三维共培养模型下人脐静脉内皮细胞对鼻咽癌CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响

目的探讨三维共培养下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对CNE2细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响。方法采用Transwell小室对HUVEC细胞和CNE2细胞进行共培养,CCK-8法比较两组实验中CNE2细胞增殖能力,细胞计数法比较细胞迁移能力,以及Matrigel胶法比较侵袭能力。结果 HUVEC与CNE2共培养条件下,共培养组迁移能力显著高于非共培养组(P0.01)。共培养组侵袭能力显著高于非共培养组(P0.01)。在增殖实验中,共培养组和非共培养组的OD值第3天,第4天及第5天,共培养组的细胞增殖率显著高于非共培养组(P0.05)。结论在三维共培养条件下,HUVEC对CNE2鼻咽癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力有促进作用。     

FAK反义寡核苷酸对卵巢癌细胞凋亡、黏附和侵袭性的影响

目的观察黏着斑激酶的反义寡核苷酸对卵巢腺癌细胞株OVCAR-3凋亡、黏附和侵袭性的影响。方法实验分4组,反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组。用脂质体介导的方法,将黏着斑激酶的反义寡核苷酸转入OVCAR-3卵巢癌细胞株,应用流式细胞仪AnnexinV/PI双染色法检测细胞的凋亡率,应用基质胶细胞黏附实验和Boyden小室法检测卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭能力。结果 ASODN组卵巢癌细胞的凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;ASODN组癌细胞与基质胶的粘附率与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;ASODN组癌细胞穿透Matrigel胶的细胞数目与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论抑制黏着斑激酶的表达能增加卵巢癌细胞株OVCAR-3的凋亡,并降低其黏附和侵袭转移能力。     

白血病抑制因子影响人子宫内膜间质细胞血管内皮生长因子表达的体外研究

目的 探讨白血病抑制因子(LIF)在体外条件下对人子宫内膜间质细胞(hESCs)血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响,以及VEGF在体外诱导人脐静脉内皮细胞(HUvECs)形成管腔的能力.方法 体外培养分泌期hESCS,加不同浓度LIF处理24 h.半定量RT-PCR方法检测hESCs VEGF mRNA的表达;Western blot方法检测hESCs细胞沉淀中VEGF蛋白的表达以及培养上清中VEGF蛋白的分泌;收集各组hESCs的培养上清,加入在Matrigel上平铺生长的HUVECs细胞中,观察HUVECs在体外形成管腔的能力.结果 与对照组相比,LIF处理组能明显增加hESCs VEGF mRNA水平的表达,明显增加hESCS VEGF蛋白的表达和分泌;hESCs经LIF处理后的培养上清,能明显增加HUVECs形成新生血管的能力.结论 LIF可能通过增加hESCs VEGF的表达参与调控胚胎着床过程中的血管形成.     

共培养体系中小鼠囊胚对人卵巢癌细胞系HO-8910PM的影响

目的:观察两种具有侵袭特性的小鼠囊胚细胞与人卵巢癌细胞在相同的体外微环境下,动态的相互作用和整体生物学行为变化。方法:建立小鼠囊胚与人高转移卵巢癌细胞系HO-8910PM体外共培养模型,应用MTT法检测HO-8910PM细胞黏附率的改变;应用Transwell体外细胞侵袭实验观察HO-8910PM细胞体外侵袭及趋化性运动能力的变化;应用RT-PCR检测HO-8910PM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2mRNA的表达。结果:癌细胞与小鼠囊胚共培养24h后,大部分囊胚开始边脱带边黏附,推开底层的癌细胞,在囊胚与肿瘤细胞间形成了明显的界限。共培养组的HO-8910PM细胞的黏附率低于对照组。Transwell小室体外侵袭实验及体外趋化性运动实验显示,共培养组穿过滤膜的细胞数明显少于对照组。共培养组MMP-2、MMP-9mRNA的表达及MMP/TIMP较对照组明显下降,TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达略有增加。结论:当人HO-8910PM细胞与小鼠囊胚共培养时,肿瘤细胞失去了特有的侵袭性;小鼠囊胚能显著降低HO-8910PM细胞的黏附、体外侵袭能...     

中华眼镜蛇毒组分F的体外抗血管生成活性研究

目的研究中华眼镜蛇毒组分F对血管内皮细胞黏附功能的抑制作用和体外的抗血管生成活性。方法MTT快速测定法测定组分F对原代培养的血管内皮细胞对纤维蛋白原(Fg)、纤连蛋白(Fn)、Matrigel的黏附作用的影响;采用平面拟毛细血管生成培养法,观察组分F对血管生成的抑制效应。结果组分F可抑制血管内皮细胞的黏附功能,对细胞黏附Fn、Fg和Matrigel 3种物质的作用从1.2μg/ml浓度起即有抑制效应(P<0.05),且均呈浓度依赖性,组分F对细胞黏附Fg和Matrigel的抑制作用较其对Fn的作用强(P<0.05);组分F可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管样网状结构的反应,并且随浓度的不同抑制程度有明显不同。结论中华眼镜蛇毒组分F具有体外抗血管生成活性。     

中华眼镜蛇毒活性组分体外抑制三维血管生成的实验研究

目的研究中华眼镜蛇毒活性组分的抗血管生成作用。方法采用拟血管生成三维培养法,观察活性组分对体外血管生成的抑制效应。结果活性组分可抑制内皮细胞在培养基质中生成血管网状三维结构的反应,0.6、1.2、2.4μg·ml-1的不同浓度组分抑制程度不同。在0.6μg·ml-1浓度组,培养基质Matrigel中的内皮细胞团只形成局部的、不完整的空间网状结构;在1.2μg·ml-1浓度组,悬浮于凝胶中的细胞团所形成的管芽不能相互连接而形成空间网状结构;在2.4μg·ml-1浓度组,细胞散在悬浮于胶层中大部分不能粘聚,且随培养时间的延长无明显的结构变化。结论中华眼镜蛇毒活性组分具有体外抑制血管生成的生物活性。     

紫杉醇对人肝癌细胞SMMC-7721黏附及侵袭转移潜能的影响

目的探讨紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC-7721的黏附及侵袭转移潜能的影响及机制。方法应用体外细胞．基质黏附实验检测不同浓度紫杉醇对SMMC-7721与Matrigel胶（人工基底膜胶）黏附性的影响：Transwell小室模型测定紫杉醇对细胞侵袭和迁移能力的影响;蛋白免疫印迹检测紫杉醇对细胞内黏着斑激酶（FAK）蛋白表达量的影响。结果不同浓度紫衫醇（10、20、40nmol／L）作用SMMC-7721细胞60min后,细胞与Matrigel胶黏附性下降;紫杉醇干预24h后,细胞的侵袭能力及迁移能力随紫杉醇浓度提高而明显减弱;细胞内FAK蛋白的表达量也随紫杉醇浓度增高而明显下降。结论紫杉醇能抑制肝癌细胞SMMC-7721的黏附及侵袭转移,其机制可能与其抑制肝癌细胞内FAK的表达相关。     

蛇毒金属蛋白酶抑制剂重组蛋白抗肿瘤血管生成作用及其机制

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂重组蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor,r SVMPI)对血管生成的影响及其分子机制。方法应用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成模型观察SVMPI重组蛋白对血管生成的影响;采用Alamar Blue分析方法检测人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)增殖能力、Annexin V-FITC双标记流式细胞术检测细胞凋亡、划痕标记法检测细胞体外迁移能力、Boyden小室分析方法检测细胞体外趋化能力及管腔形成法检测体外血管新生能力;通过real-time PCR及Western blot检测重组蛋白处理后的HUVECs KDR、FGFR-1表达。结果r SVMPI减少鸡胚尿囊膜新生血管密度指数,减弱由VEGF诱导的HUVECs趋化能力,抑制HUVECs体外新生小管的形成,降低HUVECs细胞KDR和FGFR-1的表达水平。结论r SVMPI可能通过阻断VEGF-KDR或b FGF-FGFR信号转导途径,发挥抑制血管生成的作用。     

芍药苷促进糖尿病创面愈合

目的研究芍药苷(paeoniflorin,PA)对糖尿病创面愈合作用及作用机制。方法采用糖尿病小鼠全层皮肤切除夹板模型,HE染色及Masson染色观察创面组织形态改变;免疫荧光法检测血管新生。PA干预人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和小鼠成纤维细胞(fibroblast,FB),MTS、Brd U和划痕实验检测细胞增殖和迁移能力; Matrigel实验检测HUVECs成管能力,q PCR检测FB中CollagenⅢ、Fibronectin、α-SMA mRNA的变化;免疫荧光法观察α-SMA在FB中的表达部位及表达量的变化。结果与db/db模型组相比,PA组创面肉芽组织,胶原形成和新生毛细血管密度明显增加(P <0. 01)。PA对HUVECs增殖无影响,可明显促进HUVECs迁移和成管的能力(P <0. 05,P <0. 01)。PA可明显增加FB增殖和迁移的能力,明显增加CollagenⅢ、α-SMA mRNA的表达(P <0. 05,P <0. 01),对Fibronectin mRNA的表达无影响,同时可增加α-SMA的荧光强度。结论芍药苷可能通过促进细胞外基质生成和血管新生,促进糖尿病创面愈合。     

ECV304细胞二维培养形成毛细血管样结构的观察

目的观察ECV304细胞体外二维培养能否形成毛细血管样结构方法采用自然转化的人脐静脉内皮细胞-ECV304细胞株,不用额外的生长因子,选择不同血清浓度的培养液等条件进行二维培养观察。结果ECV304细胞在不同条件下都能形成毛细血管样结构,低浓度血清更容易诱导内皮细胞迁移,形成毛细血管样结构。结论在二维培养时,ECV304细胞具有形成毛细血管样结构的能力,提示其可用作体外血管新生的内皮细胞研究工具。     

基质胶对绒毛外细胞滋养层细胞体外侵袭的介导作用

目的探讨基质胶(Matrigel)在绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)的体外侵袭中的作用。方法取健康早孕妇女(孕7～9周)人工流产绒毛组织,利用Percoll梯度离心法及差速贴壁法,将纯化的绒毛外细胞滋养层细胞,按所需浓度接种于涂有Matrigel培养板或24孔Transwell侵入系统中培养。用细胞免疫荧光法检测TGFβ2、cytokeration7、integrinα1β1。用CCK-8评价细胞生长状况。用Transwell细胞侵入系统检测EVCT的体外侵袭作用。结果①EVCT在Matrigel包被的Petri皿培养4h,用细胞免疫荧光法显示有95%以上的细胞表达TGFβ2、cytokeration7和integrinα1β1;②EVCT在Matrigel培养不同时间后,其生长指数未有明显变化,提示Matrigel对EVCT的生长未有明显影响;③EVCT在Transwell侵袭系统中培养不同时间后,侵袭细胞的OD值提示48h细胞侵袭作用达到平台期。结论 Matrigel在EVCT体外侵袭中并不影响其细胞纯度及其生长曲线,其介导的体外侵袭在48h达到侵入平台期。     

辛伐他汀抑制过表达HER2型结直肠癌的肿瘤血管生成

目的探讨辛伐他汀在结直肠癌(CRC)血管生成调控中的作用及分子机制。方法 Western blot法检测HER2和VEGF蛋白表达。采用Matrigel小管形成、MTT、伤口愈合试验和Transwell检测辛伐他汀对CRC小管形成、增殖、迁移和侵袭能力的影响。另外,采用HTC-116和LoVo细胞构建裸鼠移植瘤模型,模型小鼠分成2组,对照组每日注射0.1 ml磷酸盐缓冲盐水,治疗组小鼠每天注射50 mg/kg辛伐他汀。免疫组化方法检测肿瘤CD31表达情况,计算肿瘤微血管密度(MVD)。观察辛伐他汀对裸鼠肿瘤生长及肿瘤血管形成的影响。结果 VEGF和HER2在CRC细胞中表达上调,而辛伐他汀明显降低其表达。辛伐他汀预处理可减少体外内皮细胞小管形成和体内微血管密度。辛伐他汀明显抑制HRG-β1诱导的血管形成。机制研究显示,辛伐他汀通过抑制VEGF分泌而显著抑制HER2诱导引起的肿瘤血管生成。结论辛伐他汀通过对HER2/VEGF轴的调控抑制肿瘤血管生成,为辛伐他汀抑制过表达HER2型CRC提供了一种新的机制。     

miR-155反义寡核苷酸转染对人大肠癌Lovo细胞侵袭的影响

目的探讨miR-155对人大肠癌细胞侵袭能力的影响。方法大肠癌Lovo细胞分为3组：脂质体介导反义miR-155（AS-miR-155）组、无义寡脱氧核苷酸（ODN）组和对照组。测定荧光素酶活性验证3组细胞中miR-155的表达,采用Matrigel基质生长试验检测细胞生长情况,以Transwe Ⅱ方法检测细胞的侵袭力,结果与对照组和无义ODN组比较,转染AS-miR-155组Lovo细胞miR-2l表达水平降低;Matrigel基质生长试验显示,转染AS-miR-155组Lovo细胞体外培养克隆平均直径较小,Transwe Ⅱ细胞侵袭试验显示转染AS-miR-155组穿膜细胞数较少。结论 miR-2l高表达可促进Lovo大肠癌细胞侵袭生长,提示miR-155可以作为基因治疗大肠癌的候选靶点。     

钙网织蛋白促进新生血管形成在类风湿关节炎发病机制中的作用

目的探讨钙网织蛋白（CRT）促进新生血管形成在类风湿关节炎（RA）发病机制中的作用。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测活动期RA 患者、骨性关节炎（OA）患者和健康对照组（HC）血清以及RA 和OA 患者关节滑膜液中CRT 的含量。采用免疫组织化学（IHC）法检测CRT 在RA 和OA 患者关节滑膜组织中的表达。应用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外模型,分别采用MTT 实验、细胞划痕实验及构建体外血管生成的三维模型检测 CRT 在HUVECs 增殖、迁移及管腔形成中的作用。结果RA 组血清中CRT 含量（[ 6.4±3.1）μg/L]明显高于OA 组（[ 3.7±0.9）μg/L]及HC 组（[ 3.4±1.0）μg/L];RA 组滑膜液中CRT 含量（[ 6.9±3.4）μg/L]明显高于OA 组（[ 3.9±0.7）μg/L],差异有统计学意义（P < 0.01）。CRT 在RA 滑膜组织中高表达,主要位于滑膜衬里层和衬里下层的血管内皮细胞及血管周围、炎性细胞内外等,而OA 滑膜组织中CRT 仅见极少量的表达。MTT 实验、细胞划痕实验及体外血管生成三维模型检测结果显示,CRT 具有明显促进HUVECs 增殖、迁移及管腔形成的作用。结论CRT 在RA 患者血清、滑膜液及滑膜组织中表达均升高,CRT 可能通过促进新生血管形成参与RA 滑膜炎和血管翳形成的发病机制。     

石榴皮鞣质对前列腺癌细胞侵袭转移影响的研究

目的探讨石榴皮鞣质对人前列腺癌PC-3细胞侵袭转移的影响。方法以人前列腺癌PC-3细胞为靶细胞,通过划痕愈合实验检测石榴皮鞣质对体外培养的PC-3细胞运动能力的影响;采用Transwell小室实验(无基质胶)检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动能力的影响,采用Transwell小室实验(有基质胶)检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响;采用裸鼠肺转移模型检测石榴皮鞣质对PC-3细胞体内侵袭能力的影响。结果划痕愈合实验结果显示,石榴皮鞣质能够抑制PC-3细胞的运动性,随着石榴皮鞣质浓度增加,其抑制PC-3细胞运动能力也逐渐增强,呈明显的浓度依赖性,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);Transwell小室实验(无基质胶)显示,石榴皮鞣质能够抑制PC-3细胞运动;与空白对照组相比,随着石榴皮鞣质浓度增加,其降低PC-3细胞运动性也逐渐增强(P<0.05);Transwell小室(有基质胶)侵袭实验显示,与空白对照组相比,含有不同浓度石榴皮鞣质的实验组中,PC-3细胞穿膜细胞数即抑制其侵袭性得到有效抑制,与空白对照组相比,随着药物浓度的增加,其抑制侵袭性能力也逐渐增强(P<0.05);此外,裸鼠肺转移模型结果显示,石榴皮鞣质能够抑制PC-3细胞的侵袭性;与空白对照组相比,随着石榴皮鞣质浓度增加,PC-3细胞形成的肺转移瘤减少(P<0.05)。结论石榴皮鞣质对人前列腺癌PC-3细胞侵袭转移具有抑制作用,能抑制前列腺癌的侵袭转移。     

干细胞样U87胶质瘤细胞向内皮细胞转分化及VEGFR2人源化单克隆抗体的干预作用

目的建立干细胞样U87胶质瘤细胞向内皮细胞的转分化模型,初步评价抗VEGFR2人源化单克隆抗体对转分化的影响。方法体外诱导培养获得干细胞样U87胶质瘤细胞;流式细胞仪检测CD133+细胞含量;定量PCR检测CD133、Nestin以及VEGFR2表达;观察干细胞样U87细胞的致瘤能力、肿瘤生长速度和CD31表达情况;观察干细胞样U87细胞在Matrigel上血管状结构形成和CD31、CD34、vW F表达情况;建立干细胞样U87细胞向内皮细胞的转分化模型,评价抗VEGFR2人源单抗对转分化的抑制作用。结果获得干细胞球样的U87细胞,其肿瘤生长更快,且血管增多,接种在Matrigel上形成血管状结构,CD31、CD34、vW F表达增加;抗VEGFR2人源单抗使血管状结构和CD31、CD34、vW F表达均减少。结论成功建立干细胞样U8细胞向内皮细胞转分化模型,VEGFR2人源化单抗对转分化有抑制作用。     

β-榄香烯对血管内皮细胞增殖及成血管能力的影响

目的观察β-榄香烯对血管内皮细胞增殖,细胞周期以及成血管能力的影响,探讨β-榄香烯对肿瘤血管生成的抑制作用。方法人脐静脉内皮细胞ECV-304体外培养,β-榄香烯干预;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测β-榄香烯对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期;Matrigel胶检测细胞成血管能力。结果ECV-304细胞经过β-榄香烯干预,其存活率明显降低,并呈计量依赖性。细胞周期检测结果显示,β-榄香烯干预后,G1期细胞增多,进入S期及G2期细胞明显减少,细胞周期被阻滞于G1期;接种于Matrigel胶的ECV-304细胞经β-榄香烯干预后,形成管腔数目减少,成血管能力明显降低。结论β-榄香烯可直接干扰血管内皮细胞的增殖及细胞周期,阻滞细胞从G1期进入S期及G2期,并降低其成血管能力。     

三甲胺-N-氧化物协同RAS诱导动脉粥样硬化发展机制研究

目的 探究三甲胺-N-氧化物(TMAO)与肾素-血管紧张素系统(RAS)在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症中的关系及作用机制。方法 采用分子克隆技术，构建血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)过表达和敲减的HUVECs; TMAO干预上述HUVECs后，检测细胞中炎症因子及细胞增殖、迁移、血管形成能力，并分析细胞中RAS重要组分的表达水平。结果 成功构建了AngⅡ过表达和敲减的HUVECs; AngⅡ过表达促进TMAO调节HUVECs炎症，抑制HUVECs增殖，抑制HUVECs迁移能力，抑制HUVECs血管形成，促进细胞中RAS组分AGT、ACE、AngⅡ、ATR的表达；敲减AngⅡ抑制TMAO调节HUVECs炎症，促进HUVECs增殖，促进HUVECs迁移能力，促进HUVECs细胞的血管形成，抑制细胞中RAS组分AGT、ACE、AngⅡ、ATR的表达。结论 TMAO能够协同RAS诱导HUVECs炎症。     

紫杉醇抑制血管生成的研究

采用大鼠动脉环无血清培养形成微血管方法，测定紫杉醇抑制血管生成作用。将大鼠动脉段包埋于纤维蛋白胶中，用ＭＣＤＢ１３１无血清培养液进行体外培养，内皮细胞从动脉段切口处向外生长，形成具有分枝的微血管样结构，每日计数血管长生量，绘制生长曲线。结果表明，紫杉醇是一种血管生成抑制因子。动脉环模型是一种有用的血管生成动态、定量的体外测定方法。     

血管内皮祖细胞用于构建血管新生的体外三维模型

目的 采用血管内皮祖细胞(EPCs)体外构建血管新生的三维模型,证实体外获得的EPCs参与血管新生.方法 (1)密度梯度离心法获取兔外周静脉血的单个核细胞,贴壁筛选法分离EPCs,于添加了Singlequotes的EBM-2培养液中扩增,对培养14 d的细胞进行免疫荧光及免疫组织化学鉴定;(2)用上述同样的方法 获取EPCs,并接种于Matrigel三维基底膜胶,Singlequotes诱导,倒置相差显微镜观察血管形成.结果 (1)培养7～9 d,光电显微镜可见细胞集落形成,呈现干细胞特件;贴壁细胞表达血管性假血友病因子(vWF)、血管内皮生长凶子受体2(VEGFR-2)和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin),呈现内皮细胞系特征;贴壁细胞用碳化青染料(DIL)标记的乙酰化低密度脂蛋白(DIL-ac-LDL)及FITC标记的Ⅰ型荆凝集素(F1TC-UEA-1)双荧光阳性,显现EPCs的生物学特性;(2)动态观察;培养2周左右,在三维胶体中形成血管结构.结论 外周血米源的EPCs,经过体外诱导后.具有成血管能力,可应用于制备体外血管新生的三维模型.