3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化

目的探讨3T3-L1前脂肪细胞分化过程中微小RNA(miRNAs)表达谱的变化。方法3T3-Ll前脂肪细胞培养和诱导分化,通过形态学观察和RT-PCR方法,判断3T3-Ll前脂肪细胞是否分化成脂肪细胞。运用miRNAs芯片技术检测3T3-Ll前脂肪细胞和脂肪细胞中差异表达miRNAs。结果3T3-L1前脂肪细胞呈现成纤维状,诱导分化的第9天,细胞变成球形,内含许多脂滴;过氧化物酶体增殖物激活受体r2(PPARr2)和脂肪性脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达显著增加。3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个。结论3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化。     

无义密码子介导的mRNA降解机制与疾病

<正>无义密码子介导的mRNA降解(nonsense mediated mRNA decay,NMD)现象的发现,最早源于1979年美国学者Losson和Lacroute在对酵母菌URA3基因的研究中观察到无义密码子突变体在mRNA瞬时合成率并非很低的情况下能够降     

CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响

【立论依据】 AMPK是细胞及整体能量稳态的调控器。代谢综合征状态下,机体组织广泛存在AMPK活性下降,但AMPK如何失活仍存许多疑问。因此,弄清楚AMPK的失活机制对阐明代谢综合征的发病机制具有重要意义。 【设计思路】 有研究表明CDK5在肥胖小鼠脂肪组织中异常激活,AMPKα2的活性显著降低。同时,AMPKα2 345和529位丝氨酸满足Cdk5的底物一般都具有特定S/TPXK/R序列的条件。据此推测:活化的CDK5能够磷酸化AMPKα2 345和529位丝氨酸,进而抑制AMPKα2的活性,参与代谢综合征的发病。本课题拟在3T3-L1前脂肪细胞上研究Cdk5介导的AMPKα2蛋白磷酸化的作用,为代谢综合征和糖尿病的治疗提供新的思路。 【实验内容】 应用lipofectamine2000转染技术构建Cdk5 siRNA基因的脂肪细胞系3T3-L1-Cdk5 siRNA实验组及其阴性对照组细胞系3T-L1- Mock siRNA(Mock siRNA 为空siRNA转染),实验分为3T3-L1-Cdk5 siRNA组,3T-L1- Mock siRNA 组和3T-L1组,以AIMV无血清培养基培养3T3-L1细胞,使其自然增殖,于增殖第3天起用TNF-α作用于增殖中的3T3-L1细胞,之后每24小时以MTT法观察细胞增殖情况;采用含胰岛素、地塞米松与IBMX的分化培养基诱导分化3T3-L1细胞,于诱导分化第8天起用TNF-α作用于分化中的3T3-L1细胞,此后每3天以油红O染色并染料提取的半定量方法及细胞内甘油三酯测定的方法了解细胞内脂质含量;采用细胞Cdk5/P35和AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒检测3T3-L1细胞中Cdk5和AMPKα2的活性,蛋白质印迹的方法检测3T3-L1细胞AMPKα2 ^S345 、AMPKα2 ^S529及AMPKα2^S345、⁵²⁹磷酸化水平。从而观察CDK5介导的AMPK磷酸化对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响。 【材料】 3T3-L1前脂肪细胞,AIM-V medium,DMEM/F12 培养基,Cdk5 siRNA, AMPKα2激酶活性定量检测试剂盒,油红O, CO2细胞恒温培养箱。 【可行性】 Cdk5是脯氨酸引导的丝/苏氨酸蛋白酶,特异性磷酸化其底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸位点。其磷酸化底物一般都有特定的S/TPXK/R序列。而人、大鼠和小鼠AMPKα2蛋白序列的自动抑制区345位丝氨酸和亚单元结合区域529位丝氨酸有共同的序列YLASSPPSGS 和TGSTLSSVSP,满足Cdk5的底物一般都具有特定的S/TPXK/R序列的条件,实验假设理论上具有可行性。 【创新性】 本课题以Cdk5介导AMPKα2磷酸化进而抑制其活性为切入点,探讨对3T3-L1前脂肪细胞增殖及分化的影响,具有一定的创新性。     

促酰化蛋白诱导前脂肪细胞分化过程中DGAT、LPL、adipsin mRNA表达

目的观察促酰化蛋白（acylation stimulating protein，ASP）诱导3T3-L1前脂肪细胞的分化过程中。脂肪特异性的功能酶脂蛋白脂酶（LPI。）、二酰基甘油转酰酶（DGAT）以及脂肪细胞特异性功能蛋白adipsin表达的时序性和强度。方法以3T3-L1前脂肪细胞为实验对象，用ASP代替经典激素鸡尾酒诱导刺激中的胰岛素。诱导3T3-L1前脂肪细胞分化，分别在诱导分化1、2、4、6、8d收获细胞，采用RT—PCR法检测分化过程中LPL、DGAT和adipsin的mRNA表达情况。结果在ASP诱导3T3-L1前脂肪细胞分化过程中。LPL、DGAT、adipsinmRNA表达逐渐升高。其中LPL mRNA表达最早，在分化1d时就有低水平的表达。分化2d时出现DGAT mRNA的表达，并随着脂肪细胞的进一步分化成熟，LPL和DGAT mRNA表达水平逐步升高，持续到分化终末期；adipsin mRNA表达出现最晚，在分化4d时才有表达，随后其表达水平急剧升高，持续到分化终末期。结论ASP诱导3T3-L1前脂肪细胞分化过程中。按照一定的时序性依次诱导脂肪特异性的功能酶LPL、DGAT和功能蛋白adipsin的mRNA表达，是脂肪细胞生物学功能成熟的重要物质基础，同时也是ASP诱导前脂肪细胞分化的分子机制之一。     

GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中FABP-4、CPT-1A水平的影响

目的 探讨胰高糖素肽-1(GLP-1)对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中游离脂肪酸结合蛋白4(FABP-4)、肉碱脂酰转移酶1A(CPT-1A)表达水平的影响。方法 采用传统“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,并在分化过程中加入1×10-8mol/L GLP-1进行干预。在诱导分化的第6、8天,用油红O染色检测细胞内脂质聚集,RT-PCR及Western blotting法检测FABP-4、CPT-1A的mRNA及蛋白水平。 结果 ①在诱导分化第6天,大约40%的细胞出现脂滴聚集,第8天时大约80%的细胞已分化成熟;②油红O染色结果显示,与对照组相比,GLP-1组脂质总量在分化第6天略有增加,在分化第8天轻度下降(P>0.05);③RT-PCR结果显示, GLP-1组FABP-4的mRNA水平在分化第6、8天都明显增加;CPT1-A的mRNA水平在分化第8天增加明显(P<0.05);④Western blotting结果显示,GLP-1显著增加了FABP-4的蛋白表达(P<0.05)。对照组CPT-1A的蛋白水平在分化第6、8天无显著变化;而GLP-1组CPT-1A蛋白水平显著增加,尤其在分化第8天,与对照组相比增加了3.57倍(P<0.01)。结论 在3T3 L1前脂肪细胞分化过程中,GLP-1显著促进了FABP-4和CPT-1A的mRNA及蛋白水平,提示GLP-1同时促进脂肪细胞对游离脂肪酸的吸收及分解,能有效改善游离脂肪酸介导的胰岛素抵抗。     

牛蒡子苷对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖与分化的影响及其作用机制

【目的】探讨牛蒡子苷(arctiin)对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其作用机制。【方法】采用不同浓度牛蒡子苷作用于3T3-L1前脂肪细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞增殖的影响;油红O染色及分光光度法分析脂肪细胞的分化程度;实时荧光定量PCR检测细胞过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activatedreceptorγ,PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白α(CCTTA enhancer binging proteinα,C/EBPα)的表达情况。【结果】牛蒡子苷对3T3-L1细胞增殖无显著性影响(P>0.05),但可显著抑制3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化(P<0.05或P<0.01),且呈一定剂量依赖关系;与空白对照组比较,牛蒡子苷可显著降低PPARγmRNA、C/EBPαmRNA表达水平(P<0.05或P<0.01)。【结论】牛蒡子苷能抑制3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化,其机制可能与其能抑制脂肪细胞分化相关调控因子PPARγ和C/EBPα的表达有关。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

DMN诱导的小鼠慢性中毒性肝炎过程中IL-18、TNF-α mRNA及Fas mRNA的动态变化

目的 观察二甲基亚硝胺(DMN)所致小鼠慢性中毒性肝炎时肝组织损伤与IL-18、TNF-αmRNA、Fas mRNA表达的动态变化。方法 取30只小鼠作为模型组，腹腔注射0．1％的DMN14mg／kg，每隔4d注射1次，共注射5次。分别在第1、3、5次注射后2d(即实验第3d、11d、19d)及停止注射14d(即实验第31d)眼球取血后分批处死动物(每次处死6只)，检测血清IL-18、肝组织TNF-α mRNA及Fas mRNA的表达。对照组6只小鼠，腹腔注射生理盐水，每隔4d1次，共5次，于第31d处死，检测指标同模型组。结果小鼠第一次注射DMN后肝细胞气球样改变为主，炎症、坏死不明显。随着注射次数的增加，炎症、坏死逐渐加重。停止注射后，肝组织逐渐修复。血清IL-18、肝组织TNF-α mRNA及Fas mRNA水平随着炎症、坏死的加重而升高，且呈正相关关系。结论 DMN所致小鼠中毒性慢性肝炎的IL-18、TNF-α mRNA、Fas mRNA的改变与肝组织病理改变同步，呈正相关关系，与人类肝炎时有一定的相似性。     

肝癌瘤周纤维化过程中α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型前胶原mRNA的原位杂交特点

目的：为解决中晚期肝癌临床切除率低、手术创伤大、转移率高等问题，设计了选择性胆管支、门静脉支联合结扎的方法，对大鼠移植性肝癌模型进行了治疗性研究，并观察了瘤周纤维增生特点。方法：应用R—35大鼠肝癌瘤株制备Wister大鼠移植性肝癌模型，分组实施含瘤肝叶的门静脉支胆管支联合结扎术及对照手术。对比观察大鼠病死率、转移率、治疗成功率；原位杂交检测α1(Ⅰ)、α1(Ⅳ)型前胶原mRNA表达及定位情况。结果：手术组瘤周纤维包裹紧密与对照组相比病死率31．3％：68．8％、腹腔转移率31．3％：62．5％、肝内转移率12．5％：43．8％、腹腔转移合并肝内转移率6．3％：37．5％、肺转移率0：18．8％、治疗成功率为43．8％；癌周纤维化早期，Ito细胞及MF主要对α1(Ⅳ)前胶原mRNA做出表达，中期α1(Ⅰ)前肢原mRNA杂交信号开始出现并增多，后期二者趋于稳定。结论：联合结扎法可使肝癌团块周围发生广泛的肝纤维化，有效的包裹和限制了肝癌细胞团的膨胀性生长，显著地降低了肝癌病死率、腹腔和肝内转移率及肺转移率；Ito细胞是癌周纤维化过程中胶原生成的先驱细胞，激活后的Ito细胞可进一步转变为MF和Fb，成为癌周纤维化过程中的主要胶原生成细胞，纤维条束及其中的胶原生成细胞对癌细胞的生长和生物活动有反应能力。     

Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的：观察Resistin基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化。探讨Resistin基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法：体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段（第0～10天）．采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中Resistin基因mRNA的表达水平。结果：①Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化初期（第0～2天）不表达，分化第3天开始表达，分化第4～6天Resistin基因的表达显著上调，分化第6～10天Resistin基因的表达保持在较高水平并趋于稳定；②Resistin基因的表达水平除在诱导分化第3～4天、第6～10天内差异无显著性（P〉0．05）外，其余各时段间表达水平差异均有显著性（P〈0.01）。结论：Resistin基因可能参与了脂肪细胞分化的中晚期过程，在3T3-LI脂肪细胞分化过程中表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。     

PHC1基因敲降对小鼠胚胎干细胞多能干性的影响

探讨多梳家族蛋白PHC1敲降后对小鼠胚胎干细胞(m ESCs)多能干性的影响,并探索其与多能干性基因nanog的转录调控机制。对m ESCs细胞系进行PHC1蛋白沉默处理并设置阴性对照组(control组)和空白对照组(Empty vector组),采用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测PHC1的表达量;荧光素酶报告基因技术(Luciferase Reporter)检测PHC1与nanog reporter之间的转录活性。结果提示:实验组m ESCs呈现分化状态,多能干性基因nanog、oct4、sox2的表达下调,且nanog下调最显著;荧光素酶报告基因结果提示PHC1和nanog可能会形成复合物参与nanog的转录调控(P<0.05)。实验表明,敲降PHC1基因后可能通过影响nanog转录调控,从而参与核心转录调控铁三角(nanog、oct4、sox2)之间的相互转录调控机制,导致m ESCs出现分化,进而参与m ESCs多能干性的维持。     

PHC1基因敲降对小鼠胚胎干细胞多能干性的影响

探讨多梳家族蛋白PHC1敲降后对小鼠胚胎干细胞(mESCs)多能干性的影响,并探索其与多能干性基因nanog的转录调控机制。对mESCs细胞系进行PHC1蛋白沉默处理并设置阴性对照组(control组)和空白对照组(Empty vector组),采用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色检测PHC1的表达量;荧光素酶报告基因技术(Luciferase Reporter)检测PHC1与nanog reporter之间的转录活性。结果提示:实验组mESCs呈现分化状态,多能干性基因nanog、oct4、sox2的表达下调,且nanog下调最显著;荧光素酶报告基因结果提示PHC1和nanog可能会形成复合物参与nanog的转录调控(P<0.05)。实验表明,敲降PHC1基因后可能通过影响nanog转录调控,从而参与核心转录调控“铁三角”(nanog、oct4、sox2)之间的相互转录调控机制,导致mESCs出现分化,进而参与mESCs多能干性的维持。     

VPS13A在3T3⁃L1脂肪细胞分化过程中的表达及调控研究

目的：明确囊泡分选蛋白13A（vacuolar protein sorting 13 homolog A,VPS13A）在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embry- onic fibroblast cells,3T3-L1）分化过程中的表达水平;探索VPS13A对3T3-L1细胞的影响。方法：利用Western blot及Q-PCR法检测3T3-L1细胞在分化过程中VPS13A的表达,利用CRISPR/Cas9系统构建VPS13A稳定敲降细胞系,Western blot和油红染色检测VPS13A敲降后对3T3-L1细胞分化的影响。结果：VPS13A的表达在3T3-L1分化过程的早期降低,在分化的后期升高。敲降VPS13A后,3T3-L1细胞中脂滴增多,参与调控脂肪细胞分化基因的表达水平升高。结论：在3T3-L1细胞中VPS13A的表达水平在分化过程中被调控,敲降VPS13A可以促进3T3-L1细胞的分化成熟。     

槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的探讨槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和油红O染色检测不同浓度(10、30、50、100μmol/L)的槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CAA T/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的表达。结果 10～100μmol/L槟榔碱作用3T3-L1前脂肪细胞12 h和24 h能促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的量效关系。到分化的第9天,与对照组相比,50μmol/L槟榔碱组胞浆中的脂滴明显减少,同时PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平显著降低。结论槟榔碱能促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖、抑制其分化,其机制可能与PPARγ和C/EBPα的表达降低有关。     

胰岛素、地塞米松、甲基异丁基黄嘌呤对脂肪细胞分化过程及PAI-1基因表达的影响

目的　通过体外培养的 3T3 L1细胞分化模型 ,研究胰岛素 (Ins)、地塞米松 (Dex)和甲基异丁基黄嘌呤(Mix)对脂肪细胞分化过程及纤溶酶原激活剂抑制剂 1(PAI 1)基因表达的影响。方法　观察Ins与Dex及Mix加入前后脂肪细胞形态的变化 ,并应用RT PCR方法 ,在不同浓度的Ins、Dex和Mix及其不同组合的条件下 ,对3T3 L1细胞分化为脂肪细胞过程中PAI 1mRNA表达水平进行相对定量分析。结果　Ins与Dex及Mix显著促进了 3T3 L1细胞向脂肪细胞分化 ,Ins、Dex及其组合Ins加Dex对PAI 1基因的表达有促进作用 ,其中尤以0 .15 μmol/LIns加 0 .1μmol/LDex的作用最为显著 ,且有叠加效应。 结论　Ins与Dex加Mix对 3T3 L1细胞分化为脂肪细胞起重要作用 ,同时Ins、Dex对PAI 1基因表达也有显著影响 ,由此为进一步探索其内在的分子机制奠定了基础     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的变化

目的:观察在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)mRNA表达及其蛋白水平的变化,探讨PTP1B与脂肪细胞分化的关系.方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中(第1～10日),采用油红O染色及RT-PCR法检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ2(PPARγ2)基因表达评价脂肪细胞分化成熟情况,RT-PCR法及Western印迹法检测脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达及其蛋白水平的变化.结果:随着脂肪细胞诱导分化逐步深入,油红O染色显示其中脂滴形成逐渐增多,至占全视野90%以上;同时PPARγ2基因表达逐步增多,均提示脂肪细胞分化逐步成熟,至最终分化为成熟脂肪细胞.PTP1B mRNA和蛋白水平在前脂肪细胞中表达较高,随着脂肪细胞的逐步成熟,其表达逐渐降低,至分化成熟时表达水平降至最低.结论:在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中,PTP1B mRNA及其蛋白表达水平逐渐减低,PTP1B可能参与了脂肪细胞分化.     

组蛋白去甲基酶KDM3A介导小鼠骨骼肌细胞中活性氧诱导的E2F1表达

目的：研究在小鼠骨骼肌细胞凋亡过程中E2F1表达上调的表观遗传机制。方法：利用H2O2处理C2C12细胞,利用干扰RNA和瞬时转染相关因子,用实时定量PCR（real?time quantitative PCR,RT?qPCR）与Western blot检测E2F1基因表达水平,染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测蛋白质与DNA的结合。结果：E2F1表达水平上调,同时伴随E2F1基因启动子上H3K9甲基化水平的下降。进一步研究发现,活性氧促进H3K9去甲基酶KDM3A结合到E2F1启动子上促进E2F1转录。相反,使用干扰RNA敲减KDM3A显著减弱活性氧引起的E2F1表达上调。KDM3A干扰同时降低了E2F1启动子上乙酰化H3与H3K4甲基化水平并恢复了H3K9甲基化水平。结论：KDM3A可能通过改变组蛋白修饰参与活性氧诱导的E2F1转录激活。     

小鼠骨组织中转录调控因子CBF1的表达

目的: 探讨转录调控因子CBF1(C-promoter binding factor-1, CBF1)在成鼠骨组织以及小鼠胚胎性骨组织的表达情况.方法: 采用实时RT-PCR方法检测包括骨组织在内的成年小鼠13种器官组织中CBF1的相对表达水平.采用组织原位杂交技术检测小鼠胚胎性趾骨、肋骨和椎骨中CBF1的分布.结果: 转录调控因子CBF1在成年小鼠各组织器官中广泛存在,在骨组织中检测到较高的CBF1表达水平.原位杂交分析显示: 发育中的趾骨和肋骨软骨细胞CBF1阳性染色,染色阳性程度与软骨细胞的分化程度有关;肋骨和椎骨骨化区周围成骨细胞呈强阳性染色;埋入骨基质的骨细胞则呈弱阳性染色.结论: 转录调控因子CBF1参与了小鼠骨组织的发育形成,可能也参与了成熟骨组织的改建和代谢.     

转化生长因子（TGF—β1）mRNA在移植肾纤维化中分子病理机制的研究

目的：为探讨TGF—β1在同种异体肾脏移植后慢性排异反应所致肾纤维化中的作用和意义，揭示其发病机制。方法：32例慢性排异反应失功的移植肾，经手术切除后，取肾组织做常规病理观察和原位杂交，以正常肾组织为对照。结果：纤维化的肾组织TGF—β1表达较正常对照组增高，与纤维化程度呈正相关。结论：TGF—β1可能参与了肾脏移植后慢性捧异反应所致肾纤维化的发生及发展。