重组人血小板第4因子在大肠杆菌中的表达及其性质分析(英文)

利用PCR和重组DNA技术,在大肠杆菌中得到高效表达的人血小板第4因子(rhPF4)。rhPF4的分离纯化经肝素亲和层析和高效液相层析二步法实现。纯化产物进行了免疫学鉴定、蛋白质银染测定、N-末端氨基酸序列分析和活性分析,结果得到纯度高且具有与天然PF4一样的抑制巨核细胞生成活性的rhPF4。此方法为开发新药和深入研究PF4的作用机制奠定了基础。     

重组人血小板第4因子生物学活性的分析

目的：分析重组人血小板第４因子（ｒｈＰＦ４）的生物学活性。方法：采用小鼠骨髓巨核细胞以及人巨核细胞白血病细胞株，从体内和体外多方面比较天然ＰＦ４和ｒｈＰＦ４的生物学活性。结果：此ｒｈＰＦ４具有与天然ＰＦ４相同的抑制小鼠骨髓巨核细胞祖细胞生长、减少集落形成的能力，这种抑制作用能被肝素中和；ｒｈＰＦ４对人巨核细胞白血病细胞株Ｍｅｇ－０１生长也有抑制作用。结论：ｒｈＰＦ４可取代天然ＰＦ４应用于临床及科研。     

重组血小板第4因子在甲醇酵母中的高效表达

目的 利用甲醇酵母高效表达重组人血小板第4因子（rhPF4)。方法 用PCR方法扩增出血小板第4因子（PF4）cDNA序列,插入到穿梭质粒pPIC9的MFα信号肽后,在醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子的下游,得到重组质粒pPIC9-PF4,转化到甲醇酵母宿主菌GS115,经筛选得到PF4高表达菌株进行表达,并测定表达产物氨基酸序列和生物学功能。结果 rhPF4氨基酸序列与天然PF4相同,可中和肝素抗凝作用,并呈剂量相关。结论 rhPF4可在甲醇酵母中获得生产规模表达,产物性质和天然的PF4相同。     

血小板第4因子的研究进展

血小板第4因子是一种激活的血小板分泌的趋化因子,与多种细胞的生物功能有关。该因子对造血干细胞、肿瘤细胞及其他细胞有广泛的调节作用,能支持造血干细胞生长,降低细胞的化学敏感性、抑制细胞凋亡,对红系、巨核细胞系均有作用;可通过对内皮细胞周期、成纤维细胞生长因子2及其相应受体的作用抑制内皮细胞生长;还能通过多种机制抑制肿瘤的生长。在该因子的作用过程中,肝素等糖胺聚糖起到了介导、贮存等多种重要作用。本文即对此因子的结构和功能作一简述,介绍其在造血调节和抑制肿瘤生长等方面的研究进展。     

血小板第4因子对脐血CD34+细胞黏附功能的影响

目的研究血小板第4因子(PF4)对新鲜脐血CD34+细胞及扩增后脐血CD34+细胞黏附功能的影响;PF4对脐血CD34+细胞上的黏附分子CD49d及基质细胞趋化因子(SDF-1)受体CXCR4的作用.方法采用免疫磁珠法(MACS)分选CD34+细胞,结晶紫染色测定细胞总黏附性,免疫荧光标记流式细胞仪测定CD49d及CXCR4的表达.结果①PF4 可使新鲜脐血CD34+细胞总黏附性提高,且与剂量相关.②SDF-1 100 ng/ml可使脐血CD34+细胞总黏附性提高.③脐血CD34+细胞扩增10 d后未加PF4刺激的自发以及经SDF-1诱导的黏附功能开始下降,在扩增脐血CD34+细胞不同时间段加入100ng/ml PF4,脐血CD34+细胞对基质层的黏附能力始终保持较高水平,以0天时脐血CD34+细胞黏附性为100%,扩增14 d时脐血CD34+细胞黏附性PF4组为(262.04±64.81)%,同期对照组为(64.35±8.29)%,经SDF-1诱导下扩增14 d的CD34+细胞的总黏附性PF4组为(138.31±32.39)%,同期对照组为(67.66±12.44)%.④PF4 100 ng/ml作用于CD34+细胞时,CD49d表达增长13.02%,CXCR4表达增长17.33%.结论 PF4可使新鲜及扩增后的脐血CD34+细胞黏附功能增强,并促进CD49d及CXCR4的表达,提示PF4可能有助于脐血干细胞的归巢.     

血小板第4因子对脐血CD_(34)~+细胞黏附功能的影响

目的　研究血小板第 4因子 (PF4 )对新鲜脐血CD34+ 细胞及扩增后脐血CD34+ 细胞黏附功能的影响 ;PF4对脐血CD34+ 细胞上的黏附分子CD4 9d及基质细胞趋化因子 (SDF 1)受体CXCR4的作用。方法　采用免疫磁珠法 (MACS)分选CD34+ 细胞 ,结晶紫染色测定细胞总黏附性 ,免疫荧光标记流式细胞仪测定CD4 9d及CXCR4的表达。结果　①PF4可使新鲜脐血CD34 + 细胞总黏附性提高 ,且与剂量相关。②SDF 110 0ng ml可使脐血CD34+ 细胞总黏附性提高。③脐血CD34+ 细胞扩增 10d后未加PF4刺激的自发以及经SDF 1诱导的黏附功能开始下降 ,在扩增脐血CD34+ 细胞不同时间段加入 10 0ng mlPF4 ,脐血CD34 + 细胞对基质层的黏附能力始终保持较高水平 ,以 0天时脐血CD34 + 细胞黏附性为10 0 % ,扩增 14d时脐血CD34+ 细胞黏附性PF4组为 (2 6 2 .0 4± 6 4 .81) % ,同期对照组为 (6 4 .35±8 2 9) % ,经SDF 1诱导下扩增 14d的CD34+ 细胞的总黏附性PF4组为 (138.31± 32 .39) % ,同期对照组为 (6 7.6 6± 12 .4 4 ) %。④PF4 10 0ng ml作用于CD34 + 细胞时 ,CD4 9d 表达增长 13.0 2 % ,CXCR4表达增长17 33%。结论　PF4可使新鲜及扩增后的脐血CD34+ 细胞黏附功能增强 ,并促进CD4 9d及CXCR4的表达 ,提示PF4可能有助于脐血干细胞的归巢。     

血小板第4因子在造血与血管新生中作用的研究进展

50多年前,Ｃｏｎｌｅｙ等发现患有血小板减少症的患者对肝素的敏感性异常增加,从而推测血小板可能释放出一种有中和肝素抗凝血活性的因子。Ｄｅｕｔｓｃｈ等部分纯化了这种血小板蛋白,命名为血小板第4因子(ｐｌａｔｅｌｅｔｆａｃｔｏｒ4,ＰＦ4)。现将ＰＦ4在造血与血管新生中作用的研究进展综述如下。1　ＰＦ4的理化特性　ＰＦ4在巨核细胞中合成,在α颗粒中包装,在血小板粘附、聚集等活化状态时以高分子量蛋白多糖ＰＦ4复合物的形式从血小板中释放,因此,ＰＦ4也可作为巨核细胞分化成熟以及血小板活化的一种标记物[1]。ＰＦ4基因位于4号染色…     

脾内免疫制备抗人血小板第4因子单克隆抗体和鉴定

目的制备抗人血小板第4因子单克隆抗体用于PF4的基础研究和临床血小板活化状态的评价。方法用常规和脾内免疫相结合的方法免疫Babl/c小鼠,经细胞融合和ELISA筛选后,进行单抗的特性和特异性研究。结果成功制备了一株抗人PF4单克隆抗体(SZ-95),ELISA显示上清和腹水效价分别为2×10     

Bcl-xL在原发性血小板增多症患者巨核细胞分化过程中的表达

原发性血小板增多症（ET）是一类造血系统慢性骨髓增生性疾病，其临床特点是外周血中血小板持续增高，同时骨髓中巨核细胞过度增生。ET的发病机制目前尚未完全明确。近来有学者发现体外诱导CD34^＋细胞分化得到的巨核细胞具有明显的凋亡特征，是巨核细胞成熟晚期的表现。有研究也显示了巨核细胞的凋亡特征，显示血小板的形成是巨核细胞成熟后的晚期表现。抗凋亡蛋白Bcl-xL属于Bcl-2蛋白家族，主要在造血细胞中表达，在调节造血干细胞的分化中具有重要功能。有人研究发现抗凋亡蛋白Bcl-xL，     

c-kit原癌基因及其配体干细胞因子的造血调控功能

c-kit原癌基因及干细胞因子(SCF)是一对受体及配体,相当于小鼠W/W~v和Sl/Sl~d的缺陷,二者对造血功能十分重要,c-kit受体表达于造血干/祖细胞,因此SCF能调节骨髓细胞,淋巴细胞及肥大细胞的生成,且与造血细胞粘附于骨髓基质有关,SCF且能动员干/祖细胞。c-kit受体及SCF与一些血液病的关系甚为密切,二者有临床应用前景,可能有助于基因治疗。     

转染血小板因子4基因或其片段在动物体内抑制多发性骨髓瘤的生长

本研究旨在观察血小板因子4cDNA全长或其17-70片段转染多发性骨髓瘤细胞株对其在动物体内生长的影响。构建含有人血小板因子4cDNA全长或17-70片段的慢病毒载体,转染、筛选并检测稳定表达转染基因蛋白的多发性骨髓瘤U266细胞株。用稳定表达转染基因蛋白的U266细胞建立多发性骨髓瘤联合免疫缺陷小鼠动物模型。每2周检测小鼠血清中人轻链蛋白的含量,每4周测量小鼠血清中人VEGF及PF4蛋白含量。并检测肿瘤的体积和肿瘤内血管密度以及小鼠的生存期。结果表明:成功筛选出稳定表达血小板因子4蛋白和其17-70肽段的多发性骨髓瘤细胞株。筛选后各组多发性骨髓瘤细胞上清液内VEGF含量之间有统计学差异(p0.01)。应用转染后多发性骨髓瘤细胞建立小鼠多发性骨髓瘤模型发现,和转染空载体组相比较,转染血小板因子4基因组小鼠血清中人VEGF及人轻链蛋白含量降低,在转染17-70片段组的降低更加明显(p0.05)。各组小鼠肿瘤平均体积及肿瘤组织内微血管密度之间有统计学差异(p0.05)。转染空载体组小鼠与其它两组小鼠之间生存期有统计学差异(p0.05)。转染血小板因子4小鼠与转染血小板因子4片段组小鼠之间生存期无统计学差异(p0.05)。结论:转染血小板因子4cDNA全长或其17-70片段的多发性骨髓瘤细胞在小鼠体内生长受到抑制,小鼠生存期延长。     

基质细胞衍生因子-1和血小板第4因子对体外扩增后脐血CD34+细胞黏附特性和趋化功能的影响

为了研究基质细胞衍生因子-1（SDF—1）和血小板第4因子（PF4）对扩增后脐血CD34^＋细胞归巢相关功能的影响，将纯化的脐血CD34^＋细胞接种入无血清培养液中，加入不同组合的细胞因子FST（FL＋SCF＋TPO）、FST＋SDF—1、FST＋PF4或FST＋SDF—1＋PF4，分别于培养第7、10、14天检测CD34^＋细胞扩增倍数、集落形成能力、细胞的黏附分子表达、总黏附性、趋化功能。结果表明：①加入SDF—1的实验组CD34^＋细胞及造血祖细胞集落扩增倍数高于对照组；②加入SDF—1明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e的表达，加入PF4明显上调扩增的CD34^＋细胞CD49e、CD54的表达，在扩增体系中加入SDF—1或PF4均能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的总黏附性；③在扩增体系中加入SDF—1能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的自发迁移率，但导致CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率降低；而PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞的CXCR-4的表达和SDF—1诱导迁移率；在扩增体系中同时加入SDF—1和PF4能够明显提高扩增的CD34^＋细胞自发迁移率和SDF—1诱导迁移率。结论：体外扩增体系中加入SDF—1和PF4能够上调部分归巢相关黏附分子的表达，保持扩增的CD34^＋细胞的黏附和迁移能力，有利于降低体外扩增对造血干／祖细胞（HSPC）归巢相关功能的不利影响，维持扩增的HSPC的归巢潜能。     

肝素／血小板因子4抗体与肝素诱导的血小板减少症

肝素诱导的血小板减少症（heparin—induced thrombocytopenia，HIT）是肝素治疗引起的严重并发症，可导致血栓形成和栓塞。HIT的发病机制主要与肝素／血小板因子4抗体介导的免疫反应有关，IgG类是主要的致病抗体，能与肝素和血小板因子4结合形成复合物，引起血小板凝集和凝血反应增强，同时抗体还通过作用于血管内皮细胞和单核细胞参与HIT的形成。抗体相关的实验室检测包括功能性血小板试验和免疫学试验，临床表现结合实验室检测有助于本病的早期诊断和治疗，但是在检测方面目前尚没有理想的方法。本文就AHPF4抗体、HIT发病机制、临床实验室检测和免疫学试验检测等问题进行了综述。     

脐血CD34＋细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究

本研究旨在通过检测脐血CD34＋细胞和正常人外周血单个核细胞（PBMNC）中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性。采用半定量RT—PCR检测脐血CD34＋细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点。结果发现,CD34＋细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNc不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129bp的C碱基发生甲基化。结论：HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一。HOXIM在CD34＋细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关。初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径。     

异基因造血干细胞移植CD34^＋CD61^＋巨核系前体细胞与血小板植入的相关分析

本研究通过定量测定G—CSF动员后外周血及骨髓采集物的CD34^＋CD61^＋细胞，以探索巨核前体细胞CD34^＋CD61^＋亚群输注量与异基因外周血和／或骨髓移植后血小板恢复时间的相关性。24例不同血液病患者接受HLA全相合同胞、非血缘供者或单倍体相合同胞造血干细胞移植。20例可评估的患者依移植方法不同分为HLA全相合组和单倍体相合组，HLA全相合组采用PBSC移植方案，单倍体相合组采用PBSC＋BM联合移植方案，对外周血干细胞和骨髓样本CD34^＋CD61^＋亚群通过流式细胞仪立即测定或隔夜保存后测定。结果表明，单倍体相合组输注CD34^＋、CD34^＋CD61^、CD34^-CD61^＋细胞数中位值分别为6．24×10^6／kg（1．53—20．48）、66．19×10^4／k（8．16—493．83）、34．38×10^6／kg（14．71—109．16）；HLA全相合组中位值分别为4．88×10^6／kg（1．00—8．24）、14．16×10^4／kg（11．63—96．87）和13．50×10^6／kg（1．74—35．61）。中性粒细胞计数（ANC）〉0．5×10^9／L和血小板计数〉20×10^9／L的中位时间，单倍体相合组分别为18．5（11．00—29．00）和16．5（9．00—35．00）天；HLA全相合组为14．5（9．00—24．00）和10．5（6．00—37．00）天，血小板的植入时间在两组差别无显著性，中性粒细胞植入时间在HLA全相合组和单倍体相合组差异有显著性（p=0．048），对于两组中CD34^＋细胞量〉2×10^6／kg的受者血小板的植入时间分析，两组差别有显著性（p=0．006）。CD34^＋CD61^＋亚群与血小板植入的相关性明显优越于CD34^＋细胞，可评估20例（r=-0．449p=0．047CD34^＋细胞群），单倍体相合组12例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．768p=0．004），HLA相同纽8例CD34^＋CD61^＋亚群（r=-0．747p=0．033），CD34^＋CD61^＋亚群与血小板的植入时间呈负相关关系，输注CD34^＋CD61^＋亚群细胞量大，血小板的植入时间缩短。结论     

人组织因子基因表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞系中的表达

本研究旨在克隆人组织因子 (TF)并研究其在稳定转染的人卵巢癌细胞系中的表达。采用分子克隆技术构建人TF真核表达载体 pcDNA3 TFcDNA ;应用脂质体介导的基因转移技术将其导入人卵巢癌细胞系A2 780内 ,采用G4 18筛选稳定表达的转染细胞 ,用流式细胞术和RT PCR进行TF表达水平的检测。结果显示 :①构建产物经基因测序证实为 pcDNA3 TFcDNA重组体 ;②稳定转染的A2 780细胞内TFmRNA水平显著增高 ,转染细胞为3.91± 0 .2 8,未转染细胞为 0 .97± 0 .2 3(P <0 .0 1) ;③转染细胞表面TF表达显著增高 ,转染细胞为 ( 4 8.5 6±9 5 3) % ,未转染细胞为 ( 2 .73± 1.15 ) % (P <0 .0 1)。结论 :成功地构建了TF真核表达载体并建立了稳定、高效表达TF的人卵巢癌细胞系A2 780 /TF ,为研究TF在肿瘤高凝状态、肿瘤生长与浸润转移中的作用及其机制 ,探索抑癌基因治疗新途径建立了实验基础。