人胰岛素原基因在体外培养的NIH 3T3细胞中的基因转移和表达的研究

研究人胰岛素原基因在体外培养的小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３细胞系的基因转移和表达情况,进而为１型糖尿病的基因治疗提供实验依据。方法采用脂质体转染法分别将未携带外源基因的反转录病毒载体ｐＬＮＣＸ和携带大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子－人胰岛素原基因的重组反转录病毒载体ＰＮ－ＰＥＰＣＫ－ＩＮＳ转染到体外培养的ＮＩＨ３Ｔ３细胞中,转染后７２小时,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞克隆并培养至２４天,提取细胞的染色体     

肌球蛋白ⅡB对人脐静脉血管内皮细胞中肿瘤坏死因子受体1转位影响的观察

目的:观察非肌肉肌球蛋白重链ⅡB(nonmuscle myosin heavy chainⅡB,NMHC-ⅡB)对人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中肿瘤坏死因子受体1(TNF receptor 1,TN-FR1)转位的影响。方法:将成功构建的重组pEGFP-N1/TNFR1载体通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染入HUVECs,筛选获得稳定克隆株。设计并合成NMHC-ⅡB的小分子干扰RNA(small interference RNA,si RNA),用脂质体LipofectamineTM2000转染进入该稳定克隆株,差速离心加蔗糖密度梯度离心收获细胞质膜,Western印迹法观察TNFα诱导前和诱导后细胞质膜上TNFR1蛋白含量的变化。结果:与空白对照组比较,转染NMHC-ⅡB si RNA组进入HUVECs,可以明显抑制细胞内NMHC-ⅡB mRNA的表达[(0.670 4±0.024 2)∶(0.454 0±0.041 1),P<0.01],也可以明显减少TNFα诱导前[(0.430 6±0.028 9)∶(0.324 8±0.016 7),P<0.01]和诱导后[(0.660 9±0.026 5)∶(0.492 2±0.021 7),P<0.01]细胞质膜TNFR 1的含量。在转染NMHC-ⅡB si RNA的细胞,TNFα的诱导仍然可以提高细胞质膜TNFR 1的含量,诱导前、后比较[(0.324 8±0.016 7)∶(0.492 2±0.021 7),P<0.01]。结论:NMHC-ⅡB可能在TNFR1从反式高尔基体到细胞质膜的转位或运输中起正向作用,但是可能并不是惟一的或决定性的因素。     

人CⅡTA基因不同单倍型cDNA真核表达载体的构建

目的 构建人MHCⅡ类反式激活因子（CⅡTA）基因3种不同单倍型cDNA的真核表达载体。方法 以野生型重组质粒EBS-NPL-CⅡTA cDNA为模板,用重叠延伸PCR定点突变技术对CⅡTA基因编码区的两个非同义单个核苷酸多态性（SNP）位点进行突变,制备CⅡTA基因另外3种单倍型CDNA的部分片段。将其分别克隆至EBS-NPL-CⅡTA酶切后的线性化载体上,通过菌落PCR及酶切鉴定获得阳性克隆,并对其进行测序鉴定。然后将4种单倍型的真核表达载体和空载体EBS-NPL分别转染至HepG2细胞,用间接细胞免疫荧光技术检测其HLA-DR分子的表达。结果 成功制备人CⅡTA基因3种单倍型CDNA的部分片段,并获得含有CⅡTA基因3种不同单倍型cDNA完整序列的真核表达载体。证实未经转染和转染空载体的HepG2细胞无HLA-DR分子的表达,转染4种真核表达载体的HepG2细胞均可表达HLA-DR分子。结论 成功构建人CⅡTA基因不同单倍型的真核表达载体,为研究CⅡTA基因不同单倍型功能之间的差异奠定基础。     

狂犬病病毒基质蛋白74位氨基酸位点对其线粒体定位的影响

目的 探究狂犬病病毒基质蛋白第74位组氨酸(H)对全长病毒基质蛋白(M)定位至线粒体的影响。方法 通过构建野生型M蛋白或其74位氨基酸突变蛋白(H→P,H74P)C端或N端与V5(标签蛋白)-APEX2(改进型的抗坏血酸过氧化物酶)或APEX2-V5融合表达的真核表达载体,分别转染293T细胞,荧光染色结合激光共聚焦拍照技术分析M基因第74位组氨酸突变对全长M蛋白定位至线粒体的影响。结果 首先免疫印迹结果显示所构建的真核表达载体均能正常表达相应融合蛋白,在此基础上荧光染色实验结果显示74位aa的突变(H→P)未使得全长病毒M蛋白失去定位至线粒体的能力。结论 成功分析74位氨基酸位点对全长病毒M蛋白线粒体定位的影响,为M蛋白生物学功能和狂犬病病毒复制机制的研究奠定基础。     

CD40反义RNA对系统性红斑狼疮患者B淋巴细胞功能的影响

目的　探讨瞬间表达的CD4 0反义RNA对EB病毒转染的系统性红斑狼疮 (SLE)患者B淋巴细胞CD4 0分子表达、细胞增生以及免疫球蛋白 (Ig)分泌功能的影响。 方法　构建人CD4 0反义RNA的真核表达载体CD4 0 /pcDNA3,并将其转染入EB病毒转染的SLE患者B淋巴细胞中。应用流式细胞仪 (FACS)检测观察B淋巴细胞膜上CD4 0分子表达的变化 ;应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法 (MTT)观察反义CD4RNA对B淋巴细胞增生能力的影响 ;应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定转染后的B淋巴细胞的Ig分泌功能。结果　与转染pcDNA3空载体组相比 ,转染CD4 0 / pcDNA3组的CD4 0分子的表达明显降低 (P <0 0 1) ;细胞的增生能力明显降低 (P <0 0 5 ) ;细胞的Ig分泌功能明显受抑制 (P <0 0 1)。结论　CD4 0反义RNA对SLE患者的B淋巴细胞有明显的免疫调控作用。     

肿瘤坏死因子受体2突变载体对巨噬细胞炎症反应的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子受体超家族1B（TNFRSF1B）196位基因多态性（T突变为G）与巨噬细胞TNF/TNFR2信号通路介导炎症反应的相关性。方法 运用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA6.0-TNFR2196Met和pcDNA6.0-TNFR2196Arg,采用脂质体转染法分别转染至巨噬细胞中,转染48 h后使用杀稻瘟菌素抗性筛选4周,建立稳定转染细胞系。将酶消化法培养的巨噬细胞分为四组：空白对照组、pcDNA6.0空质粒组、pcDNA6.0-TNFR2196Met组及pcDNA6.0-TNFR2196Arg组。采用酶切及测序法鉴定重组质粒,RT-PCR检测肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）、cIAP₁、cIAP₂ mRNA的变化;Western blot检测p-JNK、cIAP₁、cIAP₂、TNFR2及核因子κB（NF-κB）的蛋白表达;ELISA检测细胞上清液可溶性TNFR2（sTNFR2）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）水平。结果酶切测序结果显示成功构建了TNFR2基因196Met和196Arg表达载体。转染到巨噬细胞后,与空白对照组和pcDNA6.0空质粒组比较,pcDNA6.0-TNFR2196Arg组、pcDNA6.0-TNFR2196Met组TNFR2、cIAP₁、cIAP₂、IL-1β、IL-6和p-JNK的表达增高（P<0.05）;与pcDNA6.0-TNFR2196Met组比较,pcDNA6.0-TNFR2196Arg组TNFR2、cIAP₁、cIAP₂、IL-1β、IL-6和p-JNK的表达明显降低（P<0.05）,TNFR2196Arg介导的NF-κB活性显著降低。结论 成功构建稳定表达TNFR2196Met、TNFR2196Arg载体,TNFR2突变通过TNF/TNFR2信号通路介导炎症反应,可能是参与慢性炎症性疾病的作用机制。     

可溶性TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法:以RT-PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

AT2R基因转染对血管平滑肌细胞增殖核抗原表达的影响

目的:探讨血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因体外及体内转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖核抗原(PCNA)表达的影响。方法:细胞爬片及大鼠颈动脉球囊损伤后,局部转染带有绿色荧光蛋白报告基因的AT2R重组腺病毒载体(pAd-AT2R)或病毒载体(pAd-GFP),于细胞转染后48h及术后14d取材,应用免疫组织化学染色、免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测了VSMC及血管中AT2R与PCNA的表达关系。结果:pAd-AT2R转染VSMC后,在激光共聚焦显微镜下胞质及胞核有绿色荧光蛋白表达;同时在胞质有红色荧光AT2R表达,胞核无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红色荧光AT2R表达的VSMC胞核有蓝色荧光,PCNA表达阳性。pAd-AT2R在体转染大鼠颈动脉后,新生内膜及中膜中PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组[(27.29±5.81)%∶(72.25±4.47)%,(68.43±9.12)%,P<0.01];在激光共聚焦显微镜下,绿色荧光及红色荧光AT2R主要分布于新生内膜、中膜、外膜,内膜散在蓝色荧光PCNA表达,在红、绿色荧光处无蓝色荧光,PCNA表达阴性,无红、绿色荧光处,有蓝色荧光,PCNA表达阳性。结论:AT2R基因体外及体内转染可抑制VSMCPCNA表达,ATR基因转染能抑制新生内膜增生。     

小鼠全长膜型Klotho蛋白cDNA表达体系的构建与应用

目的克隆编码小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段,构建、包装Klotho重组腺相关病毒表达体系,并检测rAAV/mKL载体表达功能。方法选择RT-PCR扩增小鼠全长mKL蛋白的基因片段,将该片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-IRES-hnGFP,采用酶切及DNA测序鉴定;利用AAV-293细胞包装rAAV/mKL,经转染7901细胞,检测其Klotho表达情况。结果本文成功克隆出序列信息和读码框完全正确的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段,并构建pAAV/mKL克隆。在AAV-293细胞中包装出rAAV/mKL,病毒原液转染7901细胞后其Klotho mRNA表达上调,而细胞上清液Klotho蛋白也明显增加(P<0.01)。结论成功构建小鼠Klotho重组腺相关病毒载体(pAAV/mKL),获得了rAAV/mKL,并经转染7901细胞验证其基因表达功能正常,这就为进一步研究Klotho基因治疗衰老相关性疾病提供了技术基础。     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S,作为一种高效能HB DNA疫苗的备选对象.方法以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV-S2S基因片段,克隆至相应载体.再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段,并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAX1,然后扩增目的基因测序,确认无误后,转染SP2/0细胞,并分别检测目的基因mRNA,了解其短暂表达与稳定表达情况.结果所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符,目的片断IFNα-8-S2S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符.HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变.2处有义突变是703-705位CCG突变为CAG,799～801位ATA突变为ATG.表达质粒转染SP2/0细胞后,均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA.结论经分析表明,HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质.可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAX1/IFNα-8-S2S的构建,并成功检测到目的基因的表达,为制造高效能HB DNA疫苗提供了新的备选对象.     

干扰素α-8与乙型肝炎病毒-S2S融合基因真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建干扰素α-8(IFNα-8)与乙型肝炎(HB)病毒(HBV)-S2S融合蛋白的真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S，作为一种高效能HBDNA疫苗的备选对象。方法：以特定引物分别从正常胎肝组织及HB患者血清中扩增出IFNα-8与HBV—S2S基因片段，克隆至相应载体。再以连接引物扩增出IFNα-8与HBV-S2S融合基因片段，并将该基因片段克隆至真核细胞表达载体pVAXl，然后扩增目的基因测序，确认无误后，转染SP2／0细胞，并分别检测目的基因mRNA，了解其短暂表达与稳定表达情况。结果：所构建的质粒经过酶切电泳后证实分子量与预期相符，目的片断IFNα-8-S1S经测序证实IFNα-8序列与Genebank公布的序列相符。HBV-S2S存在3处三联密码子的无义突变。2处有义突变是703～705位CCG突变为CAG，799～801位ATA突变为ATG。表达质粒转染SP2／0细胞后，均检测到短暂表达及稳定表达之目的基因mRNA。结论；经分析表明，HBV-S2S片段存在的两处有义突变并不影响该蛋白的空间构象及关键抗原决定簇的性质。可以认为本研究完成了真核表达质粒pVAXl／IFNα-8-S2S的构建，并成功检测到目的基因的表达，为制造高效能HBDNA疫苗提供了新的备选对象。     

可溶性转化生长因子βⅡ型受体对LoVo细胞侵袭能力的影响

目的构建人转化生长因子βⅡ型受体细胞外区基因的真核表达载体,初步探讨可溶性转化生长因子βⅡ型受体(sTGFβRⅡ)对结直肠癌LoVo细胞侵袭能力的影响。方法采用DNA重组技术构建sTGFβRⅡ的表达载体pcDNA3.1( )/sTGFpRⅡ,用脂质体转染技术转染人结直肠癌LoVo细胞,以RT-PCR、Western印迹和细胞免疫荧光技术分别检测目的基因及蛋白表达;Matrigel~(TM)侵袭试剂盒检测sTGFβRⅡ对LoVo细胞侵袭能力和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成能力的影响,RT-PCR检测sTGFβRⅡ对LoVo细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。结果sTGFβRⅡ在LoVo细胞中获得表达,转染sTGFβRⅡ基因的LoVo细胞侵袭能力(穿膜细胞数为111.0±10.1)明显低于空载体转染组(171.3±3.2)和对照组(177.0±2.7,F=100.1,P相似文献   

抑癌基因FATS真核表达载体的构建及其定点突变

目的构建抑癌基因FATS的真核表达载体和针对其单核苷酸多态性(SNP)位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础。方法通过RT-PCR从小鼠睾丸cDNA中扩增FATS基因,并克隆到p3×Flag-myc-CMV-26载体上,构建FATS真核表达载体p3×Flag-FATS;利用定点突变技术构建Flag-FATS-C213G,经测序检测突变结果后将两质粒分别转染FATS基因沉默的U2OS细胞,Western blot检测FATS蛋白和标签蛋白表达。结果重组质粒p3×Flag-FATS经EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切出现质粒和目的片段两条带,且大小相符、无其他条带;编码FATS第213位氨基酸的第637-639位碱基由AAU突变为GAU,其他碱基均无突变;p3×Flag-FATS和Flag-FATS-C213G转染U2OS细胞可检测出标签蛋白Flag和目的蛋白FATS表达。结论 FATS基因及其定点突变载体均可成功构建,且转染后表达良好;此为深入研究FATS基因的抑癌功能及与肿瘤发生风险的关系奠定了基础。     

野生型及跨膜型肿瘤坏死因子真核表达载体构建及其对心肌细胞凋亡的影响

目的构建鼠野生型肿瘤坏死因子（Wild type tumornecrosis factor—alpha,wtTNF—α）和跨膜型肿瘤坏死因子（Transmembrane tumor necrosis factor—alpha,tmTNF—α）基因真核表达载体,转染心肌细胞,比较两型TNF—α对心肌细胞凋亡的影响。方法应用RT—PCR方法从小鼠腹腔臣噬细胞中扩增wtTNF—α基因编码区,根据小鼠TNF氨基酸序列设计缺失肿瘤坏死因子转化酶（TNF alpha converting enzyme,TACE）作用位点（缺失1-12位氨基酸）的突变引物,通过重叠PCR得到构建不被TACE剪切的TNF-α突变体,即跨膜型肿瘤坏死因子tmTNF—α,扩增得到的wtTNF-α,tmTNF—α PCR产物经EcoRI＋BanH I双酶切后克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中并转染入大鼠H9c2（2—1）心肌细胞,用RT—PCR及Western Blot方法鉴定转染效率及不同表达载体对心肌细胞凋亡的影响。结果成功构建pIRES2-eGFP—wtTNF和pIRES2-eGFP-tmTNF真核表达载体并转染大鼠H9c2（2—1）心肌细胞,tmTNF—α对心肌细胞无明显促凋亡作用,而wtTNF—α可以诱导心肌细胞凋亡。结论由于wtTNF—α可被酶解产生sTNF-α,提示sTNF—α,而并非跨膜型TNF-α对该心肌细胞株具有诱导凋亡的作用。     

可溶性转化生长因子β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体对人肝细胞凋亡的抑制作用

目的构建表达人转化生长因子-β1(TGF-β1)Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,并研究重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN是否拮抗外源性TGF-β1诱发的肝细胞凋亡,从而为该载体对于肝纤维化的临床应用提供理论依据.方法(1)以RT-PCR法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1 Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.(2)以人正常肝细胞HL-7702为靶细胞,将细胞分为空白对照组、TGF-β1组、载体组、TGF-β1 载体组.用TUNEL原位标记法和流式细胞仪对各组细胞凋亡率进行检测.结果(1)经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确无误,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.(2)TGF-β1组TUMEL阳性细胞明显多于其他各组,而TGF-β1 载体组和空白对照、载体组细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪分析结果显示,与其他各组细胞相比,TGF-β1组细胞碎片占细胞总数的百分比明显增加,而加入载体后细胞周期的比例、凋亡率和正常对照组相比没有明显变化.结论成功构建的重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN可有效的阻断外源性TGF-β1诱导肝细胞凋亡的作用,提示该载体可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

扩张型心肌病致病基因LMNA新突变E82K的发现及其功能的初步研究

目的检测中国人家族性扩张型心肌病核纤层蛋白A(Lamin A)基因(LMNA)突变情况并初步探索突变基因功能。方法(1)用基因测序的方法扫描1个中国人扩张型心肌病家系(50名成员)LMNA基因的12个外显子,对照为60例正常志愿者。(2)构建野生及突变LMNA基因的真核表达载体并分别转染HEK293细胞后,用0.8mmol/L过氧化氢刺激24h,观察各组细胞凋亡率的差异。结果(1)该家系先证者LMNA基因第1号外显子第244位碱基位置发生G→A转换,其编码氨基酸由谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)。(2)给予0.8mmol/L过氧化氢刺激24h后,转染突变LMNA基因表达载体的细胞组凋亡率(29.13±1.24)%显著高于其他细胞组(P<0.01)。结论携带LMNA基因E82K错义突变的患者临床表型呈现症状重、发病早、预后差的临床特点,且部分患者合并Ⅱ°～Ⅲ°房室传导阻滞,该突变所促进的细胞凋亡可能是导致扩张型心肌病的原因之一。     

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的构建及筛选

目的 构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体，建立基因敲除突变株，为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法。方法 用基因克隆方法将SAG31．53kb和2．81kb两个同源序列分别插入TUB5／CAT质粒中，构建置换型打靶载体，氯霉素乙酰转移酶(CAT)抗性基因作为筛选标记，采用电转移转染细胞方法进行基因打靶，建立突变型的弓形虫株，采用PCR、酶切分析和Southern Blot杂交方法筛选鉴定。结果 构建了弓形虫RH株5’SAG3-T15135／CAT-3’SAG3置换型载体，获得了敲除SAG3基因的弓形虫突变株，建立基因敲除突变株，获得了阳性的筛选克隆，经鉴定证明基因打靶结果准确。结论 通过构建基因打靶载体，可有目的地敲除弓形虫膜抗原基因，为进一步研究弓形虫侵入机制，探讨弓形虫病防治提供可行的方法。     

汉滩病毒感染与整合素β3表达的相关性

目的　探讨整合素 β3表达与汉滩病毒 (HTNV)感染的关系。 方法　将人整合素 β3、αv及αⅡb真核表达载体分别及共转染至CHO细胞 ,采用间接免疫荧光测定 (IFA)、流式细胞计数(FCM)检测外源基因的表达 ;然后用HTNVA9株感染稳定转染的CHO细胞 ,应用IFA和FCM检测病毒抗原。结果　整合素 β3在共转染组细胞中高效表达 ,且目的蛋白主要定位于细胞膜上 ;β3单转染组目的蛋白虽有一定量的细胞膜表达 ,但表达量低于共转染组 (P <0 0 5 ) ;αv和αⅡb单转染组目的蛋白的表达量明显低于共转染组 (P <0 0 1) ,且定位发生变化。病毒感染率共转染细胞较高 ,CHO/αvβ3和CHO/αⅡbβ3细胞分别为 6 0 1%和 5 5 9% ;未转染 β3的细胞感染率较低 ,CHO细胞仅为 1% ;而单转染 β3细胞介于两者之间 ( 38 7% )。结论　汉滩病毒感染率与整合素 β3表达水平密切相关 ,整合素 β3可以促进HTNV的入胞作用     

血管紧张素Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的　探讨血管平滑肌细胞 (VSMC)转染表达血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2 R)对其增殖和迁移的影响。方法　构建带AT2 R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV AT2 R) ,体外转染大鼠主动脉VSMC ,用RT PCR方法检测AT2 RmRNA表达 ,流式细胞仪检测AT2 R表达率 ,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和 5 溴尿苷(BrdU)掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden‘s趋化小室法检测 ,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F actin的表达。结果　构建的AdCMV AT2 R体外转染培养VSMC表达率为 89.5 1%。AT2 R峰值表达时 ,其S期和G2 M期细胞比率从 31.7%降低到 13.9% (P <0 0 5 ) ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 6 1.4%和 5 1.6 %(P <0 0 (1)。VSMC的跨膜迁移数降低 6 2 .2 % ,F actin表达明显减少。结论　AT2 R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移 ,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

肿瘤坏死因子α诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制的研究

类风湿关节炎(RA)是以滑膜组织异常增生为主要病理特征的系统性自身免疫病.其中,成纤维样滑膜细胞(FLS)的过度增殖与凋亡不足被认为是引起滑膜增生的关键因素.TNFα促进细胞凋亡、生存与增殖是通过其两类受体即TNFR Ⅰ和TNFRⅡ实现的.TNFR Ⅰ具有死亡结构域(DD),而TNFRⅡ却不含DD,提示两类受体通过与不同的信号蛋白相互作用介导不同的生物学活性[1].