内皮抑素抑制人脐静脉内皮细胞分泌IL-6和IL-8的实验研究

目的 :研究内皮抑素对体外培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)分泌白细胞介素 6 (IL 6 )和白细胞介素 8(IL 8)的抑制作用。　方法 :在建立HUVEC体外培养模型的基础上 ,将细胞分为自然分泌组和内皮抑素组进行培养 ,收集 1～ 9天的培养上清液 ,离心。采用双抗体夹心ELISA法对上清液中IL 6和IL 8进行定量测定。　结果 :在自然分泌组HUVEC培养上清液中检测出IL 6和IL 8,证实了在自然状态下内皮细胞能产生一定量的IL 6和IL 8,而且随着内皮细胞培养天数的增加 ,IL 6和IL 8的分泌量也随之增加。当细胞进入对数增长期后 ,IL 6和IL 8的分泌量接近峰值 ,分别为 (2 979.32± 19 6 5 )pg/ml和 (6 0 18.87± 5 6 .74)pg/ml。内皮抑素组较自然分泌组HUVEC培养上清液中的IL 6和IL 8水平存在显著差异。　结论 :内皮抑素能够很好地抑制内皮细胞的生长和增殖 ,降低内皮细胞的生物活性。     

内皮抑素抑制人脐静脉内皮细胞分泌IL—6和IL—8的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effects exercised by endostatin on the production of interleukin-6 (IL-6) and IL-8 by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). METHODS:(HUVECs were isolated and cultured in vitro with endostatin (treated group) or PBS (control group), and the supernatant was harvested from the primary culture medium daily for 9 consecutive days starting from the first day of culture, followed by centrifugation. IL-6 and IL-8 contents in the supernatant were measured using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: IL-6 and IL-8 were detected in the supernatant of the control cell culture, and their amounts increased as the cell culture was prolonged, reaching the peak levels on day 6 (2 979.32+/-19.65 pg/ml and 6 018.87+/-56.74 pg/ml, respectively). In the treated group, however, the amounts of IL-6 and IL-8 were significantly lower than the control levels (P<0.01). CONCLUSION: Endostatin can inhibit the growth and proliferation of endothelial cells, reducing their biological activities.     

原代人脐静脉内皮细胞分泌IL-1的研究

为探讨内皮细胞作为抗原提呈细胞（APCs）的功能，培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC），观察了其在某些因素影响下，分泌白细胞介素1（IL-1）的情况。结果表明，细菌脂多糖（LPS）可诱导HUVEC释放IL－1，增加LPS的浓度或延长其诱导时间，可提高IL-1的释放活性。γ干扰素（IFNγ）可协同LPS促进HUVEC释放IL－1。协同诱导的动力学表明：IFNγ对LPS诱导HUVEC释放IL－18h之前无明显效应，24h后，协同促进效应明显提高。     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

肾小球内皮细胞IL-8mRNA表达的实验研究

探讨白细胞介素１（ＩＬ－１β）及肿瘤坏死因子（ＴＮＦα）对肾小球内皮细胞产生ＩＬ－８的影响。方法采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，分别加入重组ＩＬ－１β及ＴＮＦα，观察培养人肾小球内皮细胞ＩＬ－８ｍＲＮＡ表达的影响。结果在不加任何刺激条件下，肾小球内皮细胞ＩＬ－８ｍＲＮＡ有弱的表达，当分别加入ＩＬ－１β（２５ｎｇ／ｍｌ）和ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激２４小时后／ＩＬ－８ｍＲＮＡ的表达均明显增强。结论肾小球内皮损伤可以导致ＩＬ－８表达增强，从而引发肾小球局部的炎症效应。     

窒息新生儿血清IL-6和IL-8水平变化及其临床意义

目的 探讨外周血白细胞分素-8(IL-8)在窒息新生儿中的变化及临床意义.方法 采用ELISA法检测42例不同程度窒息新生儿不同病期血清的IL-6、IL-8水平,并与正常足月新生儿脐血42例进行对照.结果 窒息新生儿第1天血清IL--6为57.6 ng/L(中位数,以下同),IL-8为353.3 ng/L,明显高于正常脐血对照组的2.0、92 ng/L(Z=4.564～5.856,P＜0.01).重度窒息组患儿血清IL--6、IL-8分别是87、579.6 ng/L,分别高于轻度组(52.6、336.3 ng/L)(Z=2.228～2.702,P＜0.05).血清IL-6、IL-8水平间呈显著正相关(α=0.59～0.72,P＜0.01).窒息组患儿动态观察发现,病程第3天时血清IL-6(56.6 ng/L)、IL-8(320.6 ng/L)水平较第1天时(分别为57.6、353.3 ng/L)差异均无显著性(Z=0.314～1.372,P＜0.05);第7天时血清IL-6(14.6 ng/L)、IL-8(238.4 ng/L)水平均明显低于第1天和第3天时(Z=2.455,P＜0.05,Z=3.622,P＜0.01).结论 窒息新生儿血清中IL-6、IL-8水平明显增高,在新生儿窒息发病机制中起重要作用.     

联胺对人脐静脉内皮细胞中IL-8表达及NF-kB蛋白活化的影响

目的 探讨联胺对培养的人脐静脉内皮细胞表达IL-8及核因子-κB活化的影响.方法 酶联免疫吸附法检测IL-8蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应法检测IL-8mRNA的表达,细胞免疫化学法观察NF-κB的活化.结果 联胺(1、5和10μmol/L)可诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,与对照组差异有显著性意义(P＜0.05),且与联胺呈浓度依赖性.联胺(5μmol/L)作用人脐静脉内皮细胞30 min后发现NF-κB从胞质向胞核转移,60 min达高峰,持续到120 min.结论 联胺能诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,其机制可能是通过NF-κB活化实现的.     

IL-6和IL-8在乙型肝炎后肝硬化患者中的临床意义探讨

目的探讨乙型肝炎后肝硬化患者血清IL-6和IL-8的临床意义。方法67例乙型肝炎后肝硬化患者采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测血清IL-6和IL-8,根据Child-pugh分级分为A组(22例)、B组(25例)、C组(20例),并与正常对照组65例作比较。结果乙型肝炎后肝硬化患者血清IL-6和IL-8明显高于对照组(P<0.01),且A、B、C三组各项指标比较差异非常显著(P<0.01)。结论血清IL-6和IL-8水平是反映乙型肝炎后肝硬化肝功能损害程度及判断病情预后的重要指标。     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞周期变化的影响

目的 研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响.方法 RT-PCR获取人内皮抑素基因(hEndostain,hES),通过酶切、测序鉴定获取的hES,MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.结果 获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因;hES基因转染HUVEC细胞24h,48h和72h,细胞增殖率均较正常组明显降低(P＜0.05),而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化.结论 hES基因能够抑制HUVEC增殖.     

重组人内皮抑素腺病毒对人脐静脉内皮细胞系的影响

目的 探讨重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)感染人脐静脉内皮细胞(ECV-304)后,对细胞生长状态及生理功能的影响.方法 重组人内皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304细胞,western blot测定hEndostatin蛋白表达情况,流式细胞术检测Ad-hEndo引起ECV-304细胞凋亡情况,并绘制各组细胞生长曲线.结果 与对照组相比,病毒感染48 h后检测到明显的hEndostatin蛋白表达,Ad-hEndo在感染3 d后出现ECV-304细胞凋亡,且ECV-304细胞在Ad-hEndo感染后生长受到明显限制.结论 Ad-hEndo感染的ECV-304细胞能有效表达hEndostatin,hEndostatin能诱导ECV-304细胞发生细胞凋亡且明显抑制其生长增殖.     

超声微泡介导内皮抑素基因转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

目的：探讨超声微泡介导内皮抑素（endostatin,ES）基因对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs）转染的效率及可行性。方法 HUVECs种于24孔板内,培养24 h后加入5μg pIRES2-EGFP-ES质粒及超声造影剂SonoVue微泡,启动超声照射进行转染,设定MI分别为0.7、1.0、1.5,辐照时间分别为10 s、30 s、60 s、120 s,微泡浓度分别为10％、20％、50％。转染24 h后观察绿色荧光蛋白表达,计数活细胞数,MTT检测细胞增殖抑制率。结果超声爆破微泡介导了内皮抑素基因转染HUVECs,并具有强度、时间及微泡浓度依赖关系,但随着强度、微泡浓度增加及辐照时间延长,细胞凋亡率增加、细胞活力下降,转染率随之下降,当超声强度MI1.5、辐照时间60 s、微泡浓度20％转染率相对最高。结论超声微泡可介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞,但转染受多因素影响,在相对最佳转染条件下可实现内皮抑素的高表达。     

孕激素对高迁移率族蛋白B1 诱导人脐静脉内皮细胞释放白细胞介素-6 作用的影响

目的 观察孕激素对高迁移率组蛋白B1(HMGB1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUNVEC)释放细胞因子白细胞介素-6(IL-6)的影响.方法 分离培养人原代HUVEC,克隆构建HMGB1原核重组表达载体pET14b-HMGB1;用不同浓度的原核表达纯化的HMGB1(0、10、100、500、1000 ng/ml)蛋白和不同浓度的孕酮(0、0.1、1、10、100mmol/L)刺激HUVEC,24 h后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中IL-6的表达水平;用500 ng/ml的HMGB1分别与不同浓度的孕酮联合作用刺激培养的HUVEC,ELISA法检测细胞上清中IL-6的表达水平;分析孕酮对HMGB1诱导IL-6影响的剂量效应.结果 不同浓度的HMGB1刺激HUVEC后发现,低浓度HMGB1可轻度下调IL-6的分泌表达,但无明显统计学差异(P>0.05),一定浓度以上则可使IL-6水平明显升高(P<0.01);不同浓度孕激素对HUVEC产生IL-6没有明显影响,但以剂量依赖方式抑制HMGB1对IL-6的分泌(P<0.01).结论 HMGB1可诱导HUVEC释放炎性细胞因子IL-6,而孕激素以剂量依赖的方式抑制这些炎症因子的释放,这为孕激素在内毒素血症的发生发展中发挥保护作用提供了分子水平的理论基础.     

Expression of interleukin-15 and its receptor on the surface of stimulated human umbilical vein endothelial cells

Summary： Human interleukin-15 （hIL-15） is an important cytokine to activate endothelial cells and can be regulated by many other cytokines. The aim of this study is to examine the ability of interferon-γ （IFN-γ）, and tumor necrosis factor-or （TNF-α to induce the production of human interleukin-15 （hIL-15） and IL-15 receptor （IL-15Rα by human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. The data are summarized as follows： 1. Northern blot revealed that IL-15 mRNA was up-regulated by IFN-γ and TNF-α 2. Intracellular IL-15 protein was visualized by fluorescence microscopy, whereas the expression of IL-15 on the surface of HUVECs was detected by fluorescence activated cell sorting （FACS）, and no detectable IL-15 in the medium was verified by ELISA. 3. IL-15Rα was detected on the surface of HUVECs by FACS after IFN-α and TNF-α stimulation, whereas Western blotting revealed that the elevated expression on surface IL-15Rα was not due to the increased protein expression. The conclusion demonstrated from our results is that IFN-α and TNF-α play an important role in regulating the expression of IL-15 and IL-15Rα on the surface of HUVECs.     

重组人血管内皮抑素体外对肝癌HCCLM6细胞转移侵袭的影响

目的 研究重组人血管内皮抑素在体外对人肝癌HCCLM6细胞粘附、迁移及侵袭的抑制作用.方法 分别以25、50、100、200、400μg/ml的重组人血管内皮抑素在体外处理HCCLM6细胞,采用MTT法检测药物对细胞增殖的影响,利用transwell小室及matrigel胶体外检测药物对细胞迁移、侵袭及粘附的影响.结果 重组人血管内皮抑素作用HCCLM6细胞72 h后对细胞增殖存在一定的抑制作用;重组人血管内皮抑素可明显抑制HCCLM6细胞与matrgel的黏附、对人工基底膜的侵袭力和迁移力,且抑制作用均呈剂量依赖性.结论 重组人血管内皮抑素具有直接抑制人肝癌细胞体外侵袭转移和增殖作用,其机制有待进一步探讨.     

IL-6下调血管内皮细胞组织因子抑制物表达

目的:观察IL-6对脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达组织因子途径抑制物(TFPI)的影响.方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行试验.同时应用CCK-8测定不同浓度的IL-6(0.125～2.0 ng/ml,实验组)刺激后细胞活性变化,对照组给予培养液;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TFPI mRNA水平.结果:与对照组相比,IL-6(0.125～0.5 ng/ml)对细胞活性没有显著影响(P>0.05);IL-6增加到1 ng/ml后,作用12 h后细胞活力开始下降.IL-6(0.5 ng/ml)作用6～24 h显著下调细胞TFPI mRNA表达(P<0.05),6 h时抑制效果最强(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值仅为0.191),以后抑制效应渐减弱,48 h达到正常水平(TFPI mRNA/GAPDH mRNA均值为0.399).结论:提示IL-6(0.5 ng/ml)对HUVECs的活性不造成直接的影响,同时IL-6(0.5 ng/ml)在6～24 h内可抑制HUVECs的TFPI mRNA表达而诱发凝血系统失衡,这可能与急性炎性反应时相的血液凝固和血栓形成有关.     

白细胞介素6通过抑制自噬促进人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨IL-6对血管内皮细胞自噬和凋亡的影响以及自噬与凋亡的相互作用关系。方法：采用不同浓度IL-6诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖与活性,流式细胞术检测细胞凋亡变化,单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色观察细胞嗜酸性自噬泡情况,透射电镜观察细胞超微结构的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白激活型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase3)以及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1, SQSTM1)/P62表达水平。进一步采用IL-6分别联合自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RP)诱导自噬或3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)抑制自噬,观察自噬对IL-6诱导血管内皮细胞凋亡的影响。结果：1. 与对照组相比,IL-6可以呈浓度依赖性降低血管内皮细胞的活性(P＜0.05),增加血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);2. IL-6浓度依赖性降低血管内皮细胞内LC3-II/LC3-I的表达(P＜0.05)而增加P62的表达(P＜0.05),在IL-6刺激下,MDC 染色观察可见血管内皮细胞内自噬泡逐渐减少(P＜0.05),荧光强度明显减弱,透射电镜下表现为自噬小体明显减少;3. 采用自噬抑制剂3-MA刺激血管内皮细胞,发现3-MA可以进一步抑制IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而增加凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达进一步下降(P＜0.05)和P62的表达进一步增加(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量明显减少(P＜0.05),并且3-MA可以进一步增加IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05);4. 进一步采用自噬促进剂RP刺激血管内皮细胞,发现RP可以改善IL-6刺激下的血管内皮细胞的自噬水平而降低凋亡水平,表现为LC3-II/LC3-I的表达升高(P＜0.05)和P62的表达下降(P＜0.05),血管内皮细胞内的自噬泡和自噬小体数量的增多(P＜0.05),并且RP可以明显减少IL-6刺激下血管内皮细胞的凋亡(P＜0.05)和Cleaved-caspase3的表达(P＜0.05)。结论：白介素-6可通过抑制自噬而增加血管内皮细胞凋亡。     

雷帕霉素抑制人脐静脉内皮细胞增殖与迁移

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin)对脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移的抑制作用。方法应用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞仪、迁移实验研究不同浓度雷帕霉素对血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖、迁移的影响。结果雷帕霉素浓度大于10ng/ml、作用48h以上可以明显抑制VEGF诱导的HUVECs的增殖(P<0.05),呈时间、剂量依赖性;流式细胞仪检测细胞被阻滞在G0/G1期,并诱发了细胞凋亡;利用Transwell装置证实雷帕霉素浓度大于10ng/ml时抑制了HUVECs的迁移。结论雷帕霉素可通过抑制血管内皮细胞的增殖与迁移抑制血管生成。