贾第鞭毛虫病：一种再现的传染性疾病和潜在的人畜共患病

本提出了将贾第鞭毛虫病作为一种再现的传染性疾病的理由，特别是叙及在儿童保健中心，家畜和宠物中的贾第鞭毛虫感染，在人畜共患病传播中的作用以及控制的困难，由于能感染哺乳动物，贾第鞭毛虫种的基因型和表现型的变异性较大，导致至今尚未确定宿主特异性并解决人畜共患传播的问题，最近基于PCR的分子鉴定方法的应用已经对贾第鞭毛虫种群的遗传结构有了较多的了解，本对贾第鞭毛虫感染的人畜共患病的传播和分子流行病学进行了综述。     

抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的制备和特性研究

用体外培养的四川株蓝氏贾第鞭毛虫滋养休免疫BAIB/c小鼠,以免疫脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,共获得3个分泌抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这些McAb经鉴定均属lgG_1亚类。选取活性最强的1E_2株McAb对不同贾第虫株进行抗原定位的测定,由IFA显示,该McAb与四川株和山东株滋养休的后1/3表面呈现荧光反应,但与澳大利亚株滋养体表面不显荧光,表明国内株与国外澳大利亚株滋养体表膜抗原存在株间差异。     

贾第虫病免疫学诊断方法研究进展

贾第虫(Giardia)由列文·虎克(Leeuwen Hoek)于1681年发现,作为重要的人畜共患病病原体,其致病性自20世纪70年代以来才逐步被认识[1].     

甲硝唑对体外蓝氏贾第鞭毛虫形态结构的损伤

用含甲硝唑500 μg/ml（12h LC₅₀）的改良TYI-S-33培养基培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体。分别用光镜和电镜观察药物作用后2、4、8及12 h虫体的形态变化。光镜观察显示：虫体变圆，从培养管壁脱落，鞭毛摆动迟缓或停止，细胞质出现空泡。电镜观察显示：虫体胀大、变圆、细胞质内核糖体溶解，出现大量空泡；核呈锯齿状异形。证实甲硝唑对体外培养的贾第虫滋养体的形态结构有明显的损伤作用。     

两种浓缩方法用于隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的比较

目的 评价并比较用于检测隐孢子虫和贾第鞭毛虫的2种浓缩方法,探寻最优浓缩方法。方法 按照GB/T5750.12.2006《生活饮用水标准检验方法》,利用第3方定值质控物Colorseed,制成6组12个20 L蒸馏水/水源水加标样本。富集浓缩卵囊和孢囊,浓缩分别采用离心法和抽滤法,2种浓缩方法收集到的卵囊和孢囊分别进行免疫磁分离、染色计数。结果 离心法每次最多离心4个样本且耗时大于30 min;隐孢子虫平均回收率、变异系数分别为29.67%和20.00%;贾第鞭毛虫平均回收率、变异系数分别为27.67%和15.00%。抽滤法单个样品仅需5 min;隐孢子虫平均回收率、变异系数分别为43.17%和11.00%;贾第鞭毛虫平均回收率、变异系数分别为42.00%和8.00%。结论 浓缩采用抽滤法比离心法耗时更短,回收率更高,变异系数更小。抽滤法对提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检出率是有效的。     

基于TPI基因的城市污水中蓝氏贾第鞭毛虫的分子鉴定

目的对哈尔滨市污水处理厂原水中的蓝氏贾第鞭毛虫进行分子鉴定。方法收集哈尔滨市污水处理厂原水样,提取基因组DNA,巢式PCR扩增蓝氏贾第鞭毛虫TPI基因,通过序列分析确定蓝氏贾第鞭毛虫的集聚体类型和亚型,并进行同源性分析。结果从哈尔滨市污水处理厂原水DNA提取物中扩增出蓝氏贾第鞭毛虫TPI基因,经分子鉴定为蓝氏贾第鞭毛虫集聚体AII,其序列与文献报道人源蓝氏贾第鞭毛虫集聚体AII序列(AB516351,FJ560570,EF688021)的同源性为100%。结论哈尔滨市污水处理厂原水中存在蓝氏贾第鞭毛虫集聚体AII,威胁当地居民健康。     

4种蓝氏贾第鞭毛虫体外诱导成囊方法的比较

评价 4种不同的体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫成囊方法。采用 4种已报道的方法对蓝氏贾第鞭毛虫C2株进行体外诱导成囊 ,并统计包囊数目。结果表明 4种方法都可诱导成囊 ,但成囊数之间存在显著差异。方法 3获得的包囊数最高 ,为 1× 10 5/mL。方法 3为体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫C2株成囊的一种简便且易获得大量包囊的方法。     

双氢青蒿素对体外蓝氏贾第鞭毛虫滋养体细胞骨架的损伤作用

目的：观测双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对体外培养的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体细胞骨架的损伤作用.方法：将用含双氢青蒿素的改良TYI-S-33培养基培养后的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,用专一性结合f-肌动蛋白(f-actin)的荧光染料罗丹明-鬼笔环肽(rhodanmine phalloidin,RDP)标记微丝,结合微管的紫杉醇(Paclitaxel,Oregen Green 488,P22310)标记微管,用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测、分析,用激光共聚焦显微镜(confocal microscopy,CFM)观察滋养体微丝和微管的变化.结果：经双氢青蒿素0.002mg/L(LC_(50))作用12h,RDP标记后,流式细胞仪检测结果显示,滋养体的微丝结构有明显的损伤,其FCM激发光荧光强度值(16.18±11.02)明显低于对照组(81.7±6.43),二者有显著性差异(P＜0.01);激光共聚焦显微镜观察显示,虫体形态及轮廓不完整.经P22310标记后,共聚焦显微镜下显示.虫体的吸盘和鞭毛轮廓不清,荧光强度降低或消失,实验组吸盘面积的荧光强度值与对照组比较有显著性差异(χ~2=3.154,P<0.01).结论：双氢青蒿素对体外蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的细胞骨架有明显的损伤作用.     

基于磷酸丙糖异构酶基因序列的蓝氏贾第鞭毛虫分子系统发育的研究

[目的 ]探讨蓝氏贾第鞭毛虫种内系统发育及遗传多样性。 [方法 ]对不同来源虫株的磷酸丙糖异构酶(tim)基因进行 PCR扩增、序列测定后 ,用简约法和 NJ法构建分子系统树进行系统学分析。 [结果 ]在所测序列中共有 12 4个位点存在变异 (2 3% ) ,且大多数为发生在第三密码子的同义突变 ,两种构树方法所得两树的分枝结构相似 ,均将受试的 16株蓝氏贾第鞭毛虫分为明显的两组。 [结论 ]tim基因可作为研究蓝氏贾第鞭毛虫群体遗传结构一个有效的遗传标记     

1例蓝氏贾第鞭毛虫感染者的虫种分子鉴定及基因溯源

对1例蓝氏贾第鞭毛虫感染者进行虫种分子鉴定并分析其感染来源。收集患儿与其父母、保姆的新鲜粪样,碘液染色后镜检,提取粪样DNA,采用巢式PCR扩增贾第虫磷酸丙糖异构酶（tpi）、谷氨酸脱氢酶（gdh）、β-贾第素（bg）基因并测序,通过BLAST、ChromasPro和MEGA 11.0等软件对基因序列进行系统进化分析并判断其集聚体类型。结果显示,镜下可见患儿粪样中有贾第虫滋养体和包囊。巢式PCR均扩增出约500 bp的条带,与贾第虫属tpi、gdh、bg基因片段一致,确认该患儿为贾第虫感染;患儿父母和保姆均无腹泻症状,但在其父亲粪样中发现贾第虫包囊,结合巢式PCR与测序结果分析,其父为贾第虫带虫者。基因比对分析结果显示,患儿父子二人粪样扩增出的tpi、gdh、bg基因序列一致性分别为99.8%、100%和98.5%,其中tpi基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型（GenBank登录号：LC183963）的序列一致性分别为100%、99.8%,gdh基因序列与贾第虫集聚体AⅡ型（GenBank登录号：KF843931）的序列一致性分别为99.6%、100%,患儿bg基因序列与集聚体AⅢ型（Gen...     

蓝氏贾第鞭毛虫胞外核酸酶的表达纯化和活性鉴定

目的 克隆、原核表达蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,贾第虫)的胞外核酸酶编码区,并对其蛋白产物进行活性鉴定。方法 对贾第虫胞外核酸酶(GeNuc)蛋白进行生物信息学分析,根据分析结果以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得GeNuc去信号肽段编码区序列,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物。Ni-NTA亲和层析纯化GeNuc蛋白,经复性后验证其对质粒DNA的水解能力。结果 成功克隆了长约800 bp的GeNuc编码区并构建了原核表达载体pET-28a(+)-GeNuc,测序结果显示C2株GeNuc序列与WB株相同;在大肠杆菌中诱导表达获得了相对分子量约30.8 kDa的融合蛋白;复性后的纯化GeNuc蛋白具有降解双链DNA的能力,但活性较商品化DNaseⅠ低。结论 证明了GeNuc的存在,为GeNuc抗体的制备及贾第虫致病机制的研究提供了实验材料。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析

目的 克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法 PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM-T-H3重组载体,转化E. coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoⅠ和 XhoⅠ构建pET28a(+)-H3重组载体,转化E. coli Rosetta( DE3),IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果 成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论 C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。     

分子流行病学研究中常用技术方法的基本假设和局限性

本文探讨了流行病学研究中一些以PCR为基础的常用技术方法的基本假设和局限性。此类方法可用来鉴定寄生虫的种和株。但其中某些方法,如多态DNA随机扩增,其本身特性限制了它的应用;而以PCR-限制性片段长度多态性分析为基础发展某一生物的诊断系统则需要一个准确的分类学或遗传学框架。文中尚以肠贾第鞭毛虫为例,讨论了缺乏此框架时发展诊断探针所遇到的问题。     

蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫双重荧光定量PCR两步法检测技术的建立

目的 建立同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫的双重荧光定量PCR两步检测方法。方法 针对蓝氏贾第鞭毛虫的gdh基因和微小隐孢子虫的cowp基因分别设计特异性引物和TaqMan探针。优化引物和探针浓度后,确定反应体系和反应条件,对其灵敏度、特异性、稳定性和重复性进行评价。通过与金标层析法进行医源性腹泻样本检测的比较评估该方法的实际应用价值。结果 该方法能特异地检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,对其它非目标虫种均不产生扩增曲线,特异性良好。对阳性质粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同时定量扩增的敏感度分别为45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;阳性质粒标准品的标准曲线在10⁹ copies/μL10¹ copies/μL之间线性关系良好(R²=0.99),批内和批间重复实验的变异系数均小于5%。该方法与金标层析法具有较好的一致性。结论 建立的双重荧光定量PCR两步法可快速、灵敏、特异地同时检测蓝氏贾第鞭毛虫和微小隐孢子虫,具有较好的实际应用价值。     

C2株蓝氏贾第鞭毛虫TCTP基因的克隆、表达和序列分析

目的克隆C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)的翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)编码区,对其进行生物信息学分析和原核表达。方法根据WB株贾第虫TCTP编码区序列设计引物,以C2株贾第虫基因组DNA为模板扩增获得TCTP编码区片段,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),将酶切和测序验证正确的重组质粒转化E. coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定蛋白产物,采用Ni-NTA经亲和层析纯化重组蛋白。同时根据测序结果分析C2株贾第虫TCTP蛋白结构特征和进化关系。结果克隆了包含酶切位点全长470 bp的C2株贾第虫TCTP编码区,构建了原核表达载体pET-28a(+)-TCTP,在Rosetta(DE3)中表达、纯化得到了相对分子量约18.5 kDa的融合蛋白,与预期相符;测序结果显示C2株贾第虫TCTP序列与WB株相同,生物信息学分析显示贾第虫TCTP蛋白虽然序列长度较其它物种更短但与裂殖酵母TCTP空间结构相似,均由4个β折叠和3个主要的α螺旋组成,位于序列中部的不规则环状结构更小,仅9个氨基酸残基组成,在进化上与其它真核生物亲缘关系较远。结论成功克隆表达了贾第虫TCTP,为TCTP功能及贾第虫致病机制的研究提供了实验依据。     

体外蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的形态学观察

目的观察体外培养的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体超微结构,探究贾第虫滋养体的核仁。方法用改良TYI-S-33培养基培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,姬姆萨(Giemsa)染色和铁苏木素染色后光镜观察虫体的形态结构;以透射电镜观察虫体的超微结构;以核仁特异性抗体作用虫体产生间接免疫荧光,用激光共聚焦显微镜检测核仁。结果光学显微镜下观察姬姆萨染色后的贾第虫胞质为淡监色,可见1对细胞核,核内有分散的染色体,数目为10条;4对鞭毛、1对半月形的中体、轴柱。铁苏木素染色可见1对椭圆形的泡状细胞核内各有1个细小的核仁。透射电镜观察虫体外观颜面状,呈倒置的梨形:质膜下可见单层排列、大小均匀的小囊泡;可见虫体的细胞器:游离核糖体颗粒、内质网;细胞骨架:腹吸盘、鞭毛、基体、中体的微管结构;核结构:核膜、核孔、核仁、染色体。激光共聚焦显微镜观察发现分裂间期虫体细胞核内有绿色荧光并聚集为核仁,在分裂期虫体内绿色荧光呈弥散分布。结论光镜和电镜观察结果显示体外蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的形态结构复杂,有典型的核仁、染色体及复杂的细胞骨架结构。     

贾第虫在同社区中人与犬相互传播的流行病学和分子生物学证据[英]／Yraub RJ，Monis PT，Robert-son I，et al∥Parasitology

蓝氏贾第鞭毛虫(贾第虫)寄生于人、犬和多种哺乳动物的肠道，其传播途径主要是通过污染了包囊的水源。贾第虫是否可以在人与犬之间互相传播仍有争议，若得到证实，那么无论是家养的犬还是野外的犬都会成为潜在的感染源，值得重视。有研究显示人源和动物源的贾第虫具较高的遗传异质性，