Construtcion of Neisseria Gonorrhoeae Porin B Plasmid Recombinant and Its Expression in E. coli

A prokaryotic expression recombinant plasmid pET-PIB to express porin B (PIB) of Neisseria gonorrhoeae in E. coli DE3 was constructed in order to provide a basis of research in detection, prophylactic and therapeutic vaccine against the pathogen infection. The gene encoding PIB was amplified by PCR from Neisseria gonorrhoeae and cloned into prokaryotic expression plasmid pET-28a( ) to construct a pET-PIB recombinant, which was verified by restriction endonuclease and DNA sequencing. Protein PIB was expressed in E. coli DE3 induced with IPTG. The antigenicity of the expressed protein was evaluated by indirect ELISA. Rabbits were immunized with the protein and serum was collected after immunization. To assess the immunogenicity of the protein, the titer of serum to protein PIB was determined by ELISA. DNA sequence analysis showed that the nucleic acid sequence of PIB gene was 99.28 % of homology compared with that (NGPIB18) published in GenBank. A 41 kD fused protein was detected by SDS-PAGE and was proven to have reactivity with anti-PIB polyclonal antibody from mouse. A polyclonal antibody to PIB of 1：4000 titer determined by indirect ELISA was obtained from rabbit immunized with the purified product. Recombinant plasmid encoding PIB of Neisseria gonorrhoeae was constructed. Protein PIB with antigenicity and immunogenicity was successfully expressed.     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of Fusion Protein Including Porin A and Porin B of Neisseria Gonorrhoeae and Its Expression in E.coli

Neisseriagonorrhoeaeisacommonpathogenicmicroorganismwhichcausessextransmitteddisease .Therewereanestimated 6 0millionnew gonococcalinfectionsworld widein 1999.Theporins ,thepre dominantproteinsonthesurfaceofpathogenicNeis seria ,formafamilyofstructurallyr…     

凋亡素原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 构建凋亡素基因的原核表达载体,进行表达并制备表达蛋白的多克隆抗体.方法 构建凋亡素 pGEM-T/Apoptin载体,并将凋亡素基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.用表达蛋白常规免疫Balb/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度.结果 凋亡素基因被成功的克隆至pET-28a(+),表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,Balb/c小鼠经5次免疫后,得到了滴度为1:5×10~5血清抗体.结论 凋亡素原核表达载体的成功构建和多克隆抗体的制备为进一步研究凋亡素的功能和凋亡素的应用研究奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a prokaryotic expression vector for apoptin and prepare polyclonal antibody of apoptin.Methods Apoptin gene amplified from pGEM-T/Apoptin plasmid by PCR was cloned into pET-28a(+).E.coli BL21(DE3) was transformed by the recombinant plasmid,and apoptin protein expression induced by IPTG was analyzed by SDS-PAGE.BALB/c mice were immunized with the protein and the titer of the antibody was determined using indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Apoptin gene was successfully cloned into pET-28a(+),and the expression of a protein with relative molecular mass of about 17 000 was identified by SDA-PAGE.After 5 immunizations of the mice with the protein,the blood antibody titer reached 1:5×10~5.Conclusion The prokaryotic expression vector for apDptin is successfully conslructed and the polyclonal antibody of apoptin is Obtailled.which allows further functional study of apoptin.     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid of mtrC Protein of Neisseria gonorrhoeae and Its Expression in E.Coli

Gonorrheais one of the most common venerealdiseases.The wild use of antibiotic againstNeisse-ria gonorrhoeaehas made the drug resistance a bigproblemin the prevention and treat ment of gonor-rhea.Besides the drug resistance mediated bychange in structure of penicillin-binding protein,mutation of DNAgyrase A,chromosome plasmid,another non-specificity multi-drug resistant mecha-nismofNeisseria gonorrhoeae,multiple transfera-ble resistance efflux system,has been paid closeattention to increasin…     

沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定

目的克隆沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法采用PCR技术从ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p—Ct143原核表达质粒,转化E．coli XL1-Blue．IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb／c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性。结果成功构建了pGEX-6p—CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的CtD型一致,长度为843bp;GST—CT143融合蛋白在E．coli中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1：12800,Westem blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性。结论成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性。     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX-KG中,构建PfRPA2/pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,谷胱甘肽柱纯化蛋白,Westernblot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗PfRPA2的多抗,间接ELISA法检测鼠血清效价,Westernblot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组PfRPA2/pGEX-KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,纯化表达产物,制备抗PfRPA2的鼠多抗,效价为10-7,Westernblot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PfRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位。方法:根据GenBank中猪LIFcDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;最后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位。结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1∶10000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达。     

类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统BPSS1395蛋白表达及其抗体制备与鉴定

目的 重组表达类鼻疽杆菌Ⅲ型分泌系统蛋白BPSS1395,利用其抗体检测该蛋白在细菌中的分布.方法 以pET-22b为表达系统,采用DNA重组技术在大肠杆菌中表达BPSS1395蛋白;用纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot及ELISA法鉴定其免疫学性质;以制备的抗血清Western blot分析该蛋白的亚细胞定位.结果 从类鼻疽杆菌BPC006株基因组DNA中PCR得到了BPSS1395目的基因,并成功构建pET-22b-BPSS1395重组质粒,转化到E.coli宿主菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达、纯化得到了相对分子质量为32×103的高纯度BPSS1395蛋白,制备的兔抗血清ELISA效价均高达1:1280000,并能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应.亚细胞分离后BPSS1395在类鼻疽杆菌中主要定位于细胞质.结论 重组表达了具有生物活性的BPSS1395蛋白,制备了其特异性多克隆抗体,证明了该蛋白定位于细胞质.     

人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别

 【目的】构建人类Foxm1b基因的原核表达载体，表达并纯化蛋白，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b基因的表达，为进一步研究Foxm1b基因的功能奠定基础。【方法】从GenBank中下载人类Foxm1b基因全长cDNA序列并用Pegene软件分析其可能的抗原表位，设计引物．应用RT—PCR获得含抗原表位的Foxm1b基因片段，重组人原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL-21（DE31中诱导表达，应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体，用ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然Foxm1b蛋白的识别。【结果】成功构建了Foxm1b基因重组表达载体pET-28a—Foxm1b，表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体．该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。【结论】人类Foxm1b基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。     

奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶多克隆抗体的制备和鉴定

目的 表达、纯化奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶(PPK)蛋白,制备PPK多克隆抗体.方法 利用分子生物学软件分析奇异变形杆菌PPK的抗原性、疏水性等参数,选取N端较保守的309个氨基酸,并对其基因序列进行密码子优化以利于原核表达.合成新的基因序列后插入pET28b(+)质粒,转化入转化宿主菌BL21(DE3),诱导、表达融合蛋白.通过镍琼脂糖亲和层析技术,将获得的融合蛋白进行纯化.以纯化的蛋白作为免疫原并结合使用佐剂,背部多点注射新西兰大白兔,ELISA检测兔血清效价,Western Blotting验证抗体特异性.结果 成功构建了奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,可在0.5 mmol/L IPTG、37℃条件下获得较好的诱导、表达;利用镍柱纯化后的PPK蛋白与免疫佐剂一起,采用背部多点接种新西兰大白兔,制备了效价高的兔抗血清.ELISA检测血清效价达到1∶512 000,Western Blotting对ppk基因缺失株及其野生株进行验证显示抗体特异性良好.结论 利用pET28b(+)载体可构建奇异变形杆菌PPK的原核表达重组质粒,表达、纯化后的蛋白与佐剂共同免疫新西兰大白兔,可获得效价高、特异性良好的兔多克隆抗体血清,为奇异变形杆菌聚磷酸盐激酶的检测以及深入研究PPK在奇异变形杆菌致病中的作用奠定了基础.     

土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒的构建、原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

目的构建土拨鼠肝炎病毒核心蛋白质粒并进行原核表达、抗体制备。方法应用基因工程技术将编码截短型土拨鼠肝炎病毒核心蛋白（WHcAg1～149aa）的基因片段装入原核表达载体pQE60上,在JM109菌内进行诱导表达,使用切胶回收及Ni-NTA柱两种方法纯化目的蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及Western blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了含截短型土拨鼠肝炎病毒核心区基因的质粒并获得表达,经纯化得到了分子量约为16.5kD的重组核心蛋白,免疫家兔获得了高效价的特异性多克隆抗体,而且与HBcAg有交叉反应。结论获得的重组截短型土拨鼠肝炎病毒核心抗原（1～149aa）纯度高,免疫原性强。获得的兔抗-WHc效价高,特异性好,与HBcAg有交叉反应。     

日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆表达及其免疫原性的初步研究

目的 克隆和表达日本血吸虫(中国大陆株)tetraspanins胞外环2编码基因(sj-tsp-2),初步研究其免疫原性.方法 通过全基因合成方式获得目的 基因片段,构建重组质粒pET32a-sj-tsp-2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,在非变性条件下纯化融合蛋白.结果 通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,融合蛋白和目的 肽段与预计大小基本一致.Western Blotting和ELISA结果说明,该融合蛋白具有良好的免疫原性.免疫定位分析显示,Sj-TSP-2主要在日本血吸虫体被表达.结论 本实验成功克隆和表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因,并纯化获得其融合蛋白,为进行动物保护性实验莫定了基础.     

重组人HMGN2多克隆抗体的制备及应用

目的制备人高迁移率非组蛋白N2(HMGN2)多克隆抗体,并用于HMGN2的亚细胞定位分析。方法提取人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)总RNA,应用RT-PCR从其总RNA中分离HMGN2cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMGN2基因大肠杆菌表达载体。应用GST亲合层析柱分离GST-HMGN2融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化。用ELISA法检测HMGN2抗体,免疫细胞化学染色法分析HMGN2的亚细胞分布。结果经酶切产物电泳分析和DNA序列测定证明成功构建出HMGN2基因重组原核表达载体pGEX-1λT-HMGN2。转化大肠杆菌经异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得相对分子质量约35×103的GST-HMGN2融合蛋白。该融合蛋白免疫所得免疫血清经ELISA检测显示获得滴度为1∶2000的较高效价的兔抗人HMGN2多克隆抗体。并应用此抗体对THP-1细胞进行的免疫细胞化学染色显示,经LPS刺激后除细胞核外,胞浆亦明显着色。而且用ELISA法在细胞培养液亦检测到HMGN2。结论本实验成功制备出HMGN2特异多克隆抗体,免疫细胞化学分析初步证明在LPS刺激下HMGN2不仅分布于单核吞噬细胞核,还分布于细胞浆,并可释放到细胞外。     

S100A16基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的:构建S100A16原核表达载体,制备S100A16蛋白多克隆抗体并初步鉴定?方法:RT-PCR扩增得到小鼠肝脏组织的S100A16基因,将此片段克隆到带有His标签的原核表达载体pET-28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21(DE3)?IPTG诱导融合蛋白表达,以亲和层析的方法纯化His-S100A16融合蛋白?纯化蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫新西兰白兔制备抗血清?分别采用ELISA和Western blot方法检测抗体效价和特异性?结果:经双酶切和核酸序列分析证实成功构建pET-28a-S100A16原核表达质粒?考马斯亮兰染色结果证实IPTG可有效诱导融合蛋白表达?用纯化融合蛋白免疫新西兰白兔得到的S100A16抗体血清,经ELISA和Western blot检测结果显示该抗体效价高,特异性好?结论:构建带有His标签的S100A16原核表达载体,并获得高纯度His-S100A16融合蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究S100A16生物学功能奠定基础?     

转录因子Blimp-1的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。     

腺相关病毒衣壳保守区多价抗原肽的原核表达及多克隆抗体制备

目的 原核表达和纯化腺相关病毒（AAV）衣壳保守区抗原肽,制备抗AAV衣壳保守区的兔多克隆抗体。方法 设计并合成编码AAV衣壳蛋白保守区的DNA,将序列克隆到载体pET30a,获得质粒pET30a-AAV-CR,原核表达并纯化保守区多价抗原肽,考马斯蓝染色法及Western blot法对AAV保守区多价抗原肽进行鉴定。将日本大耳朵白兔分为实验组与对照组（1只/组）,实验组注射AAV保守区蛋白制备多克隆抗体,对照组注射PBS,ELISA检测抗体效价,Western blot及细胞免疫荧光法检测抗体应用效果。结果 成功构建了表达AAV衣壳保守区抗原肽的质粒pET30a-AAV-CR,表达纯化得到相对分子质量为17000的蛋白质;纯化后的蛋白可在兔体内诱导产生针对AAV衣壳保守区的抗体,且该抗体能广泛性识别AAV1-AAV10衣壳蛋白序列。结论 诱导出AAV衣壳保守区蛋白并成功获得了抗AAV衣壳保守区的多克隆抗体,为后续载体开发以及生物学功能研究奠定了基础。     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达

目的 扩增四株淋球菌外膜蛋白PI基因，构建pET30b-PI-NG重组子，在大肠杆菌中诱导表达外膜蛋白PI．方法 采集临床淋球菌四株，提取细菌基因组DNA，PCR扩增外膜蛋白PI基因，与克隆载体pBS-T连接，构建pBS-T-PI-NG重组子，测序，目的基因插入表达质粒载体pET30h中，构建pET30h-PING重组子，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白质表达，SDS-PAGE初步分析．结果 成功构建了四株淋球菌的pET30b-PI大肠杆菌表达重组子，经IPTG诱导表达后，其中三株获得表达的目的蛋白PI。结论 本研究为PI蛋白免疫学特性的研究、抗体制备、以及预防淋病疫苗的研制莫定了基础。