microRNA-639调控舌鳞状细胞癌上皮间质转化的实验研究

目的探讨微小RNA(miR)-639对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞上皮-间质转化(EMT)的调控作用。方法应用TGF-β1刺激上皮型SCC9、CAL27细胞,诱导形成相对应的间质型细胞SCC9 TGF-β1、CAL27 TGF-β1。通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、Western blot检测EMT的标记物,通过芯片检测得到一组差异性表达的miRNA,通过实时荧光定量PCR验证芯片检测结果。选取发生EMT的TSCC细胞中低表达的miR-639为研究对象,通过脂质体介导分别将miR-639的反义核苷酸(miR-639 ASO)和miR-639的拟似物(miR-639mimics)转染上皮型和相对应的间质型细胞,采用实时荧光定量PCR检测转染前后两株细胞中miR-639的表达变化,通过Transwell实验检测各组细胞侵袭、迁移能力差异。两组间均数的比较采用Student′s t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果实验组miR-639的表达明显上调或下调,阴性对照组与空白对照组中miR-639的表达无明显变化。Transwell实验检测转染miR-639 ASO后上皮细胞的侵袭迁移能力显著升高(P<0.05),并且可以诱导细胞发生EMT;转染miR-639 mimics后诱导所形成的间质型TSCC细胞的侵袭迁移能力显著降低(P<0.05),同时可逆转EMT。结论miR-639 mimics对TGF-β1所诱导形成的的间质型TSCC细胞具有调控作用,转染miR-639 mimics可逆转EMT并能有效地抑制间质型细胞SCC9 TGF-β1的侵袭迁移能力。     

转化生长因子β1诱导人舌鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化及其顺铂耐药性研究

目的 利用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞CAL27、顺铂耐药细胞CAL27-res发生上皮-间质转化(EMT),建立TSCC细胞发生EMT的实验研究模型.研究EMT对TSCC细胞顺铂耐药性及细胞增殖、凋亡的影响.方法 10 ng/ml的TGF-β1处理CAL27、CAL27-res细胞8 d,观察细胞形态学变化,Western blot 和细胞免疫荧光验证EMT相关上皮标记蛋白及间质标记蛋白表达的变化,划痕试验检测细胞迁移能力的变化,MTT法检测细胞半抑制率(It50),免疫荧光检测MDR、MRP、Topo Ⅱβ的表达,流式细胞仪分析细胞周期及凋亡.结果 TGF-β1 可诱导CAL27、CAL27-res向间质细胞形态转化,并且下调上皮相关标记蛋白E-cadherin的表达,上调间质相关标记蛋白Vimentin的表达,细胞的迁移能力明显增强.IE50分别提高2.31倍(CAL27)和1.72倍(CAL27-res),MDR和MRP表达升高,Topo Ⅱβ表达降低.细胞增殖指数(PI)均明显降低(CAL27:χ2=16.799,P<0.001;CAL27-res:χ2=25.375,P<0.001),细胞凋亡指数(AI)均明显升高(CAL27:χ2=165.0797,P<0.001;CAL27-res:χ2=196.5640,P<0.001).结论 TGF-β1能够成功诱导CAL27、CAL27-res发生EMT并且明显增强细胞对顺铂的耐药性,同时抑制细胞增殖,促进凋亡.     

下调miR-21表达对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响

目的 :探讨下调miR-21表达对口腔鳞状细胞癌细胞增殖的影响及可能机制。方法 :体外培养SCC15和CAL27口腔鳞癌细胞,根据转染不同,分别将细胞分为miR-21抑制物组、miR-阴性对照物组和空白对照组。MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,检测不同转染组细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-21、β-catenin、C-myc和Dkk1表达,Western blot法检测细胞中β-catenin、C-myc和Dkk1蛋白表达。结果 :SCC15和CAL27细胞中,miR-21抑制物组细胞转染48 h和72 h时,细胞增殖活性均低于miR-阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);SCC15和CAL27细胞中,miR-21抑制物组细胞凋亡率均显著高于miR-阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);SCC15和CAL27细胞中,miR-21抑制物组细胞中miR-21、β-catenin基因和蛋白、C-myc基因和蛋白表达量均低于miR-阴性对照组和空白对照组,而Dkk1基因和蛋白表达量均高于miR-阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:下调miR-21可显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖,促使细胞发生凋亡,可能与促进Dkk1基因表达而抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-127-3p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移及Zwint-1基因表达的影响

目的 探讨miR-127-3p调控Zeste white 10(ZW10)相互作用着丝粒蛋白1(Zwint-1)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、迁移及侵袭的影响.方法 体外培养OSCC细胞系PE/CA-PJ15、CAL27,对其转染并分为空白对照组(NG组)、阴性转染组(NC组)、过表达miR-127-3p组(m...     

lncRNA CASC9通过调节miR-125a-3p/VEGF对口腔鳞癌CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探究长链非编码RNA癌症易感性候选基因9(lncRNA CASC9)对口腔鳞癌(OSCC)CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭的调控机制。方法:构建lncRNA CASC9敲低的CAL-27细胞,并在lncRNA CASC9敲低细胞系中进行microRNA-125a-3p(miR-125a-3p)的回复。检测细胞中lncRNA CASC9、miR-125a-3p和VEGF mRNA水平,检测细胞增殖、迁移及侵袭能力以及细胞中VEGF蛋白表达。结果:敲低lncRNA CASC9表达后,CAL-27细胞增殖活性、迁移与侵袭能力、VEGF mRNA和蛋白水平降低(P<0.05),miR-125a-3p水平升高(P<0.05)。敲低lncRNA CASC9可显著抑制细胞在体内移植瘤生长和血管生成(P<0.05)。下调miR-125a-3p表达可减弱lncRNA CASC9敲低对CAL-27细胞增殖、迁移和侵袭以及对体内移植瘤生长和血管生成的抑制作用(P<0.05)。结论:lncRNA CASC9可能通过调节miR-125a-3p/VEGF促进OSCC细胞增殖、迁移和侵...     

MiR-520b调控 Wnt/β-catenin信号通路促进舌鳞状细胞癌侵袭转移

目的研究miR-520b在舌鳞状细胞癌（TSCC）中的表达,探讨其在TSCC侵袭转移过程中的作用及分子机制。 方法实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测TSCC组织及细胞系中miR-520b的表达;沉默或过表达TSCC细胞株SCC-9和UM1中miR-520b的表达后,实时荧光定量PCR检测细胞上皮-间质转化（EMT）相关基因表达;Transwell小室验证细胞侵袭转移能力改变;TOP/FO双荧光素酶报告基因系统、实时荧光定量PCR、Western blot等检测miR-520b表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响;生物信息学、Western blot及双荧光素酶实验验证miR-520b调控Wnt/β-catenin信号通路的潜在靶基因Dickkopf 1（DKK1）。使用SPSS 21.0软件进行统计学分析,样本均数间比较采用Student′s t检验。 结果与正常相邻组织（2.59±1.43）相比,miR-520b相对表达量在TSCC组织中显著上调（5.28 ± 1.63）,差异有统计学意义（t = 16.04,P = 0.0005）,并且与患者中更具侵袭性的TSCC表型正相关（5.81 ± 0.74 vs. 3.08 ± 0.89,t = 12.11,P = 0.0011）;过表达miR-520b促进TSCC细胞侵袭转移（SCC-9：110.8 ± 17.8 vs. 74.7 ± 9.8,t_SCC-9 = 32.58,P_SCC-9 = 0.0011;UM1：178.8 ± 39.7 vs. 90.3 ± 22.5,t_UM1 = 99.67,P_UM1 = 0.0002）,低表达则相反（SCC-9：74.7 ± 9.8 vs. 30.9 ± 7.8,t_SCC-9 = -31.47,P_SCC-9 = 0.0024;UM1：90.3 ± 22.5 vs. 35.7 ± 10.6,t_UM1 = -37.89,P_UM1 = 0.0019）;此外,过表达miR-520b可靶向抑制DKK1,进而激活Wnt/β-catenin信号通路,促进TSCC细胞上皮-间质转化。 结论MiR-520b在TSCC中高表达,可能通过抑制DKK1增强Wnt/β-catenin信号通路,促进TSCC侵袭转移。     

miR-204-5p靶向溴结构域蛋白4对舌鳞状细胞癌细胞SCC25增殖和迁移侵袭的影响研究

目的 探讨miR-204-5p对溴结构域蛋白（BRD）4的靶向作用机制以及对舌鳞状细胞癌SCC25细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测舌鳞状细胞癌组织以及不同细胞株系间的miR-204-5p和BRD4 mRNA的表达水平;miR-204-5p转染SCC25细胞后,细胞计数试剂盒（CCK）8法检测其对细胞增殖的影响,Transwell小室法检测miR-204-5p对SCC25迁移和侵袭的影响;使用TargetScan和荧光素酶实验分析并验证miR-204-5p与BRD4的靶向调控关系;RT-qPCR和Western blot检测miR-204-5p模拟物和抑制剂对BRD4表达水平的影响;Transwell小室法和CCK8法检测miR-204-5p调控BRD4对SCC25增殖和迁移侵袭的影响。结果 miR-204-5p在舌鳞状细胞癌组织和SCC25细胞中表达下调,BRD4在舌鳞状细胞癌组织和SCC25细胞中表达上调;提高miR-204-5p表达量抑制SCC25细胞的增殖、迁移和侵袭;TargetScan和荧光素酶实验证实miR-204-5p与BRD4具有靶向负调控关系;miR-204-5p模拟物抑制BRD4表达,miR-204-5p抑制剂促进BRD4表达上调;当在SCC25细胞中同时过表达miR-204-5p和BRD4时,BRD4能够回补miR-204-5p对SCC25细胞的抑制作用。结论 miR-204-5p能够通过靶向负调控BRD4抑制舌鳞状细胞癌SCC25细胞的增殖、迁移和侵袭。     

POLD1对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭的影响及调控机制

目的： 探讨人源DNA 聚合酶δ催化亚基（POLD1）的表达对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期的影响及其相关机制。方法： 使用生物信息数据分析POLD1在头颈部鳞癌及癌旁组织中的表达,利用免疫组织化学染色检测POLD1在40对口腔鳞癌及癌旁组织中的表达。慢病毒感染SCC9及CAL27细胞系,蛋白免疫印迹检测POLD1在稳转细胞系中的表达。CCK-8实验和EdU实验检测细胞增殖能力,划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。流式细胞周期实验检测POLD1对细胞周期的影响。蛋白免疫印迹法研究POLD1影响细胞周期的相关通路。采用SPSS 21.0软件包和GraphPad Prism 进行数据分析和绘图。结果： POLD1在头颈部鳞癌及40对OSCC组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.001);慢病毒感染SCC9及CAL27细胞系后,POLD1的表达显著下降,且在细胞核及细胞质中的表达降低。实验组SCC9及CAL27细胞的增殖、迁移、侵袭能力下降。流式细胞周期实验检测到实验组细胞在G2/M期阻滞,G1期缩短。蛋白免疫印迹结果： 显示,实验组P-Cdc2(Tyr15)、P-Rb(Ser807)表达显著升高。结论： 敲低POLD1的表达可抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭。     

c-fos调控p16/CyclinD1信号途径并促进口腔鳞状细胞癌增殖和迁移

目的:探讨c-fos对口腔鳞状细胞癌增殖和迁移的影响及作用机制.方法:免疫组化法分别检测口腔鳞状细胞癌组织标本和正常口腔黏膜组织标本(n=60)中的CyclinD1、p16和c-fos.根据不同处理将HN6和SCC9细胞分为空白对照组、siRNA-scramble组、siRNA-c-fos组.检测各组细胞中CyclinD1和p16 mRNA和蛋白表达量的变化,以及细胞增殖和迁移能力的变化.结果:与正常组比较,病例组中c-fos和CyclinD1表达增加,p16表达降低;与空白对照组相比,siRNA-c-fos组HN6和SCC9细胞中CyclinD1表达显著降低,p16表达明显上升,细胞的增殖能力和迁移能力都显著下降.结论:c-fos可以通过p16/CyclinD1信号途径增强口腔鳞状细胞癌增殖和迁移.     

miR-181a抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化及化疗耐药机制的研究

目的:探讨miR-181a调控上皮-间充质转化(EMT)促进舌鳞状细胞癌细胞顺铂耐药的机制。方法:分别在CAL27/CDDP、CAL27中转染miR-181a mimics、miR-181a LNA,免疫印迹及免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin的表达;免疫印迹检测Twist1、Slug的表达;Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力;MTT法检测细胞对顺铂的半抑制率。利用生物信息学方法:预测Twist1可能为miR-181a的靶基因。构建包含Twist1结合序列片段的荧光素酶报告基因质粒,进行双荧光素酶报告基因实验。采用SPSS17.0软件包对结果进行单因素方差分析。结果:转染miR-181a mimics可逆转CAL27/CDDP的EMT表型,E-cadherin表达增强,Vimentin、Twist1及Slug表达降低,细胞的侵袭、迁移能力显著降低,IC₅₀下降47.57%±6.23%（P<0.05）。转染miR-181a LNA可诱导CAL27细胞发生EMT,E-cadherin表达降低,Vimentin、Twist1及Slug表达增强,细胞侵袭、迁移能力显著增强,IC₅₀升高55.61%±7.20%（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,Twist1是miR-181a的靶基因。结论:miR-181a靶向调控Twist1,从而抑制舌鳞癌细胞上皮-间充质转化与顺铂耐药。     

低氧激活HIF-1α诱导舌鳞癌细胞上皮-间质转化

目的：探讨低氧微环境诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化以及HIF-1α在该过程中的作用。方法 体外常氧（20% O₂）或低氧（1% O₂）状态下培养舌鳞癌SCC9、CAL27细胞48 h,Western免疫印迹和实时定量PCR检测上皮间质标记蛋白vimentin、fibronectin和E-cadherin的表达变化和HIF-1α的表达水平,Transwell小室检测细胞的迁移能力。通过小干扰RNA（HIF-1α-Si）转染舌鳞癌细胞,检测HIF-1α、vimentin、fibronectin与E-cadherin蛋白表达以及细胞迁移能力的变化。应用SPSS13.0软件包对数据进行独立样本t检验。结果 人舌鳞癌细胞SCC9、CAL27在低氧环境中培养48 h后,间质标志蛋白vimentin和fibronectin在蛋白和mRNA水平均显著升高,上皮标志蛋白E-cadherin表达降低,HIF-1α表达上调,细胞迁移能力显著增强。小干扰RNA（siRNA）转染舌鳞癌细胞SCC9、CAL27并于低氧下培养后,HIF-1α表达显著降低,vimentin和fibronectin表达也显著降低,E-cadherin表达升高,细胞迁移能力显著下降。结论 低氧通过上调HIF-1α表达而促进人舌鳞癌细胞发生上皮-间质转化及转移。     

lncRNA-HOTTIP在低氧诱导舌鳞癌细胞上皮-间质转化过程中的作用探讨

目的 探讨lncRNA-HOTTIP在低氧诱导人舌鳞癌细胞上皮-间质转化过程中的作用。方法 体外正常氧（20% O₂）或低氧（1% O₂）状态下培养舌鳞癌SCC9、CAL27细胞48 h,实时定量PCR检测lncRNA-HOTTIP与HIF-1α的表达水平;通过小干扰RNA（Si-HIF1α）转染舌鳞癌细胞,检测HIF-1α敲低后lncRNA-HOTTIP的表达变化;进一步通过小干扰RNA（Si-HOTTIP）转染舌鳞癌细胞,验证敲低lncRNA-HOTTIP后E-cadherin、Fibronectin与Vimentin的蛋白和mRNA水平,以及细胞迁移能力的变化。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 人舌鳞癌细胞SCC9、CAL27在低氧培养48 h后,lncRNA-HOTTIP与HIF-1α均显著升高;Si-HIF1α转染SCC9、CAL27并于低氧培养后,HIF-1α水平显著降低,lncRNA-HOTTIP表达下降。Si-HOTTIP转染SCC9、CAL27并在低氧培养后,lncRNA-HOTTIP水平降低,间质标志蛋白Vimentin和Fibronectin在蛋白和mRNA水平显著降低,上皮标志蛋白E-cadherin表达升高,细胞迁移能力显著降低。结论 低氧可通过上调HIF-1α并激活lncRNA-HOTTIP表达,进而促进人舌鳞癌细胞发生上皮-间质转化及转移。     

人舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞发生上皮-间质转化的研究

目的初步探讨人舌鳞状细胞癌（TSCC）化疗耐药与上皮．间质转化（EMT）的关系。方法以人舌鳞状细胞癌细胞、SCCl5及其顺铂耐药细胞株CAL27／CDDP、SCCl5／CDDP为研究对象。MTY检测两组亲本细胞及耐药细胞的半抑制率（IC50）,显微镜下观察两组亲本细胞及耐药细胞的形态．免疫荧光和Westonblot检测EMT相关分子标记蛋白E-cadherin和Vimentin的表达,Westonblot检测EMT转录因子Twistl和Slug的表达,Transwell及划痕实验检测细胞的侵袭迁移能力,结果采用单因素方差分析。结果CAL27／CDDP较CAL27IC。提高7．5倍（X^2=13．8043。P〈0．01）,SCCl5／CDDP较SCCl5IC50提高8．3倍（X^2=10．464,P〈0．01）。CAL27和SCCl5均为上皮细胞形态,CAL27／CDDP和SCCl5／CDDP呈间质细胞形态．且两组耐药细胞上皮标记蛋白E-cadherin表达下调．间质标记蛋白Vimentin表达上调,EMT转录因子Twistl、Slug表达上调,细胞的侵袭迁移能力明显增强。结论顺铂能成功诱导人舌鳞癌细胞发生EMT。     

CCR7-CCL21 axis promotes the cervical lymph node metastasis of tongue squamous cell carcinoma by up-regulating MUC1

This study aims at investigating the potential role of MUC1 in CCR7-CCL21 axis-induced metastasis of tongue squamous cell carcinoma (TSCC).TSCC patients were selected for epidemiologic trends. The expression of CCR7 and MUC1 was detected via immunohistochemistry. SCC15 and CAL27 cells were induced by CCL21 and specific antibody to CCR7. Gene and protein expression was detected using qRT-PCR and western blotting. Migration and invasion capacities of TSCC cells were determined using wound healing and Transwell invasion assays.The male:female ratio of 78 patients was 1.6:1. Metastasis rate of cervical lymph nodes (CLNs) was 42.3%. CLN metastasis significantly correlated with T staging (P = 0.026), clinical staging (P = 0.024), and depth of invasion (DOI, P = 0.001). DOI significantly influenced CLN metastasis (P = 0.033, OR = 10.919) of TSCC, as did CCR7 (P = 0.041) and MUC1 (P = 0.026). The consistency of CCR7 and MUC1 expression was fairly good (Kappa = 0.683, P < 0.001). Reduced survival was significantly associated with higher expression of CCR7 (P = 0.039) and MUC1 (P = 0.030). CCL21 up-regulated MUC1 in SCC15 cells, which was inhibited when CCR7 was blocked. MUC1 positively correlated with TSCC cell migration and invasion.CCR7-CCL21 axis might promote CLN metastasis of TSCC by up-regulating MUC1. CCR7 and MUC1 show promise as potential biomarkers for TSCC treatment.     

体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶对人舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 通过小干扰RNA(siRNA)干扰技术体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(Icmt)基因,探讨体外沉默Icmt对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞增殖和凋亡能力的影响.方法 针对人Icmt基因序列设计并构建3条siRNA,经脂质体瞬时转染技术转染抑制TSCC细胞系CAL-27和SCC-4细胞Icmt表达,同时设置...     

DZIP1通过影响Wnt/β-catenin信号通路促进口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭

目的 探究DZIP1通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响.方法 实时荧光定量PCR和Western blot检测DZIP1和Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达,CCK-8检测细胞活力,克隆形成实验检测口腔鳞状细胞癌(oral squamous cel...     

性别决定区Y框蛋白9诱导人口腔鳞状细胞癌CAL27微管形成和上皮间质转化的机制初探

目的 探究性别决定区Y框蛋白9(SOX9)对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)CAL27微管形成和上皮间质转化的影响及其作用机制.方法 设计合成SOX9-shRNA1和SOX9-shRNA2,将SOX9-shRNA1和SOX9-shR-NA2转染到CAL27细胞中,实时荧光定量聚合酶链反应检测SOX9的表达水平;微管形成实验...