表达明显增加,CDK4、E2F-1和E2F-4的表达没有明显变化。结论建立了苯并芘诱导的具有转化细胞部分特征的人胚肺成纤维细胞模型,可用于苯并芘致癌的分子机制研究。无血清培养时,T-HELF细胞周期没有停滞,和正常HELF细胞相比T-HELF细胞cyclin D1表达明显增加,cyclin D1可能与T-HELF细胞的快速增殖有关。     

热休克蛋白70的表达在苯并[a]芘致DNA损伤中的作用

目的　探讨苯并 [a]芘 (BaP)作用下人肺腺癌A5 4 9细胞热休克蛋白 70 (HSP70 )表达改变及其在DNA损伤中的作用。方法　离体培养A5 4 9细胞 ,以不同浓度的BaP(0、1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0μmol L)染毒 6h或 10 μmol L的BaP染毒不同时间 (0、4、8、12、16、2 4、4 8h) ;分别以Western blot和单细胞凝胶电泳方法检测细胞HSP70表达和DNA损伤情况 ;并进一步分析HSP70表达和DNA损伤之间的关系。结果　 1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0 μmol L的BaP作用 6h时 ,A5 4 9的HSP70积分光密度分别为4 9.6 3± 1.30、4 5 .72± 1.0 3、4 0 .5 3± 0 .95、37.5 0± 1.2 0 ,均低于对照组 (5 9.4 3± 1.17) ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;10 μmol L的BaP作用 4、8、12、16h时 ,HSP70的积分光密度分别为 33.33± 0 .80、2 9.2 3± 0 .91、12 .5 1± 0 .96、9.5 0± 1.2 5 ,而在 2 4、4 8h时 ,HSP70的积分光密度分别为 2 0 .0 6± 1.38、2 4 .5 1± 1.39,与对照组 (5 6 .5 9± 0 .85 )比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。 1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0 μmol L的BaP作用 6h时 ,在 10 6 个细胞中 ,DNA损伤积分分别为 10 0 82± 75 80、2 3718± 2 938、30 12 8± 2 937、4 4 2 31± 384 6 ,其中 2 .5 0～ 10 .