Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析

目的构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）的同源性为８８．３７％，Ⅱ型中国株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｃ２）的同源性为７０．６９％，其推定的氨基酸同源性分别为８９．２９％和７５．５５％。结论基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间Ｅ２／ＮＳ１基因一级结构的研究将有助于ＨＣＶ疫苗的研制。     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

丙型肝炎病毒NS_5区基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ一ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区ＨＣＶ感染者血清中获得ＨＣＶＮＳ＿５区的基因克隆。经核苷酸序列的比较分析，此克隆片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。应用ＰＭＡＬ－ＣＲＩ质粒在大肠杆菌中高效表达了此基因片段，并获融合蛋白ＭＢＰ－ＨＣＶ·ＮＳ＿５，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实该融合蛋白有较特异的ＨＣＶ抗原性，可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机制的研究。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

质粒单独转染与共转染哺乳动物培养细胞的对比研究

我们对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞通过鳞酸钙围染技术，用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因ｎｅｏ’基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ进行了共转染，用含ＨＣＶＣ，Ｅ１，Ｅ２以及ｎｅｏ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了单独转染，经Ｇ４１８筛选，分别获得了Ｇ４１８抗性细胞；Ｐ８１５－Ｓ和Ｐ８１５－ＣＥ２细胞，提示单独转染与共转染的获成功，进一步证实的质粒单独转染与共转染哺乳支     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ, Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）, 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中,构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段,连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中, 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。     

Th1／Th2细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用

目的 了解慢性ＨＢＶ感染者外周血单核细胞（ＰＭＢＣ）中ＣＤ４＾＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ的表达情况,以测定Ｔｈ０／ＴＨ１／Ｔｈ２细胞的百分数,探明Ｔｈ、、Ｔｈ２细胞在慢性ＨＢＶ感染中的作用。方法 常规分离ＰＢＭＣ,在ＰＭＡ,ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、莫能菌素的刺激下,采用工细胞检测（ＦＡＣＳ）对慢性ＨＢＶ感染者ＰＢＭＣ中ＣＤ４＾＋Ｔ细胞内ＩＬ－４和ＩＦＮ－γ表达进行分析。结果 正常对照组,２．３％～     

DDPH对缺氧内皮细胞条件培养液致肺动脉平滑肌细胞PDGF mRNA表达的影响

利用地高辛标记的ｃＤＮＡ探针，原位检测ＤＤＰＨ［１－（２，６－二甲基苯氧基）－２－（３，４－二甲氧基苯乙胺基）丙烷酸盐］对缺氧内皮细胞条件培养液致猪ＰＡＳＭＣＰＤＧＦ基因表达的影响。实验分６组：常氧、低氧无血清培养液组（Ｎ、Ｈ组），常氧、低氧内皮细胞条件培养液组（ＮＥＣＣＭ、ＨＥＣＣＭ组），ＮＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ、ＨＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ组。用自动图像分析仪检测各组细胞ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链杂交产物的平均光密度（ＯＤ）值。结果：ＨＥＣＣＭ组ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链ｍＲＮＡ表达量分别是ＮＥＣＣＭ组的１．４０、１．４９倍（Ｐ＜０．０１），分别是Ｎ组的１．８倍、１．７倍（Ｐ＜０．０１），ＨＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ组ＰＤＧＦ－Ａ、－Ｂ链ｍＲＮＡ表达量分别为ＨＥＣＣＭ的０．７３倍、０．６５倍（Ｐ＜０．０１），与ＮＥＣＣＭ组相比，均无显著差异。提示ＤＤＰＨ在ＰＤＧＦ基因转录水平抑制ＨＥＣＣＭ诱导的ＰＡＳＭＣ的增殖。     

酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性

目的 建立一种检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３－４Ａ丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法,用于筛选ＨＣＶ蛋白酶抑制剂。方法 将闰ｐＭＡＬ－ｃ２／ＮＳ３－４Ａ转化到大肠杆菌Ｋ１２ＴＢ１中,经ＩＰＴＧ诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的ＮＳ３／ＮＳ３－４Ａ融合蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析并用考马     

水蛭素变异体I基因的合成及其在酵母中表达的初步研究

目的将水蛭素基因转入酵母系统中进行表达,以评价人工合成基因在真核系统中表达的可行性和探讨影响表达水平的因素。方法根据水蛭素变异体Ｉ（ＨＶ１）的氨基酸序列,选择酿酒酵母偏爱的密码子,设计了ＨＶ１基因。将ＨＶ１基因分１２个寡核苷酸片段,进行人工合成,并连接成一个完整的水蛭素基因。经ＰＣＲ扩增后,将扩增产物连到克隆载体ｐＢＳ－ＳＫ（＋）上并进行ＤＮＡ序列分析。用正确的ＨＶ１基因与酵母α因子信号肽基因相连,并一起插入酵母表达载体ｐＹＣ－ＤＥ,经鉴定表明,获得正确的重组表达质粒。将后者转入酿酒酵母ＢＪ１９９０细胞进行初步表达。结果在筛选出的阳性克隆的培养上清中,检测出的水蛭素活性为３０抗凝血酶单位（ＡＴＵ）／ｍｌ。所表达的量高于ＨＶ２在酵母中和ＨＶ１在原核系统的表达水平。Ｎ末端氨基酸序列与天然水蛭素一致。结论采用人工合成的ＨＶ１基因和较强的启动子在酵母中进行表达是一较好途径。     

丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物 …

建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗ＨＣＶ阳性血清的反应情况。方法：用限制性内切酶ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ从原核表达载体ｐＭＳ－ＣＶＥ１中切下ＨＣＶＥ１区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体ＰｃＤＮＡ３．１中,阳性克隆经ＳｍａⅠ和ＸｂａⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,同时利用ＷｅｓｔｅｒｎＢＬｏｔ方法对表达产物进行鉴     

鼻咽癌体外传代细胞株SUNE中EBV-LMP_1全基因的扩增

用长片段高保真度ＰＣＲ扩增系统（ｅｘｐａｎｄＴＭｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ）从鼻咽癌（ＮＰＣ）体外传代细胞株ＳＵＮＥ中扩增出ＥＢ病毒（ＥＢＶ）潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）全基因,经凝胶电泳分析和ＤＮＡ斑点杂交进行鉴定。扩增片段长度为３．４３ｋｂ,相当于Ｂ９５－８细胞ＥＢＶ基因序列位置为１７００３３～１６６６０８ｎｔ,包括ＬＭＰ１基因的上游启动子／增强子序列、ＬＭＰ１编码序列的３个外显子、两个内含子及下游ｐｏｌｙＡ信号序列。ＬＭＰ１全基因的扩增对于深入研究ＬＭＰ１基因的结构与功能以及ＬＭＰ１在ＮＰＣ发生发展中的作用机制具有十分重要的价值。     

原发性肝癌中 HBV X、S、Pre-S、C 基因片段整合与 ras、myc 癌基因表达的关系

用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针检测了６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中ＨＢＶ的存在状态，从中筛选出３２例仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ作为研究对象，进一步检测了ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片段的整合情况，并探讨了ＨＢＶ４种基因亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示，ＨＢＶＸ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的整合率分别为８７．５％（２８／３２）、６２．５％（２０／３２）、６２．５％（２０／３２）和２５．０％（８／３２）。ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ在ＨＣＣ中的表达率分别为５０．０％（２０／４０）、８１．２％（２６／３２）。通过对ＨＣＣ中４种ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２１ｒａｓ、ｐ６２ｍｙｃ表达之间关系的研究，显示ｐ６２ｍｙｃ的表达与ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ｒａｓ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示ＨＢＶＸ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和（或）ｒａｓ癌基因的表达。     

THE EFFECTS OF BREVISCAPIN ON AT－Ⅲ ACTIVITY， tPA AND PAI IN DOGS DURING ACUTE MYOCARDIAL ISCHEMIA

ＴＨＥＥＦＦＥＣＴＳＯＦＢＲＥＶＩＳＣＡＰＩＮＯＮＡＴ－ⅢＡＣＴＩＶＩＴＹ，ｔＰＡＡＮＤＰＡＩＩＮＤＯＧＳＤＵＲＩＮＧＡＣＵＴＥＭＹＯＣＡＲＤＩＡＬＩＳＣＨＥＭＩＡＳｈｅｎｇＪｉｎｇ（盛净），ＸｕＪｉｍｉｎ（徐济民），ＹａｎｇＪｕｘｉａｎ（杨菊贤），...     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

C3 PHENOTYPE AND ALLELES，C3 HAV4－1 MONOCLONAL PHENOTYPE DISTRIBUTION IN HYPERTENSIVE PATIENTS WITH IgA GLOMERULONEPHRITIS

Ｃ３ＰＨＥＮＯＴＹＰＥＡＮＤＡＬＬＥＬＥＳ，Ｃ３ＨＡＶ４－１ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＰＨＥＮＯＴＹＰＥＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮＩＮＨＹＰＥＲＴＥＮＳＩＶＥＰＡＴＩＥＮＴＳＷＩＴＨＩｇＡＧＬＯＭＥＲＵＬＯＮＥＰＨＲＩＴＩＳＧｕｏＪｉｚｈｅｎ（郭冀珍）（Ｓ...     

乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的 建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统,供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法 分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞,并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶ ＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液,用ＥＬ