热应激对慢性粒细胞白血病细胞系K562中热休克蛋白gp96表达的影响及其意义

本研究查明不同热应激条件对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中热休克蛋白gp96表达量的影响，为寻找增加K562细胞中gp96的提取量的最佳热应激条件提供实验依据。用免疫组织化学方法检测经38、40、42、44、46及48℃水浴热休克处理30分钟后的K562细胞中gp96表达量的变化；以平均阳性细胞百分率和平均荧光强度为指标，用流式细胞术研究40、44、48及52℃各水浴热休克处理30分钟对K562细胞中gp96表达量的影响；利用免疫印记原理，用Westem blot技术研究K562细胞经40、44、48与52℃水浴各休克处理30分钟后gp96表达量的变化。结果表明：免疫组织化学方法显示gp96主要在胞浆内表达，在48℃水浴热休克处理30分钟时，强阳性的细胞数最多，积分也最高；流式细胞术显示平均阳性细胞百分率和平均荧光强度均在48℃水浴热休克处理30分钟组达高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义；Westernblot显示48℃水浴热休克处理30分钟时gp96的表达量达到高峰，各温度间gp96表达量的差异有统计学意义。结论：48℃水浴热休克处理30分钟，gp96在K562细胞中的表达量达到高峰，该条件可作为提取K562细胞gp96的一个有效预处理条件。     

热休克蛋白90抑制剂17-AAG诱导K562细胞凋亡作用的研究

目的研究热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂17-AAG诱导人白血病细胞系K562细胞凋亡及其分子机制。方法用17-AAG处理K562细胞,用四氮唑盐还原法(MTT法)检测17-AAG对K562细胞增殖抑制的剂量-时间-效应关系,瑞特-姬姆萨染色观察细胞形态学变化,Hoechst 33342荧光染色观察凋亡细胞核的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期变化,Western blot检测相关蛋白分子的变化。结果17-AAG呈时间和剂量依赖性抑制K562细胞,5μmol／L 17-AAG作用24 h,K562细胞增殖抑制率接近50％,阻断细胞周期于G0／G1期。5μmol／L 17-AAG作用12 h G0／G1期细胞占47．22％;24 h占71．62％,并出现明显的凋亡峰。17-AAG可有效清除Hsp90底物蛋白,阻断Raf／Mek- Erk及PI3K／Akt信号通路。结论17-AAG通过抑制K562细胞中Hsp90的分子伴侣功能,清除其底物蛋白Bcr-Abl、Raf-1、Akt、Cdk4、XIAP、survivin等,导致细胞内与增殖和抗凋亡相关的Raf/Mek-Erk、PI3K／Akt信号通路被阻断,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

热休克蛋白gp96在人胃癌组织中的表达及与胃癌生物学行为的关系

热休克蛋白（HSPs）是一类在生物进化过程中极为保守的蛋白质，其广泛存在于原核和真核生物细胞中，在应激状态下可被诱导表达，因此又称应激蛋白（SP）。HSPgp96是HSPs家族的重要成员。本研究采用免疫组织化学法检测胃癌中HSPgp96，并结合患者的临床和病理资料分析与探讨HSPgp96在胃癌的发生、发展过程中的作用以及与胃癌耐药性的关系和胃癌预后的判断。     

K562细胞过表达MHC Ⅰ类相关抗原A对树突状细胞吞噬功能的影响

目的观察过表达MHC Ⅰ类相关抗原A(MICA)的K562细胞,体外经诱导凋亡后,对树突状细胞(DC)吞噬功能的影响。方法首先利用脂质体介导的基因转染技术和G418筛选过程,建立稳定表达MICA的K562细胞(K562-MICA)。其次分别取K562、K562-MICA细胞经CFSE标记,并用丝裂霉素C诱导凋亡,与单核细胞系THP1或外周血单核细胞来源的DC共孵育过夜,流式细胞术检测2种细胞吞噬凋亡小体的活性。同时检测THP1细胞表面相关活化性受体的表达,以及DC表面NKG2D受体的情况。最后,在细胞共培养体系中加入NKG2D抗体,观察DC吞噬活性的变化。结果 K562-MICA细胞可刺激THP1细胞上调CD86和MICA的表达,但对HLA-DR及NKG2D的表达无明显影响。与K562细胞相比,来自K562-MICA的凋亡小体更容易被DC吞噬。K562-MICA凋亡小体可诱导DC上调NKG2D表达,NKG2D抗体具有显著拮抗DC吞噬功能的活性。结论 MICA过表达于K562细胞后具有促进DC吞噬功能的活性,这种活性依赖于DC表面NKG2D的表达。     

局部微波热疗对热休克蛋白表达的影响

目的：探讨骨肉瘤术中热疗对热休克蛋白表达的影响。方法：对61例骨肉瘤组织进行免疫组化染色，观察热休克蛋白HSP－60、HSP－70及GP－94的表达。结果：骨肉瘤组织中GP－94表达最高，阳怀率为100％，其 次为HSP－60，阳性率为94．5％，HSP－70弱表达，阳性率41．8％。热疗后HSP均不同程序增多，以HSP－70较明显，阳性率上升到72％。体外骨肉瘤细胞株加热后热休克蛋白也明显增多。结论：局部微波热疗后，3种热休克蛋白在骨肉瘤组织均有表达。     

热休克蛋白70激发树突状细胞抗肝癌作用的实验研究

肿瘤的治疗除了手术、放疗、化疗外,另一个不可忽视的疗法就是免疫治疗,近年来它在肿瘤治疗中的作用越来越受到重视。本实验通过在体外用脐带血诱导树突状细胞（DC）,并用由肝癌细胞SMMC-7721提取的热休克蛋白70-肿瘤肽复合物（HSP70-PC）负载DC,检测其对肝癌细胞的杀伤作用,证明此活化DC对肿瘤细胞的特异性杀伤活性,为临床应用提供实验依据。     

热休克及化疗刺激对人白血病细胞K562中HSP70 mRNA及MDR1 mRNA表达的影响

为了研究热休克、Adriamycin（ADM）化疗应激刺激下热休克蛋白70（HSP70）、多药耐药基因MDRl的表达情况，对K562细胞予以43℃高温热休克和（或）加以ADM化疗，然后采用免疫组织化学方法检测HSP70的表达，MTT法检测K562细胞的生长抑制率，RT—PCR检测HSP70 mRNA和MDRl mRNA的表达，流式细胞术检测P-糖蛋白（P—gP）的表达。结果显示：①HSP70蛋白的合成在43℃热作用后恢复37℃孵育2小时达到高峰并聚集在胞核和核仁内，呈“核内迁移”现象；3小时后HSP70表达开始降低，5小时后HSP70的合成逐渐降低至正常，并恢复以胞浆表达为主。②K562细胞在43℃高温热休克刺激下HSP70mRNA表达增加，随着37℃孵育时间的延长表达量有增多趋势并持续一段时间，MDRlmRNA的表达与之相似，二者在37℃孵育2小时分别增加4倍和5．8倍。③ADM化疗刺激后细胞内P—gP表达增加；ADM化疗、43℃热休克刺激后再加ADM化疗，K562细胞中HSP70 mRNA、MDRl mRNA表达均上调，且43℃热休克刺激处理后再加入ADM作用二者的表达要高于单加ADM化疗组。结论：热休克和ADM化疗刺激的K562细胞中HSP70和MDRl表达增加，有利于维护肿瘤细胞的稳定性，HSP70可能与耐药有关。     

人原发性肝细胞癌中热休克蛋白70mRNA的表达

目的 检测热休克蛋白70mRNA在人原发性肝癌中的表达情况,探讨热休克蛋白70在原发性肝癌演变过程中的意义。方法 采用原位杂交技术,用地高辛标记的热休克蛋白70cDNA探针检测41例人原发性肝癌组织及20例肝硬变组织。结果 原位杂交结果显示41例原发性肝癌组织中21例热休克蛋白70mRNA阳性（51．2％）,20例肝硬变组织有11例阳性（55．0％）,两组之间无显著差异（P＞0．05）。结论 热休克蛋白70mRNA在人原发性肝癌组织中及肝硬变组织中有较高水平的表达,提示热休克蛋白70参与了原发性肝癌的发生及发展过程,对其生物学特性作进一步研究,可能为肝癌发病机制提供一定的理论依据。     

热休克蛋白70对大鼠体外心脏细胞功能的影响

目的：观察重酒石酸去甲肾上腺素诱导后热休克蛋白70在体外心脏中的表达,并探讨热休克蛋白70对大鼠体外心脏细胞功能的影响.方法：实验于2003-03/09在华中科技大学同济医学院药理实验室进行.取成年雄性Wistar大鼠12只,随机分为2组,每组6只：[1]生理盐水组：腹腔注射生理盐水0.4 mL,注射后24 h取体外心脏,常规建立Langendorff体外心脏灌注模型,灌注15 min转为工作心15 min后停灌45 min,恢复灌注15 min改为工作心30 min.[2]重酒石酸去甲肾上腺素组：腹腔注射重酒石酸去甲肾上腺素3.1μmol/kg（0.53 mg/kg）,24 h后取体外心脏,方法同生理盐水组.采用Western blot法测定心肌细胞中热休克蛋白70含量及生化指标.结果：12只大鼠全部进入结果分析.[1]热休克蛋白70含量（吸光度）：重酒石酸去甲肾上腺素组明显高于生理盐水组（t=10.16,P＜0.01）.[2]生化指标：重酒石酸去甲肾上腺素组三磷酸腺苷含量、超氧化物歧化酶活性、心肌线粒体Ca^2＋-ATPase活性、心肌线粒体合成三磷酸腺苷能力优于生理盐水组[（13.67&;#177;2.60）,（5.36&;#177;0.89）μmol/g;（2.44&;#177;0.14）,（4.64&;#177;0.29）μkat/g;（6.77&;#177;0.90）,（2.54&;#177;0.28）μkat/g;（124.22&;#177;13.58）,（61.25&;#177;5.84）mmol/g;P均＜0.01],丙二醛含量、肌酸激酶和乳酸脱氢酶漏出率、心肌细胞内Ca^2＋含量、心肌线粒体Ca^2＋含量低于生理盐水组（P＜0.01）.结论：重酒石酸去甲肾上腺素诱导的热休克蛋白70的高表达对缺血再灌注未成熟心肌细胞功能具有明显的保护效应,可以减轻细胞内和线粒体内Ca^2＋超载而发挥其细胞保护效应,减轻再灌注损伤.     

热休克蛋白gp96在人胃癌组织中的表达及与胃癌生物学行为的关系

热休克蛋白(HSPs)是一类在生物进化过程中极为保守的蛋白质,其广泛存在于原核和真核生物细胞中,在应激状态下可被诱导表达,因此又称应激蛋白(SP)。HSPgp96是HSPs家族的重要成员。本研究采用免疫组织化学法检测胃癌中HSPgp96,并结合患者的临床和病理资料分析与探讨HSPgp96在胃癌的发生、发展过程中的作用以及与胃癌耐药性的关系和胃癌预后的判断。将有助于探讨HSP在胃癌中的作用及对开发新的抗癌方法有着重要的意义。1材料与方法1.1临床资料收集南通瑞慈医院2002年5月~2004年11月行胃癌根治术的肿瘤石蜡包埋标本93例,所有病例诊断明…     

热休克蛋白90α、70、27mRNA在急性白血病细胞中表达的研究

运用RNA分子杂交的方法,观察了热休克蛋白(heat shock protein,HSP)90α、70、27在22例白血病病人细胞,正常血细胞及K562红白血病细胞系中的表达。结果表明:16例白血病病人中,4例急性淋巴细胞白血病(ALL),6例急性非淋巴白血病(ANLL)、1例慢性粒细胞白血病急变期(慢粒急变)和2例骨髓增生异常综合征(MDS)血细胞呈现HSP27高水平表达,较正常血细胞显著增多,ALL(5例)与ANLL(7例)白血病细胞HSP27表达水平无明显改变。检测了7例白血病细胞HSP70的表达水平,除1例ALL及1例MDS明显升高外,其余5例(包括1例ALL,3例ANLL和1例慢粒急变)显著低于正常血细胞。17例白血病病人细胞(包括9例ANLL、5例ALL、2例慢粒急变和1例MDS)HSP90α表达水平均升高,明显高于正常。结果提示:白血病细胞HSP90α表达水平的升高可能与白血病细胞活跃异常增殖有关,而HSP27基因的高表达可能不是某种急性白血病的特殊标志。     

放线菌素D诱导卵巢癌细胞凋亡中热休克蛋白(HSP)的作用的研究

目的探讨热休克蛋白(heat shock protein,HSP)在放线菌素D(actinomycin D,Act-D)诱导卵巢癌细胞A2780凋亡中的作用,为进一步探讨热休克蛋白抗凋亡机制及卵巢癌生物治疗提供实验依据。方法体外培养的卵巢癌细胞A2780于RPMI1640,10%(v/v)胎牛血清,5%(v/v)CO_2孵育,取指数生长期细胞1×10~5/ml接种反应板24h,分为非热休克组(NHS)和热休克组(HS),两组分别由不同浓度(5,10,20μg/ml)Act-D诱导,作用4h。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)和~3H-TdR掺入试验检测肿瘤细胞凋亡指数(AI)及DNA合成情况。结果HS组比NHS组凋亡指数明显下降(P<0.01);cpm值明显升高(P<0.01),呈现剂量依赖效应。结论热休克反应对卵巢癌细胞A2780经Act-D诱导凋亡具有抑制作用,此作用与Act-D呈剂量依赖效应。     

树突状细胞融合瘤苗体内外诱导特异性抗白血病免疫的实验研究

本研究观察615鼠骨髓来源树突状细胞(DC)与白血病细胞L615融合瘤苗L615/DC体内外诱导特异性抗白血病免疫的能力。分别制备615鼠骨髓来源DC,用PEG融合法将DC与照射灭活的L615制备L615/DC融合瘤苗并免疫动物,用MTT法和LDH法测定L615/DC融合瘤苗免疫鼠脾细胞体外MLR反应和对L615特异性杀伤活性,同时通过免疫治疗实验检测L615/DC融合瘤苗的体内抗白血病作用。结果表明:研究获得了具有特征形态的树突状细胞,MLR反应表现出强大的异基因免疫刺激功能,当L615/DC融合瘤苗免疫鼠的脾细胞再次接触L615抗原时表现出强烈的增殖活性;LDH实验显示,融合瘤苗组、共培瘤苗组和灭活L615组均可在体外诱导扩增出L615特异性CTL,但融合瘤苗组的CTL在不同效靶比、不同孵育时间的特异性杀伤活性均明显高于另两组(P<0.01)。体内免疫治疗实验中L615/DC融合瘤苗治疗组平均寿命为25.7±1天,有1/4小鼠长期存活,而对照组全部死亡,平均寿命17.5±1天。2个月后对治疗组存活鼠用致死剂量L615攻击不发病。结论:L615/DC融合瘤苗可诱导强大的特异性抗L615免疫,它不仅在体外能特异性识别并杀伤L615细胞,还可有效抑制荷瘤鼠体内肿瘤的生长,延长存活时间,并产生免疫记忆,抵抗肿瘤的二次攻击。L615/DC融合瘤苗为肿瘤免疫治疗提供了新的手段。     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

热休克蛋白70在大鼠黑质多巴胺神经元损伤中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 70 (HSP70 )在大鼠黑质多巴胺 (DA)神经元损伤中的表达以及在帕金森病 (PD)诊断中的意义。方法 :将 48只大鼠随机分为黑质DA神经元损毁组 (PD组 )和对照组各 2 4只。PD组注射 6 羟多巴胺 (6 OHDA)损毁大鼠黑质DA神经元 ,对照组仅注射 6 OHDA溶媒。于注射后 1、7、14及 2 1d采用免疫组织化学、尼氏染色、电镜手段动态观察HSP70在损毁的DA神经元中的表达以及DA神经元形态学变化。结果 :在 6 O HDA损毁黑质 1～ 2 1d ,对照组黑质HSP70表达和尼氏细胞计数差异无显著性 (P >0 .0 5 )。PD组HSP70表达在 1d最高 ,7d锐减 ,14和 2 1d则逐渐减少 ,分别为 2 5 %、74%、87%及 88% ;尼氏细胞计数在 4个时间点分别减少1%、13%、35 %及 48% ;超微结构损伤程度呈进行性加重。结论 :PD渐进性发病具有其形态学基础 ,HSP70可作为DA神经元存活的指标和早期诊断PD的指标。     

树突状细胞外泌体免疫作用机制的初步研究

为了研究外泌体（exosome）作为肿瘤疫苗刺激免疫应答作用的机制，从正常人外周血单个核细胞诱导树突状细胞（DC）制备负载肿瘤抗原的DC外泌体（Dex），研究其在DC有无或DC成熟状态不同的情况下刺激T细胞增殖的能力；通过实验阻断DC外泌体上一些分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后检测外泌体免疫学功能的改变；采用共聚焦显微镜检测DC对外泌体的吞噬作用，用流式细胞仪检测阻断外泌体表面分子对DC吞噬外泌体作用的影响。结果表明：在无DC存在或未成熟DC存在的情况下未成熟DC外泌体（imDex）和成熟DC外泌体（mDex）均不能有效地激活T细胞；不同的促成熟因子（LPS、TNF-α、CpG、CD40L）诱导成熟的DC所分泌的外泌体在数量上无明显差别，但在功能上有显著差异；Dex表面分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83与其功能有关，阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用；共聚焦显微镜和流式细胞仪检测表明阻断CD11a、cD54抑制了Dex靶向DC及被DC吞噬。结论：外泌体可以通过其表面分子靶向DC进而引起T细胞免疫应答。     

热休克蛋白90在多发性骨髓瘤患者中的表达及临床意义

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓标本中HSP90的表达情况,并探讨其临床意义.方法:利用免疫组化技术检测HSP90在76例MM患者及29例健康供者中的表达;收集临床资料,分析HSP90表达情况与临床指标的相关性.结果:MM患者骨髓标本中HSP90表达阳性患者数明显高于对照组;HSP90表达水平与患者的β2-微球蛋...     

热休克蛋白与肿瘤细胞耐药

热休克蛋白(HSP)是在热应激和有害的理化因素作用下,细胞应激产生的一组高度保守性的蛋白质,具有广泛的生物学功能。近年来研究表明,HSP与肿瘤细胞耐药关系密切,已成为肿瘤耐药研究的一个新靶点。本文综述HSP参与肿瘤耐药的机制及克服对策。     

脐血源树突状细胞促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应

本研究探讨人脐血单个核细胞体外诱导分化的树突状细胞（DC）促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。利用淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,经贴壁法获得脐血贴壁的单个核细胞,经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）体外诱导分化为脐血DC。用间接免疫荧光法检测DC,MTT法检测DC活化的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。试验组加DC,DC与肿瘤细胞的比例分别为20∶1、50∶1、100∶1,对照组不加DC。结果表明：脐血单个核细胞经GM-CSF、IL-4诱导后,第15天在倒置显微镜下可见典型形态的DC。荧光显微镜下,CD1a＋细胞率为（43.12±5.83）%。各实验组与对照组比较,实验组DC刺激的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应均高于对照组,差别均具有显著性（P〈0.01）。100∶1组与50∶1组比较,对肿瘤细胞的杀伤效应差别无统计学意义（P〉0.05）;100∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组,差别有统计学意义（P〈0.05）;50∶1组对肿瘤细胞的杀伤效应低于20∶1组,差别有统计学意义（P〈0.05）。结论：人脐血单个核细胞体外经细胞因子诱导分化培养的DC可促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。