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人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶C端片段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:为了表达人ACTC端片段并制血表达载体其抗体。方法:将编码人ACAT羧基端包含跨膜(463-550氨基酸残基)的cDNA片断克隆至不同的大肠杆菌表达载体中,构建了毓表达质粒,并在多种大肠杆菌中进行了表达研究。结果:在详细探索到达条件的基础上,经温敏诱导,成功地在大肠杆菌AR68中表达了N端融合ProteinA BC domain的人ACAT羧基末端包含第二个跨膜区的片段,表达量约20mg/L 相似文献
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CTLA-4/Ig融合蛋白在COS-7中的表达、纯化及鉴定 总被引:5,自引:2,他引:3
探讨PCTLA-4/Ig融合蛋白表达载体在哺乳动物细胞中的表达及表达产物的鉴定,纯化为其功能研究和临床应用奠定基础。方法将pCTLA-4/Ig表达质粒转染COS-7细胞,双抗体夹心ELISA检测细胞培养上清中融合蛋白表达:ProteinA亲和层析纯化,SDS-PAGE、Western印迹、^3H-TdR掺入等进行分子量,纯度、抗原特异性及生物知性鉴定。结果在PCTLA-4/Ig质粒转染后的48h的 相似文献
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目的:克隆人淋巴毒素cDNA并测序。方法:采用RT-PCR技术,从PHA/PMA活化的人T细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增人淋巴毒素cDNA,并定向克隆于pUC18、pUC19质粒载体,Sanger双脱氧链终止法测序。结果:RT-PCR扩增出一个541bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该541bp片段为编码人淋巴毒素成熟肽的cDNA,与公布的人淋巴毒素cDNA序列完全一致。结论:本实验成功地克隆了人淋巴毒素cDNA,为在大肠杆菌表达人淋巴毒素并进一步研究其功能,以及淋巴毒素的开发与临床应用奠定了基础。 相似文献
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人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞核细胞趋化蛋白1(huMCP-1)。方法:从人外周血单核细胞(PBMC)中提取poly(A)^+RNA,用RT-PCR法扩增出huMCP-1cDNA。将huMCP-1cDNA插入融合表达载体pGEXIN,1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得高效表达。结果:Western blot证明与huMCP-1单克隆抗体有明显交叉反应。结论 相似文献
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目的:克隆人淋巴毒素cDNA并测序。方法:采用RT-PCR技术,从PHA/PMA活化的T细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增入淋巴毒素cDNA并定向克隆于pUC18,pUC19质粒载体Sanger双脱氧链终止法测序,结果:RT-PCR扩增出一个541bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示。该541bp片段为编码人淋巴毒素成熟肽的cDNA,与公布的人淋巴毒素cDNA序列完全一致,结论; 相似文献
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目的:构建 G M C S F/ Fcγ2 融合蛋白载体。方法:利用 P C R技术,将人 G M C S F基因与人免疫球蛋白 Ig G2 的 Fc 段基因联接,构建融合基因h G M C S F H V2;并将此片段定向克隆到真核表达质粒p Rc/ C M V2 载体。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示 P C R扩增出了 1.3 kb 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 G M C S F/ Fcγ2 融合蛋白载体的构建。结论:(1)经 P C R 扩增技术由质粒 P C Dh G M C S F和 P S V V N P H V2 分别扩增到了所需的h G M C S F c D N A 片段和 Ig G2 从绞链区到 C H3 的基因组 D N A 片段。(2)利用 P C R介导,扩增出了融合基因片段h G M C S F H V2。(3)构建了真核细胞表达载体p Rc/ C M V2/h G M C S F H V2 。 相似文献
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饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段。并克隆到pUC19载体中,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX-4T-1表达载体中,经BamHI和EcoRI双酶切后1.2%凝胶电泳鉴定,IPTG诱导表达产物经SDS-PAGE分析。结果 克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF138300记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65.6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST-Decorin融合蛋白。 相似文献
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克隆人肝脏再生增强因子(hALR)cDRNA,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法:提取胎儿肝组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增出hALRcDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切鉴定后亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,测序证实序列正确并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白GST-hALR,表达物通过谷胱甘肽Sepharose4B亲和层析纯化后进行Thrombin酶切, 相似文献
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人源乙型肝炎病毒表面抗原抗体Fab片段与IFN-α融合蛋白表达载体的筛选 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨如何在无药物抗性改变;无转化细胞生物指示系统改变的情况下准确快速地筛选出人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白原核表达载体。方法在 IFN-α基因两端加上 XbaⅠ酶切位点后用 PCR法扩增,再重组入以抗体库技术筛选得到的人源抗HBsAg-Fab片段表达载体的相应位点上,构建 anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。取 PCR扩增得到的 IFN-α DNA,用地高辛标记系统进行化学标记,制备 IFN-α DNA探针。取构建的融合蛋白表达载体转化受体菌.增菌后,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体 DNA,点样于硝酸纤维膜上, 80℃烤2h,预杂交液 42℃,2h膜预杂交,标记探针 42℃, 4h杂交,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色。同时设单纯人源抗 HBsAg-Fab片段表达载体为阴性对照, IFN-α质粒为阳性对照。阳性克隆再以 SacI和 XbaⅠ酶切,琼脂糖电泳鉴定。结果40株转化细胞中筛选出7个阳性克隆,酶切鉴定显示两者符合率达100%,成功地筛选出了anti-HBsAg-Fab/IFN-α融合蛋白表达载体。结论人源HBsAg抗体Fab片段/IFN-α融合蛋白表达载 相似文献
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人心肌肌钙蛋白Ⅰ在大肠杆菌中的高效表达及纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后担任新的诊断方法。方法:利用RT-P0CR方法从人心肌细胞的cDNA库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA,并克隆支大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnⅠ融合蛋白,纯化后用Western-blot进行鉴定。结果:从人心肌cDNA库中扩增出编码人cTnⅠ的cDNA,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达30%以上。经离 相似文献
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目的:构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体,转化大肠杆菌DH5α,诱导表达BPI23-Fcγ1抗菌重组蛋白。方法:采用RT-PCR技术,从HL-60细胞和正常人白细胞mRNA中扩增编码BPI23和IgG1Fc(Fcγ1)的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态大肠杆菌DH5α,通过温控诱导表达BPI23-Fcγ1重组蛋白;测定BPI23-Fcγ1重组蛋白的抗菌及免疫学活性。结果:⑴RT-PCR获得预期的扩增产物-BPI600bp和Fcγ1700bp基因片段;⑵成功构建pUC18-BPI180、pUC18-BPI420和pUC18-Fcγ1700重组克隆载体,DNA测序结果与文献报道一致;⑶成功构建pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体,酶切图谱分析与预期结果相符; 相似文献
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K562细胞定向表达cDNA文库的快速构建 总被引:1,自引:0,他引:1
采用一步法快速从培养的K562细胞中抽提、纯化mRNA,逆转录成cDNA分子后,通过在cDNA分子两端加EcoRI适配子、T4多核苷酸激酶作用下磷酸化、NotI内切酶消化、过SepharoseCL-4B柱等步骤,与λExCell/NotI/EcoRI/CIP载体连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E·ColiNM522以构建cDNA文库。经检测:该文库含有1.0×106个重组子,cDNA分子长度在0.4~8.5k6范围,扩增后的滴度达1.2×1010pfu/ml,完全达到筛选低表达基因的要求,为从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因奠定了基础。并对构建cD-NA文库的关至和应用进行了讨论 相似文献
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目的从小鼠肝脏中克隆出endostatin并在COS-7细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用RT-PCR从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素cDNA并克隆入测序载体PUC-T测序证实后,装入分泌表达载体pSEC-hygromycin,用DEAE-葡聚糖转染COS-7细胞,从mRNA水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠endostatin cDNA 相似文献
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CTLA4Ig在基因治疗中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
CTLA4Ig由CTLA4的胞外链与IgG1Fc段融合而成 ,具有与CTLA4胞外段可溶性蛋白完全相同的生物学功能。新近的研究发现 ,CTLA4Ig除直接作为治疗基因进行基因治疗外 ,还能显著提高基因治疗中转基因表达等 ,本文就此做一文献综述。1 概 述活化的T细胞在许多疾病及病理过程中起着十分重要的作用。研究表明 ,T细胞必须在第一信号 (TCR/MHC Ag)及辅助刺激信号共同作用下才能完全活化[1、2、3 ] 。前者是T淋巴细胞活化的基础 ,并决定了T细胞反应的特异性 ;后者是T细胞活化中的必要条件 ,两者缺一不可。缺乏… 相似文献