人NaDC1基因近端启动子生物信息学分析及载体构建

目的对人NaDC1（hNaDC1）基因近端启动子进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式元件,并构建相应基因序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法使用First EF程序分析并获得hNaDC1基因近端启动子序列,使用MatInspector5.0软件对近端启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。PCR法扩增hNaDC1基因近端启动子序列,PCR产物经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆到pGL3-Basic载体。重组质粒行KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。结果使用FirstEF程序获得长度为2.4kb（-2232/＋136）的hNaDC1基因近端启动子序列。MatInspector5.0程序分析显示该基因序列共含有152个74种顺式作用元件。KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hNaDC1A质粒插入片段正确无误。结论成功构建hNaDC1基因近端启动子转录调控序列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为利用双荧光素酶报告基因检测系统研究hNaDC1基因近端启动子转录调控元件的分布及其性质提供了基本试验条件。     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

成纤维细胞生长因子19转录活性及上游结合元件分析

目的 构建FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,并研究分析其启动子区的转录活性和结合元件。方法 设计特异性引物PCR扩增基因组DNA,得到长为3323bp的FGF19基因启动子区片段,将此PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic Vector,获得全长为3323bp的FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒。在此基础上设计特异性引物,构建5''端系列缺失荧光素酶报告基因质粒。通过瞬时转染实验检测所构建质粒的相对荧光素酶活性,分析不同启动子区片段对FGF19基因转录活性的影响,并用软件预测影响启动子转录活性的关键转录因子。结果 构建了7个FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,经双酶切和测序验证均正确。瞬时转染及荧光素酶报告基因分析实验发现启动子区-2351~-2316是调控FGF19启动子转录活性的重要序列,且在线软件预测该序列存在潜在的转录因子位点。结论 FGF19基因启动子区-2351~-2316是调控其启动子转录活性的关键位置。     

含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建

目的：构建含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法：利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3／MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3／MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果：构建了含人乳癌DF3／MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论：重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

缺氧调控报告载体的构建与鉴定

目的:构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法:合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照,克隆入pCI-neo,构建HRE/CMV重组载体. 然后采用PCR方法将HRE/CMV启动子定向亚克隆入pGL3-Basic. 结果:酶切和测序鉴定分析,所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致,序列无碱基的突变. 结论:成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体,为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件.     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建

目的克隆人Tim-3基因5′端非编码区处具有启动子活性的片段，构建其真核报告质粒，为进一步研究Tim-3表达调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板，针对人Tim-3启动子5′端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段，设计特异性引物，PCR扩增该片段，命名为Tim-3P2，经双酶切后克隆入pGL3-Basic载体SacⅠ、XhoⅠ位点，构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒，与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系，通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果pGL3-Tim-3P2经PCR、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误；pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞（两种细胞均可表达内源性Tim-3）24h和48h，双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍；而pGL3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性。结论成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒，该载体具有特异性Tim-3启动子活性，为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础。     

PEPCK启动子调控的报告基因表达质粒的构建

目的构建磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控的报告基因表达质粒,为评价PEPCK启动子对下游基因的转录调节创造条件.方法从载体质粒pPEPCK-int中截取大小为550 bp的大鼠PEPCK启动子片段,借助过渡载体质粒PBS-PEPCK,将PEPCK启动子片段插入pGL2-Basic-Luc报告质粒.结果通过酶切鉴定及基因测序,证明pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒构建成功,并能够在体外表达荧光素酶.结论 pGL2-PEPCK-Luc质粒可作为体外研究PEPCK启动子转录调节的新手段.     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

人β1整合素近端和远端启动子报告基因载体的构建和鉴定及启动活性分析

目的：克隆整合素β1近端启动子和远端启动子基因序列，构建并鉴定整合素β1启动子调控的荧光素酶报告基因载体pGL3—261和pGL3—1442。方法：以本室构建的含整合素β1全长启动子基因序列（1756bp）的重组载体pGL3—β1为模板，用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1近端和远端启动子基因序列，克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic，构建含正确目的基因的表达载体pGL3—261和pGL3—1442，经Nhe I、Xho I酶切、聚合酶链式反应（PCR）扩增及测序鉴定；并用pGL3—261和pGL3—1442质粒与pGL3—β1质粒同时转染人表皮细胞株HaCaT进行活性分析。结果：酶切及序列测定表明，克隆获得的近端启动子261bp和远端启动子1442bp与GenBankDNA序列数据库对比分析序列一致，且插入方向正确；此三种质粒都有明显的启动子活性，远端启动子活性与全长启动子活性无显著差异，但明显高于近端启动子活性。结论：成功构建了整合素B1近端和远端启动子基因序列荧光素酶报告基因载体，整合素β1远端启动子在HaCaT细胞中起主要作用。为下一步研究人整合素β1启动子核心区、基因表达调控机制及其信号转导通路等奠定基础。     

ID4基因启动子克隆及表达调控载体的构建

目的深入研究ID4基因的表达调控机制。方法在NCBI人类基因组数据库中截取并下载ID4基因转录起始位点上游5′侧翼区约2242bp及下游5′非翻译区212bp的基因组序列,设计PCR扩增引物,采用分段扩增法,从健康人外周血中扩增获得2条长度分别为1829bp和784bp的产物片段,插入用于表达调控研究的pGL3Basic荧光素酶报告载体,实现连接,经测序鉴定。以此为基础进行亚克隆,分别获得5条5′端不等、3′端平齐的片段,插入pGL3Basic载体。结果获得了6条长度依次差别约为400bp的ID4启动子克隆,分别构建了调控荧光素酶报告基因的真核表达载体。结论成功克隆了人ID4基因启动子并构建了表达调控载体,为研究ID4启动子活性及表达调控奠定了基础。     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因.为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒.方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列.PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定.结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体.结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体.LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础.     

人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告 基因载体的构建及其转录活性分析

目的：克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性。方法：运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5′端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5′端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5′端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析。应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子（NF）-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性。结果：序列分析发现人MUC5AC基因5′端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体。双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。MUC5AC 5′上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用。     

人FAT1基因启动子的克隆鉴定及其功能浅析

目的：克隆人脂肪非典型钙黏蛋白1（FAT atypical cadherin 1,FAT1）基因启动子,找到核心启动子区域并对其转录调控机制进行初步分析。方法：通过PCR方法获得人FAT1基因5′上游1 163 bp（-1 029~+134 bp）的片段,亚克隆至pGL3?basic载体;通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒。双荧光素酶报告活性分析检测各重组质粒在A549细胞和HEK293T细胞中的活性,找到核心启动子区域。利用生物信息学方法预测核心区域的转录因子结合位点。结果：经测序、酶切鉴定,成功构建了人FAT1启动子荧光素酶活性报告基因重组质粒。与pGL3?basic质粒相比,人FAT1启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加（P < 0.05）。通过生物信息学软件预测人FAT1启动子区域（-233~-110 bp）可能含有TFAP2C、KLF5等转录因子结合位点。结论：成功构建人FAT1启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒。通过荧光素酶活性比较,推测人FAT1的核心启动子区域位于-233~+134 bp区域,其中可能含有若干转录因子结合位点。     

原癌基因USP22启动子的克隆及转录活性分析

 目的克隆原癌基因USP22部分启动子序列,探讨其转录活性。方法应用cDNA 5忆末端快速扩增（5'RACE）方法定位
USP22基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区处包括转录起始点在内的-2 828~+52片段进行PCR扩增,产物克隆
入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。重组质粒与内参质粒pRL-TK共转染HepG2 与Hela 细胞,双荧光素酶活性检测确定其转录
活性。结果成功确定USP22基因转录起始位点,酶切及测序结果证实USP22基因5'端非编码区2 880 bp 序列正确插入到荧
光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组质粒pGL3-USP22 promoter 转染HepG2 细胞和Hela 细胞后,检测到荧光素酶的高表达
（ P<0.05）。结论成功构建具有转录活性的USP22启动子片段,为进一步研究USP22表达调控机制奠定基础。