TGF-β1对炎症状态下人牙周膜成纤维细胞的调控作用

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对在牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖（lipopolysaccharide from Porphyromonas gingivalis,Pg-LPS）刺激模拟炎症状态下的人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs）的调控作用。方法 获取hPDLFs并进行免疫组化鉴定,通过qRT-PCR与CCK-8确定Pg-LPS的刺激浓度。将hPDLFs分成4组：空白对照组,单纯100μg/mL Pg-LPS;低浓度组,1 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;中浓度组,10 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS;高浓度组100 ng/mL TGF-β1+100μg/mL Pg-LPS。CCK-8检测细胞增殖情况;划痕实验与Transwell小室实验检测hPDLFs细胞迁移能力;流式细胞术检测hPDLFs的细胞周期;qRT-PCR检测hPDLFs的转录因子叉头盒p3(forkhead/winged h...     

Pg-LPS对束缚应激大鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响

目的：检测牙龈卟啉菌内毒素（Pg-LPS）对束缚应激大鼠腹腔巨噬细胞凋亡情况的影响，初步探讨应激影响牙周疾病的机制。方法：采用束缚应激方式，将大鼠随机分为正常对照组、应激组，于应激结束时处死动物，常规收集腹腔液。巨噬细胞于贴壁纯化后分别用RPMI-1640培养液，RPMI-1640培养液＋0．01μg／ml Pg-LPS，RPMI-1640培养液＋1μg／ml Pg-LPS继续培养。于24h后收集细胞爬片，采用荧光染色法、原位末端标记法（TUNEL）观察巨噬细胞凋亡情况。结果：1μg／ml Pg-LPS刺激后，正常对照组及应激组巨噬细胞的凋亡率明显增加，应激组巨噬细胞凋亡率显著高于正常对照组。结论：一定浓度的即LPS刺激后，大鼠腹腔巨噬细胞发生凋亡；束缚应激能加重这种异常。     

高糖状态对脂多糖诱导人牙龈上皮细胞表达炎症因子的影响

目的：研究高糖状态对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导人牙龈上皮细胞（humangingivalepithelial cells,HGECs）表达炎症因子的影响。方法原代培养HGECs,取第3代细胞分别在含5．5 mmol／L D－葡萄糖（对照组）、含25 mmol／L D－葡萄糖（高糖组）培养基中培养48 h后,加入0μg／mL、1μg／mL、5μg／mL和10μg／mL的LPS,2 h、4 h和8 h时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测炎症因子白细胞介素－6（interleukin-6, IL-6）、白细胞介素－8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素－1β（interleukin-1,IL-1β）的mRNA表达,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-8的表达。结果在5μg／mL LPS 刺激8 h 后,高糖组和对照组 HGECs 炎症因子转录水平 IL-6分别为13．20±0．84和8．85±0．53（t＝7．60,P＝0．002）,IL-8分别为14．88±1．54和8．12±0．46（t＝7．281,P＝0．002）, IL-1β分别为1．69±0．19和1．27±0．11（t＝3．348,P＝0．029）,两组比较差异均具有统计学意义（P＜0．05）;两组细胞培养上清液中IL-8的表达分别为（134．0±10．8） pg／mL和（103．0±11．0） pg／mL,差异具有统计学意义（t＝3．480,P＝0．025）。结论高糖状态可增强LPS诱导HGECs炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β的表达。     

环孢素A联合脂多糖对牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的探讨环孢素A(CsA)联合牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)对人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)增殖的影响。方法改良组织块法培养hPDLFs,分别用CsA(10、100、200、400ng/ml),Pg-LPS(10、100、1000ng/ml),CsA(100ng/ml)加Pg-LPS(100ng/ml),CsA(100ng/ml)加Pg-LPS(1000ng/ml)作用于生长良好的第3～5代细胞,MTT法测其药物作用用下的增殖情况。结果细胞经上述浓度CsA或Pg-LPS作用后形态无明显变化,CsA在100ng/ml浓度情况下,促细胞增殖作用最明显;高浓度Pg-LPS(1000ng/ml)显著抑制细胞增殖,100ng/mlCsA能够显著降低Pg-LPS(1000ng/ml)对细胞增殖的抑制效应;CsA(100ng/ml)与Pg-LPS(100ng/ml)联合作用于细胞时,对细胞的增殖无明显影响。结论在一定的浓度下,CsA促PDLF增殖作用明显;CsA能对抗脂多糖(LPS)抑制细胞增殖的效应。     

白介素10对伴放线放线杆菌内毒素诱导兔肺巨噬细胞凋亡的影响

目的：探讨白介素10（IL-10）对伴放线放线杆菌内毒素（Aa—LPS）体外诱导兔肺巨噬细胞凋亡作用的影响。方法：经兔气管肺泡灌洗获得肺泡巨噬细胞,随机分为空白对照组、Aa—LPS组、Aa—LPS＋IL-10组。按实验分组加入Aa—LPS（1汕g／mL）、IL-lo（o．1p．g／mL）,24h后裂解细胞,荧光定量PCR法检测促凋亡基因bax、p53和caspase-3的表达。结果：Aa—LPS组bax、caspase-3的表达较空白对照组明显升高（P〈0．05）,p53的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。Aa—LPS＋IL-10组bax、p53、caspase．3的表达较Aa—LPS组降低（P〈0．05）。结论：Aa—LPS体外对肺巨噬细胞有促凋亡作用,IL-10可抑制Aa—LPS的促凋亡作用,其机制可能与细胞凋亡的线粒体途径有关。     

骨化三醇对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙周膜细胞IL-8、IL-6表达的影响研究

目的    观察活性形式的维生素D——骨化三醇（1,25D）对牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）诱导的人牙周膜细胞（hPDLCs）白细胞介素（IL）-8、IL-6表达的影响。方法    取3例患者因正畸需要拔除的前磨牙牙周膜,组织块法原代培养hPDLCs,分别用0.1%无水乙醇（对照组）、10 μg/mL Pg-LPS（单纯Pg-LPS组）、10-10 mol/L 1,25D（低浓度1,25D组）、10-8 mol/L 1,25D（高浓度1,25D组）、10-10mol/L 1,25D+ 10 μg/mL Pg-LPS（低浓度1,25D联合Pg-LPS组）、10-8mol/L 1,25D+ 10 μg/mL Pg-LPS（高浓度1,25D联合Pg-LPS组）处理第5代细胞。24和48 h后收集培养基上清液,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测hPDLCs IL-8和IL-6的表达水平。结果    （1）10 μg/mL Pg-LPS处理hPDLCs 48 h时,其IL-8表达水平最高,为对照组的38.86倍（P＜0.001）;处理hPDLCs 24 h时,其IL-6表达水平最高,为对照组的 6.19倍（P＜0.001）。（2）1,25D 以剂量和时间依赖方式抑制hPDLCs IL-8的内源性表达。10-8 mol/L 1,25D 处理hPDLCs 48 h时,其IL-8表达水平为对照组的49.94%（P＜0.001）。（3）1,25D 显著抑制Pg-LPS诱导的hPDLCs IL-8和IL-6的表达。处理48 h时,高浓度1,25D联合Pg-LPS组hPDLCs IL-8的表达水平为单纯Pg-LPS组的71.98%（P＜0.001）;处理24 h时,高浓度1,25D联合Pg-LPS组hPDLCs IL-6的表达水平为单纯Pg-LPS组的84.51%（P = 0.003）。结论    1,25D可以抑制hPDLCs IL-8的内源性表达,并抑制Pg-LPS诱导的hPDLCs IL-8和IL-6的表达,从而可能抑制牙周炎症反应。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对牙周韧带细胞LIF mRNA表达的影响

目的观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS）对人牙周韧带细胞（human periodontal ligament cells,HPDLCs）白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）表达的影响,探讨LIF与牙周病发生发展的关系。方法体外分离培养鉴定HPDLCs,取第3~5代细胞用于实验,使用不同浓度（1μg/m L和10μg/m L）的Pg-LPS刺激HPDLCs24h,实时定量反转录-聚合酶链反应检测LIF mRNA的表达。结果 Pg-LPS组LIF mRNA表达均明显高于对照组（P〈0.01）,并且Pg-LPS浓度越高,LIF mRNA表达越强。结论 Pg-LPS能够诱导人牙周韧带细胞LIF表达上调,这一机制可能在牙周炎发生发展过程中发挥重要作用。     

西格列汀激活基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子受体4信号通路对脂多糖诱导的人牙周膜干细胞增殖、凋亡、炎症和成骨分化的影响

目的 探讨西格列汀对脂多糖（LPS）诱导的炎症微环境下人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖、凋亡、炎症和成骨分化的影响及分子机制。方法 体外培养hPDLSCs,用不同浓度的西格列汀处理后检测细胞活力,以确定后续西格列汀实验浓度。采用1μg/mL LPS刺激诱导24 h建立hPDLSCs炎症模型并分为空白组、对照组、西格列汀低浓度组（0.5μmol/L）、西格列汀中浓度组（1μmol/L）、西格列汀高浓度组（2μmol/L）、西格列汀高浓度+基质细胞衍生因子-1 (SDF-1)/CXC趋化因子受体4 (CXCR4)通路抑制剂（AMD3100）组（2μmol/L+10μg/mL）。细胞计数试剂盒-8检测培养24、48、72 h后的hPDLSCs增殖活性;流式细胞术检测培养72 h后hPDLSCs凋亡情况;诱导成骨分化21 d后茜素红染色检测hPDLSCs成骨分化能力,试剂盒测定hPDLSCs中碱性磷酸酶（ALP）活性;酶联免疫吸附检测hPDLSCs培养上清液中炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6水平;实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测hPDLS...     

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目的：研究苯妥英钠（PHT）对内毒素作用下人牙周膜干细胞（hPDLSCs）增殖的影响。方法本研究于2009年8月至2012年6月在滨州医学院中心实验室和西安交通大学医学院中心实验室完成。采用四唑盐（MTT）比色方法,测定体外培养的hPDLSCs分别在20μg/mL PHT＋100 ng/mL脂多糖（LPS）、5μg/mL PHT＋100 ng/mL LPS、20μg/mL PHT和5μg/mL PHT作用下的增殖活性。结果20μg/mL PHT和5μg/mL PHT均能显著促进hPDLSCs的增殖,且20μg/mL PHT促进增殖的能力显著强于5μg/mL PHT;加入100 ng/mL LPS对20μg/mL和5μg/mL PHT促进增殖能力均无明显影响。结论低浓度PHT能促进hPDLSCs的增殖,少量内毒素的存在并不影响PHT促进hPDLCs增殖的生物学作用。     

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目的研究盐酸米诺环素对脂多糖（LPS）作用下人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）的白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。方法本研究于2011年10月至2012年2月在井冈山大学医学院重点实验室进行。培养HPDLF并分为以下5组：对照组（未加药）、高剂量组（0．01g／LLPS＋0．2班盐酸米诺环素）、低剂量组（0．0lg／LLPS＋0．05g/L盐酸米诺环素）、中剂量组（0．01g／LLPS＋0．1g／L盐酸米诺环素）、模型组（0．0lg／LLPS）,每组均复种3孔。实时荧光定量PCR检测各组HPDLF中的IL-6mRNA表达情况。结果对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组、模型组的IL-6mRNA相对表达量分别为：0．61±0．08、0．62±0．10、0．88±0．17、0．49±0．21、1．88±0．07。模型组IL-6mRNA的相对表达量高于对照组、高剂量组、低剂量组、中剂量组,且差异有统计学意义（P〈0．01）。对照组及低、中、高剂量组的IL-6mRNA相对表达量两两比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论盐酸米诺环素能够降低LPS作用下HPDLF中的IL-6mRNA的表达,这可能是盐酸米诺环素治疗牙周炙的作用机制之一。     

白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）表达核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）的影响;并进一步研究IL-22是否与牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）具有协同刺激作用。 方法酶消化法结合组织块法原代培养hPDLF,免疫细胞化学染色法鉴定其来源;取第3~ 5代细胞给予不同浓度（0、5、10、25、50、100 ng/mL）IL-22刺激,培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞毒性实验;采用5、10、25 ng/mL IL-22作用于hPDLF 72 h,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测RANKL、OPG mRNA的表达;随后选择最佳刺激浓度10 ng/mL IL-22,与1 μg/mL Pg-LPS分别或协同刺激hPDLF 72 h,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RANKL、OPG mRNA和蛋白水平的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。 结果50、100 ng/mL IL-22刺激hPDLF后,细胞活力明显下降（F_{24 h}= 15.17,F_{48 h}= 76.37,F_{72 h}= 24.409,P<0.05）;5、10、25 ng/mL IL-22均可上调hPDLF RANKL mRNA表达（F= 32.88,P<0.05）,但是对OPG mRNA表达无明显影响（F= 0.719,P= 0.555）;10 ng/mL组和25 ng/mL组上调RANKL mRNA表达较5 ng/mL组显著（P<0.05）;1 μg/mL Pg-LPS亦可显著上调hPDLF RANKL mRNA和蛋白水平的表达;而10 ng/mL IL-22与1 μg/mL Pg-LPS协同作用下RANKL mRNA和蛋白表达可进一步显著上调（F_mRNA= 36.67,F_蛋白= 41.24,P<0.05）,但是对OPG的表达无明显影响（F_mRNA= 0.652,P= 0.593;F_蛋白= 1.271,P= 0.313）。 结论IL-22可通过影响hPDLF表达RANKL/OPG参与牙周炎骨破坏,并且与Pg-LPS具有协同作用。     

Gingival crevicular fluid can degrade Emdogain and inhibit Emdogain‐induced proliferation of periodontal ligament fibroblasts

Laaksonen M, Salo T, Vardar‐Sengul S, Atilla G, Han Saygan B, Simmer JP, Baylas H, Sorsa T. Gingival crevicular fluid can degrade Emdogain and inhibit Emdogain‐induced proliferation of periodontal ligament fibroblasts. J Periodont Res 2010; 45: 353–360. © 2009 The Authors. Journal compilation © 2009 Blackwell Munksgaard Background and Objective: Emdogain^® (EMD), consisting mostly of amelogenin, is used in periodontal therapy to regenerate lost connective tissue. Emdogain is applied onto periodontally affected root surfaces, where it becomes exposed to proteolytic enzymes. In this study, we aimed to find out whether gingival crevicular fluid or matrix metalloproteinases (MMPs) could degrade EMD, and whether this degradation has consequences for in vitro cell proliferation. Material and Methods: We studied the effects of 156 gingival crevicular fluid samples collected from subjects with different stages of periodontal disease and from healthy control subjects and the effects of MMP‐1, ‐2, ‐8, ‐9, ‐13 and ‐14 on the degradation of EMD using EMD‐embedded zymography. The effects of gingival crevicular fluid with or without EMD and the effects of amelogenin on the proliferation of cultured periodontal ligament fibroblasts were studied by cell proliferation enzyme‐linked immunosorbent assay kit. Results: Degradation of Emdogain induced by gingival crevicular fluid was greater in samples from all stages of periodontal diseases compared with healthy control samples. Of the MMPs studied, only MMP‐2 and MMP‐8 showed limited EMD‐degrading activities. One hundred micrograms per millilitre of EMD increased proliferation of periodontal ligament fibroblasts on average by 24% (confidence interval 0.60–0.64) and at 200 μg/mL by 30% (confidence interval 0.62–0.68) compared with control fibroblasts (confidence interval 0.48–0.52). However, gingival crevicular fluid (10 μg/mL) together with 100 μg/mL EMD induced the proliferation only by 6% (confidence interval 0.51–0.55) and with 200 μg/mL EMD by 12% (confidence interval 0.54–0.58). Amelogenin at 200 μg/mL decreased the proliferation of periodontal ligament fibroblasts by 54% (confidence interval 0.22–0.25). Conclusion: We suggest that diseased gingival crevicular fluid containing various proteases leads to degradation of EMD and decreased proliferation of periodontal ligament fibroblasts.     

槟榔碱对人牙周膜成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究槟榔碱(Arecoline)对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibro-blast,hPDLFs)中凋亡及相关蛋白p-JNK、p-p53、Bcl-2表达的影响.方法 采用组织块培养法培养原代hPDLFs,并传代纯化后用于实验.采用浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的槟榔碱处理牙周膜成纤维细胞12 h,通过MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,蛋白免疫印记法检测槟榔碱对hPDLFs中p-JNK、p-p53、Bcl-2表达的情况.结果 槟榔碱作用于hPDLFs后,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率随着药物浓度增加而增加,p-JNK、p-p53蛋白表达逐渐增强,Bcl-2蛋白表达逐渐降低,呈现浓度依赖性.结论 提示槟榔碱可通过激活JNK和p53的磷酸化水平导致hPDLFs的凋亡,对牙周组织的再生有抑制作用.     

依那西普对牙龈卟啉菌内毒素作用下原代培养牙周膜细胞影响的实验研究

目的　观察依那西普（Etanercept）对牙龈卟啉菌内毒素（lipopolysaccharide,LPS)作用下体外培养的人牙周膜细胞(HPDLCs)的增殖能力的影响。方法　体外原代培养人牙周膜细胞,经免疫细胞化学鉴定,加入LPS和1 μg/ml Etanercept+LPS,LPS浓度分别为10、50、100、200、300 μg/ml检测（吸光度）A值。采用MTT法测定细胞增殖能力。结果　 人牙周膜细胞原代细胞生长状态良好。第3代细胞进行鉴定,Vimentin染色呈阳性,Ck(pan)染色呈阴性。MTT法检测加入梯度浓度的LPS 24 h后,HPDLCs增殖率随着LPS浓度的增加,对HPDLCs的增殖抑制逐渐增强,200 μg/ml LPS能最大程度抑制HPDLCS的增殖,抑制率为46.21%(P<0.01)。Etanercept + LPS组对HPDLCs细胞作用相对增殖率与LPS组比较（P＜0.01）,能明显抑制LPS对HPDLCs的抑制作用。结论　TNF-α抑制剂Etanercept能明显抑制牙周膜细胞在内毒素刺激下的死亡。     

胰岛素在高糖环境诱发牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用

目的:探讨胰岛素在高糖环境下牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用。方法:本实验采用含有不同葡萄糖浓度的培养基培养人牙周膜细胞,并采用胰岛素作治疗对照,作用24小时后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞进行计数,最后进行统计学分析。结果:葡萄糖浓度增至15mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例无显著增加(3.47±0.78 VS 3.03±0.40,P>0.05),当葡萄糖浓度增至25mmol/L和35mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例显著增加(5.07±0.611 VS 3.03±0.40,P<0.01;7.13±0.72 VS 3.03±0.40,P<0.01),加入胰岛素后,牙周膜细胞凋亡比例显著下降(7.13±0.72 VS 5.23±0.85,P<0.01),但仍然高于正常糖浓度组(5.23±0.85 VS3.03±0.40,P<0.01)。结论:胰岛素能够部分抑制高糖环境诱发的牙周膜细胞凋亡。     

尼古丁诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的实验研究

目的：了解在体外培养环境中,尼古丁对人牙周膜成纤维细胞凋亡的影响。方法：将尼古丁作用于培养至第6代的人牙周膜成纤维细胞后,通过四唑盐比色法、流式细胞仪研究尼古丁能否诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡。结果：四唑盐比色法证实当尼古丁浓度在0.05～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的抑制呈浓度依赖性,流式细胞仪分析提示,当尼古丁浓度在0.5～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的凋亡率呈浓度依赖性。结论：尼古丁对人牙周膜成纤维细胞有一定的毒性作用,通过抑制牙周膜成纤维细胞增殖和诱导凋亡加重对周膜的破坏。