FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

人FcεRⅠα亚基细胞外区的原核表达及其和IgE结合的机制

应用两种不同的表达系统对FcεRⅠα亚基的细胞外区进行克隆和表达，表达产物经纯化后用免疫斑点杂交法检测其与IgE结合的能力，探索IgE与其高亲和力受体FcεRⅠα亚基的细胞外区结合的机制。结果两种体系均成功表达出FcεRⅠα亚基的细胞外区，pBAD／gⅢA表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区能与IgE结合，而PQE30表达的FcεRⅠα亚基的细胞外区不能与IgE结合。提示FcεRⅠα亚基的细胞外区已足够和。IgE结合，无需β、γ亚基的存在，其所具有的一定的空间构型和二硫键的形成在与IgE结合时是必需的，而糖基化位点在与IgE的结合时是非必需的。     

IgE高亲和力受体蛋白的制备及其生物功能的鉴定

目的 通过基因工程技术制备人IgE抗体结合其高亲和力受体α段(FcεRIα)蛋白并对其生物学功能进行鉴定,为探讨FcεRIα在过敏性疾病中的作用奠定研究基础.方法 应用基于PCR的精确合成法(PAS)方法获得人FcεRIα基因,构建原核表达载体pET-FcεRIα,低温诱导表达FcεRIα并采用 His标签纯化重组蛋白;通过ELISA法鉴定重组人FcεRIα蛋白的生物功能.结果 扩增出大小约为560 bp的人FcεRIα基因;pET-FcεRIα质粒经双酶切及测序鉴定正确;诱导表达并纯化出相对分子质量大小约为22000的人FcεRIα;重组人FcεRIα能有效检测人血清中的抗FcεRIα自身抗体水平,并且能够与人血清中IgE抗体高效结合.结论 成功制备人FcεRIα蛋白,并初步具备检测人血清中抗FcεRIα自身抗体及IgE抗体的能力,为后续研究提供了有利的实践基础.     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5．3细胞，获得大量的含抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱，分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果 分离纯化的单克隆抗体纯度高，活性强。结论 应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体。     

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白真核表达质粒的构建

在人类哮喘及其他过敏反应性疾病中 ,肥大细胞始终处于重要地位。IgE的Fc段与肥大细胞上高亲和力受体FcεRⅠ相连接触发过敏反应。单独的Fc段能封闭其高亲和力受体 ,阻断过敏反应 ,且将关键结合位点定位于Fc段的CH3[1 3 ] 。国外研究发现 ,肥大细胞表面表达Fas,抗Fas抗体能够诱     

FcεRⅠβ基因多态性与湖北地区儿童变应性哮喘的关系

目的　探讨IgE高亲和力受体 β链基因 (FcεRⅠβ)启动子 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly基因多态性与湖北儿童变应性哮喘及血浆总IgE的关系。方法　采用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性技术检测 110例儿童变应性哮喘患者和 92例相匹配对照者FcεRⅠ β基因启动子区 - 10 9位和编码区Glu2 37Gly两位点多态性。结果　①儿童变应性哮喘患者FcεRⅠ β基因启动子区 - 10 9位T/T、T/C和C/C基因型频率是 0 391、 0 4 91和 0 118;与对照相比差异无显著性意义 (χ2 =0 0 2 34,P >0 0 5 ) ,但儿童变应性哮喘组T/T基因型患者血浆总IgE对数值为 2 4 78± 0 94 4 ,与T/C基因型的 2 2 87± 1 114和C/C基因型的 2 315± 0 86 6相比差异具有显著性意义 (F =4 336 ,P <0 0 1)。②FcεRⅠ βGlu2 37Gly位点Glu/Glu、Glu/Gly和Gly/Gly型频率为 0 5 91、 0 36 4和 0 0 4 5 ,与正常对照相比差异具有显著性意义 (χ2=6 5 86 ,P <0 0 5 ) ,Gly/Gly型血浆总IgE对数值为 2 6 2 3± 0 96 2 ,与Glu/Glu的 2 30 6± 0 915和Glu/Gly的 2 4 18±0 894相比差异具有显著性意义 (F =6 6 5 4 ,P <0 0 1)。结论　IgE高亲和力受体 β链启动区 - 10 9位T/T型与血浆总IgE相关 ,编码区 2 37位Gly/Gly型与儿童变应性     

人TβRⅡ-ⅠgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-βRⅡ型受体胞外区及ⅠgG1Fc段融合基因的腺病毒载体，并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因。通过Overlap PCR融合为目的基因hTTβRⅡ-ⅠgG1Fc；克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒．线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌．同源重组构建腺病毒质粒；将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞，并扩增、纯化、RT-PCR鉴定；ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确；RT—PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-ⅠgG1Fc，中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-ⅠgG1Fc的腺病毒载体，体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用，为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。     

免疫复合物对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节

目的探讨免疫复合物(ICs)对U937细胞和中性粒细胞表面Fc受体表达的调节.方法将U937细胞或中性粒细胞与各种免疫复合物共同孵育1 h后,用流式细胞仪分析细胞表面各种Fc受体的表达情况.结果 IgG1ICs和IgG3 ICs能上调U937细胞表面FcγRⅡ和FcγRⅢ以及中性粒细胞表面的FcγR I和FcαR I的表达.与各类免疫复合物孵育后中性粒细胞表面FcγRⅡ的表达呈降低趋势.结论免疫复合物能调节中性粒细胞和U937细胞Fc受体的表达,其中以IgG1 ICs和IgG3 ICs最为明显.     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRIα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5.3细胞,获得大量的含抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱,分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果分离纯化的单克隆抗体纯度高,活性强。结论应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体。     

抗人凝血因子Ⅷ-C1C2区单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人凝血因子Ⅷ（FⅧ）C1C2区单克隆抗体（mAb）,并对其进行生化和生物学鉴定。方法采用基因重组技术表达FⅧ-C1C2区蛋白（rFⅧ-C1C2）,以rFⅧ-C1C2免疫8周龄Balb/C小鼠,小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,ELISA法筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗rFⅧ-C1C2mAb的细胞株,并对mAb进行生化和免疫学鉴定。结果获得一株抗rFⅧ-C1C2区单克隆抗体阳性克隆2B11,命名为SZ-133。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类,Westernblot法证实SZ-133可与rFⅧ-C1C2区蛋白及重组的全长FⅧ特异性结合,但不影响FⅧ的凝血活性。结论表达了rFⅧ-C1C2,并制备出了抗人凝血因子Ⅷ的单克隆抗体SZ-133,它能特异识别血浆及重组的FⅧ,有可能用于基础和临床应用研究。     

CpG ODN对哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ、FcγRⅡb表达的影响

目的观察CpGODN对哮喘小鼠肺组织FcaRI、FcTRIIb表达的影响,探讨其诱导免疫耐受的相关机制。方法将48只清洁级雄性Balb／c小鼠随机分为正常对照组（A组）、哮喘组（B组）、地塞米松（DXM）治疗组（C组）、CpGODN治疗组（D组）,每组12只。以卵白蛋白（OVA）作用建立小鼠哮喘模型。收集支气管肺泡灌洗液（bronchialalveolarlavagefluid,BALF）计数细胞总数并分类,取肺组织作病理,反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）法测定肺组织中FcεRⅠ、FcγRⅡbmRNA的表达。结果（1）电镜观察肺组织超微结构：B组显示支气管及血管周围有较多炎性细胞浸润,肺泡隔内嗜酸粒细胞浸润,c组和D组与B组相比明显减轻。（2）BALF中炎症细胞表达变化：与B组相比,C组、D组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞（eosino—phil,EOS）绝对值以及EOS占细胞总数的百分比（EOS％）均显著减少（P〈0．01）。（3）RT—PCR结果：C组、D组FcεRⅠ mR—NA表达均显著低于B组（P〈0．01）,C组、D组FcγRⅡb mRNA表达均显著高于B组（P〈0．01）。（4）相关分析：小鼠肺组织FcεRⅠ和FcγRⅡb表达呈显著负相关（P〈0．01,n=40）。结论CpGODN能降低哮喘小鼠肺组织FcεRⅠ的表达,增加FcγRⅡb的表达,具有改善气道炎症和诱导免疫耐受的作用。     

HIV-1 SF2株env基因C1与C3区的嵌合表达

①目的 构建HIV-1SF2株env基因C1与C3区嵌合片段的克隆并在大肠杆菌中表达。②方法 用DNAstar软件辅助设计引物，以含有HIV-1SF2株前病毒基因组的9B1R6质粒为模板，PCR法分别扩增出env基因C1和C3段；两个片段经KpnⅠ酶切、T4连接酶连接和扩增后，再将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的嵌合片段插入表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达质粒pGEX-4T-2／ClC3；重组质粒经酶切、测序鉴定后，以TSS法转入大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达融合蛋白和SDS—PAGE电泳分析表达蛋白图谱。③结果 经酶切和测序分析，插入片段大小、方向和读码框架正确，无碱基错配，表明成功构建pGEX-4T-2／ClC3克隆；重组克隆在大肠杆菌DH5α中经IPTG诱导，高效表达出相对分子质量为4．3万的融合蛋白。④结论 重组质粒pGEX-4T-2／C1C3的构建和表达成功，为进一步研究该表达蛋白的活性和HIV疫苗的研制奠定了基础。     

膜结合型抗大鼠FcεRIα单克隆抗体制备及活性鉴定

目的:建立抗鼠FcεRI单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),为靶向诱导肥大细胞凋亡创造条件.方法:大鼠嗜碱性粒细胞细胞系RBL-2H3免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,ELISA筛选鼠血清和融合细胞产生的抗体,有限稀释克隆化培养.SDS-PAGE胶电泳、免疫扩散鉴定抗体性质,IgE竞争结合、组胺释放检测抗体生物活性,125I-细胞膜抗体复合物免疫沉淀放射自显影鉴定抗体识别抗原成分.结果:获得2株抗FcεRIα McAb生产细胞株ER-E5.3、ER-C7.4,均为IgG1.培养上清和小鼠腹水获得的抗体效价均大于10-5.流式细胞术分析抗体与RBL-2H3结合率均大于95%,与大鼠胸腺细胞和外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)无交叉反应,并能竞争性抑制IgE与肥大细胞结合.抗体触发RBL-2H3脱颗粒,组胺释放效应与抗原特异性IgE对肥大细胞的激活效应相同.酶切的Fab片段能与RBL-2H3结合,也能竞争抑制IgE与肥大细胞的结合,但不致RBL-2H3脱颗粒.抗体结合的细胞膜成分为α亚单位.结论:大鼠肥大细胞免疫小鼠与骨髓瘤细胞融合得到2株抗体产生杂交瘤克隆ER-E5.3和ER-C7.4,抗体效价和功能活性达到了实验要求,抗原识别成分为膜FcεRIα.     

重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc),并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类风湿关节炎基因治疗的可行性.方法首先以RT-PCR分别从大鼠脾细胞和大鼠淋巴细胞总RNA中扩增出大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAVⅠ载体质粒进行重组病毒生产.在获得重组病毒后于Lewis大鼠肌肉注射,于不同时间ELISA测定血清ratTNFR:Fc表达,并以TNF-α细胞毒中和实验测定重组病毒表达产物的生物学活性.结果所构建的重组病毒rAAVⅠ/ratTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒于Lewis大鼠肌肉注射后可表达ratTNFR:Fc蛋白,含有ratTNFR:Fc蛋白的血清可以有效中和大鼠TNF-α对L929细胞的杀伤作用.结论本研究所构建的携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)可以用来作为阻断TNF-α的手段于大鼠类风湿关节炎模型上进行基因治疗研究.     

奥马珠单抗在儿童重度过敏性哮喘治疗中的应用

重度过敏性哮喘是指需要使用中高剂量吸入皮质类固醇(ICS)与长效β_2受体激动剂联合制剂和口服白三烯受体拮抗剂或缓释茶碱进行长期维持治疗才能控制症状或仍控制不佳的过敏性哮喘。奥马珠单抗是一种人源化单克隆抗体,能够选择性地与IgE结合,减少血清游离IgE,并可导致免疫细胞表面高亲和力IgE受体(FcεRⅠ)的下调。研究证实奥马珠单抗治疗儿童重度过敏性哮喘有效、安全。     

金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。     

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IBG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定.方法 RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基冈,通过Overlap PCR融合为目的 基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ 5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性.结果 目的 基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1.结论 成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用.为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据.     

肠道病毒71型VP1～VP4基因克隆及其表达产物的免疫原性

目的克隆并表达肠道病毒71型VP1~VP4蛋白基因,初步鉴定其免疫原性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用8 mol/L尿素洗涤及Ni柱亲和层析纯化后,用肠道病毒71型免疫兔血清和柯萨奇病毒A16型免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被免疫兔血清特异识别。结论肠道病毒71型VP1~VP4蛋白表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为今后EV71亚单位疫苗的研究和检测试剂盒提供了参考。     

中国汉族人IgE重链恒定区CH2、CH3及CH4亚基cDNA的克隆

人血清中高水平的IgE是哮喘、过敏性鼻炎、慢性荨麻疹等过敏性疾病的标志,而IgE与效应细胞上IgE高亲和力受体(FcεRⅠ)的相互作用则是这些Ⅰ型变态反应的重要调节步骤[1].很长时间以来,找到抑制它们结合从而治疗过敏性疾病的方法,一直是过敏性疾病研究的重点,所以了解这两个蛋白相互识别的方式以及结合的位点是极为重要的.     

EBI3蛋白基因克隆、表达及其初步鉴定

目的 进一步研究EB病毒诱导基因3(EBI3)蛋白在病原生物感染宿主中的功能,探讨原核表达小鼠EBI3蛋白并初步鉴定.方法 收集日本血吸虫感染的C57/BL6小鼠脾细胞后提取总RNA,利用所合成引物经RT-PCR获得EBI3的cDNA,将该基因亚克隆入原核表达载体pET32a(+) ,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株, 经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对包涵体进行变性、纯化和复性后获得可溶性的小鼠重组EBI3蛋白,用Western blot对其鉴定.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获取血清,经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A-50柱纯化得到抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA检测其免疫活性.结果 基因工程获得目的 蛋白变性复性成功后经Western blot鉴定证实为小鼠重组EBI3蛋白,免疫小鼠后取血清,分离纯化获得抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA结果表明该蛋白具有免疫原性.结论 成功地表达了小鼠重组EBI3蛋白,并制备了抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能奠定了基础.