miR-21负向调控宫颈癌HeLa细胞株中hTERT的表达

目的 通过观察在miR-21作用下hTERT的表达情况,探讨在宫颈癌HeLa细胞中miR-21对hTERT的调控作用.方法 利用RT-PCR法及West Blot法分别检测HeLa中miR-21的表达,以及hTERT蛋白的表达情况;通过实验设计,生成miR-21模拟物和miR-21抑制剂,并分别设立两组的空白对照序列;...     

miR-21与宫颈癌关系的研究进展

宫颈癌是危害全世界妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,它的发生与高危型HPV感染有关,但基因易感性也起了重要作用。尽管宫颈癌的筛查和HPV疫苗的应用使得宫颈癌在发达地区的发病率下降,但是在落后地区的发病率未见明显降低、总生存率无明显提高。当前miRNAs已成为肿瘤领域研究的热点,miRNA的异常表达在肿瘤的发生、发展、诊断、治疗、预后等方面发挥重要作用。miRNA-21（miR-21）作为较早发现的人类miRNAs之一,在多种肿瘤的发生和发展中扮演着致癌基因的角色。本文就miR-21与宫颈癌的关系进展作一综述。     

miR-21对宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性的影响

目的：探讨miR-21与宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性之间的关系,阐明miR-21对细胞凋亡和自噬改变的可能作用机制。方法：人宫颈癌HeLa细胞分为假照组和4 Gy照射组,分别转染miR-21 NC（阴性对照）、miR-21 mimics、miR-21 inhibitor NC和miR-21 inhibitor。实时荧光定量PCR检测照射前和照射后miR-21的表达水平;集落形成实验观察miR-21对HeLa细胞辐射敏感性的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和自噬细胞百分率;采用生物信息学方法预测miR-21的靶基因;荧光素酶报告基因分析验证miR-21与靶基因3′UTR的结合;Western blotting法检测相关蛋白beclin1表达水平。结果：与假照组比较,4 Gy照射组miR-21表达水平明显增加(P<0.05）;集落形成实验,与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 inhihitor NC组比较,miR-21 inhibitor 组HeLa细胞辐射敏感性无明显变化(P>0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组HeLa细胞凋亡率明显增加(P<0.05）;与miR-21 inhibitor NC组比较,miR-21 inhibitor组HeLa细胞凋亡率明显减少（P<0.05）。与miR-21 NC组比较,miR-21 mimics组自噬率升高（P<0.05）。与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组自噬率升高（P<0.05）;与miR-21 NC+4 Gy组比较,miR-21 mimics+4 Gy组beclin1蛋白表达水平增加（P<0.05）。
结论：发现了miR-21新的靶基因beclin1。过表达miR-21促进辐射诱导的凋亡和自噬,但对于宫颈癌HeLa细胞辐射敏感性无直接影响。
［关键词］ miR-21;宫颈肿瘤;HeLa细胞;辐射敏感性;细胞凋亡;自噬     

miR-429对CRKL表达的靶向调控作用研究

目的 探讨miR-429对CRKL的靶向调控作用.方法 构建双荧光素野生型psiCHECK-2-CRKL-3'-UTR-WT及突变型psiCHECK-2-CRKL-3'-UTR-MUT重组表达载体,双荧光素酶报告实验检测miR-429与CRKL-3'-UTR的靶向结合;瞬时转染miR-429模拟物及其抑制剂,qRT-PCR和Westernblot检测miR-429对内源性CRKL表达水平变化的影响;qRT-PCR检测CRKL上、下调对内源性miR-429表达水平变化的影响.结果 双荧光素报告实验结果表明miR-429直接靶向CRKL-3'-UTR第2个结合位点;同时与HepG2-miR-NC相比,miR-429上调使内源性CRKL蛋白下调了(55.0±1.5)％(P =0.0089),与HepG2-LNA-miR-429相比,miR-429下调使内源性CRKL蛋白上调了(44.3±1.0)％(P =0.0038),差异具有统计学意义,而miR-429上、下调对内源性CRKL mRNA表达变化无影响;且与HepG2-shNC相比,CRKL下调使内源性miR-429表达上调了(102.8±20.0)％(P =0.0069),与HepG2-PCDH相比,CRKL上调使内源性miR-429表达下调了(92.4±3.2)％(P =0.0009),差异具有统计学意义.结论 miR-429靶向作用于CRKL-3'-UTR在转录后蛋白翻译水平负性调控CRKL表达,同时CRKL负性调控内源性miR-429的表达.     

miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宫颈组织、宫颈癌组织及Hela细胞中的表达差异

目的研究miR-21、miR-126、miR-143和miR-373在正常宫颈组织、宫颈癌组织及Hela细胞中的表达差异,探讨microRNAs(miRNAs)对宫颈癌发生的调控作用。方法荧光实时定量检测20例良性肿瘤患者的正常宫颈组织,20例宫颈癌组织及Hela细胞中miR-21、miR-126、miR-143和miR-373的表达。结果 miR-21在宫颈癌组织及Hela细胞系中高表达,在正常宫颈标本中低表达,在宫颈癌组织中相对定量为正常宫颈组织的11.3196倍(P<0.05);miR-143、miR-373在宫颈癌组织及Hela细胞中均低表达,在正常宫颈标本中高表达,miR-143、miR-373在宫颈癌组织中相对定量分别为正常宫颈组织的0.1553倍和0.4907倍(P<0.05);miR-126的表达无明显变化。结论 miRNAs与宫颈癌的发生和调控密切相关。在宫颈癌组织和Hela细胞中,miR-21表达上调,可能在宫颈癌的发生过程中发挥癌基因的作用;miR-143、miR-373表达下调可能发挥抑癌基因的作用;miR-126表达无差异,与宫颈癌无明显关系。     

微小RNA-21对宫颈癌HeLa细胞程序性细胞死亡4蛋白表达及细胞增殖的影响

［摘要］目的: 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌HeLa细胞中程序性细胞死亡4(programmed cell death, PDCD4)基因表达及细胞增殖的影响,为应用miR-21对宫颈癌进行基因治疗提供一定的依据。方法: 用脂质体转染的方法,将pre-miR-21、pre-miR-21阴性对照、anti-miR-21、anti-miR-21阴性对照瞬时转染HeLa细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-21相对表达量;MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化;蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达情况;荧光素酶报告基因法验证miR-21的靶位点。 结果: pre-miR-21上调miR-21的表达,抑制PDCD4蛋白表达,促进HeLa细胞增殖;而anti-miR-21下调miR-21的表达,增加PDCD4蛋白的表达,抑制HeLa细胞增殖。pMIR-Luc-PDCD4-3′UTR与pre-miR-21共转染后,荧光素酶活性下降,而与anti-miR-21共转染后,荧光素酶活性升高。 结论: PDCD4基因是miR-21的靶基因;miR-21通过调节PDCD4基因的表达调控细胞增殖。     

初发和复发膀胱尿路上皮癌中miR-21和miR-205的表达

目的检测microRNA-21(miR-21)与microRNA-205(miR-205)在初、复发膀胱尿路上皮癌中的表达情况,探讨microRNAs(miRNAs)在膀胱尿路上皮癌中的表达意义及是否与肌层浸润有关。方法采用基于2-△△CT的实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测40例初、复发癌组织miR-21及miR-205的表达情况。结果与初发癌相比,复发癌miR-21表达上调(P<0.05),miR-205表达下调(P<0.05);与非肌层浸润性癌相比,肌层浸润性癌miR-21表达上调(P<0.05),miR-205表达下调(P<0.05);肌层浸润性癌miR-21与miR-205表达量的比值5倍于其在非肌层浸润性癌中表达量的比值。结论 miR-21高表达、miR-205低表达可能参与膀胱尿路上皮癌复发并与肌层浸润有关。     

长链非编码RNA GAS5靶向调控miR-424表达抑制宫颈癌HeLa细胞增殖

目的探讨长链非编码RNA GAS5(lncRNA GAS5)调控miR-424抑制宫颈癌细胞增殖的机制。方法预测筛选靶向GAS5的miRNA,用双荧光素酶法检测其荧光素酶活性。分析宫颈癌组织和正常宫颈组织GAS5和miR-424 mRNA水平,及其与患者临床病理特征的关系。检测Ect1/E6E7细胞和HeLa细胞GAS5和miR-424 mRNA水平。将miR-NC、GAS5 RNAi和pCDNA3.0-HA-GAS5质粒转染到HeLa细胞,MTT法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,Western blotting法检测细胞Dnmts、EZH2和Akt3蛋白表达水平。 结果miR-424-mimic可明显降低GAS5-WT荧光素酶活性(P＜0.05),表明GAS5与miR-424存在靶向调节作用。宫颈癌组织GAS5、miR-424 mRNA表达低于正常宫颈组织(P＜0.05);是否转移、不同FIGO分型患者间GAS5和miR-424表达存在差异(P＜0.05)。HeLa细胞GAS5和miR-424 mRNA表达低于Ect1/E6E7细胞(P＜0.05)。与阴性对照组比较,HeLa细胞GAS5、miR-424 mRNA、细胞凋亡率、Dnmts和EZH2表达GAS5 RNAi组降低,GAS5质粒组增加;细胞增殖率和Akt3表达GAS5 RNAi组增加,GAS5质粒组降低(P＜0.05)。 结论lncRNA GAS5通过靶向调控miR-424的表达抑制宫颈癌HeLa细胞增殖。     

上调microRNA-205表达对HeLa细胞生物学特性的影响

【目的】探讨上调microRNA-205（miR-205）表达对HeLa细胞生物学特性的影响。【方法】实验分4组：miR-205上调组,阴性对照组,空白转染组和空白对照组。每种检测重复3次。利用脂质体siPORT NeoFX Transfection Agent,向miR-205上调组细胞转染Pre-miR-hsa-miR-205 miRNA Precursor,阴性对照组细胞转染Cy3 dye labeled PremiR Negative Control。荧光显微镜下评估转染情况,实时定量PCR方法检测miR-205表达,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和平板克隆形成实验分别检测细胞生长和增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布,Transwell小室法检测细胞迁移能力。【结果】实时定量PCR结果显示,miR-205上调组miR-205的表达增加3061.5倍。与空白对照组相比,72hmiR-205上调组与阴性对照组活细胞数分别为（126&#177;41）%,（126&#177;39）%;两组克隆形成率分别为（79&#177;11）%,（63&#177;10）%;凋亡率分别为（4.6&#177;2.1）%,（4.1&#177;2.4）%;S期细胞比例分别为（19.2&#177;3.6）%,（23.4&#177;3.0）%;200倍镜视野下迁移细胞数分别为63&#177;17和68&#177;16。与对照组比,miR-205上调组细胞增殖能力增强但生长曲线不受影响,S期细胞比例降低,而凋亡率不变,细胞迁移能力无明显改变。【结论】上调miR-205表达后,HeLa细胞增殖能力及细胞周期改变,但生长曲线、凋亡率和迁移能力无变化。     

放疗耐受的宫颈癌Hela细胞的生物学特性

 【目的】研究耐放疗的宫颈癌Hela细胞生物学特性的改变,并探讨其与宫颈癌肿瘤干细胞间的关系。【方法】采用多次分割剂量照射技术建立宫颈癌Hela细胞的耐放疗模型（Hela-R）,实验分4组：Hela-R1组,Hela-R2组,Hela-R3组和对照组。四甲基偶氮唑蓝法检测细胞生长情况,克隆形成实验测定放射敏感性和克隆能力,流式细胞术检测细胞周期分布和增殖能力,球囊培养法检测细胞自我更新能力。【结果】Hela、Hela-R细胞接受照射后均呈现先加速增殖后出现生长抑制的现象。Hela-R1、Hela-R2、Hela-R3的细胞倍增时间分别为（43.4±1.0）h、（49.2±2.0）h和（48.7±3.3）h,克隆形成率分别为（20.3±4.0）%、（49.3±11.6）%和（6.3±5.9）%,S期细胞比例分别为（9.9±0.4）%、（13.0±0.9）%和（9.6±0.7）%,增殖指数（PI）分别为（27.3±2.6）%、（31.8±4.9）%和（37.4±8.0）%。与对照组比较,Hela-R3组的放射抗拒性增强。非粘附性球囊培养法培养Hela及Hela-R细胞可得到肿瘤细胞球,四组的球囊形成率分别为（9.9±0.4）%、（13.0±0.9）%、（9.6±0.7）%和（5.0±0.3）%。【结论】多次分割剂量照射可在体外建立宫颈癌Hela细胞的耐放疗模型,并可富集肿瘤干细胞;多次分割照射后,Hela细胞生长速度减慢,增殖能力有升高趋势,自我更新能力、克隆能力增强,细胞周期无明显变化。     

miR-192负性调控人肝癌细胞株HepG2中RB1基因的表达

目的 探讨miR-192对人肝癌细胞株HepG2中RB1基因表达的调节作用.方法 运用生物信息学方法对miR-192进行靶基因预测并分析其潜在靶基因RB1;将含有miR-192结合位点的RB1 mRNA 3′端非编码区(3′UTR)片段和在miR-192结合位点进行突变的RB1 3′UTR突变片段克隆至报告基因载体pMIR-Report luciferase vector,重组质粒分别命名为pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut;将重组质粒、Beta-gal内参质粒和microRNA共转染HepG2细胞,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达;SYBR Green荧光定量PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测miR-192对内源性RB1表达的调节作用.结果 生物信息学分析筛选出89个miR-192的潜在靶基因,RB1基因是其中之一;测序验证重组质粒pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut构建成功;过表达miR-192时,共转染pMIR-RB1质粒的细胞相对荧光素酶活性(4.80±0.36)较相应过表达miR-NC组(7.90±0.91)明显降低(P＜0.05),而共转染pMIR-Luc或pMIR-RB1-mut质粒的细胞相对荧光素酶活性[pMIR-Luc:(7.68±1.04);pMIR-RB1-mut:(7.56±0.99)]较相应过表达miR-NC组[pMIR-Luc:(7.86±0.73);pMIR-RB1-mut:(7.82±1.05)]无显著差异;上调miR-192水平显著降低HepG2细胞中内源性RB1 mRNA[(0.56±0.10)vs (1.05±0.13)]和蛋白(47% vs 100%)的表达.结论 RB1基因是miR-192的一个靶基因,在HepG2细胞中,miR-192通过直接结合RB1 mRNA 3′UTR而负性调控RB1基因表达.     

基因Caveolin-1转染对宫颈癌Hela细胞系增殖能力的影响

目的 探讨基因caveolin-1（CAV1）转染对模拟CO2气腹后宫颈癌Hela细胞生长增殖的影响。方法 筛选出稳定高表达caveolin-1的克隆后,实时荧光定量PCR鉴定。通过脂质体法将含有全长构建caveolin-1 cDNA真核表达载体转染宫颈癌Hela细胞系,采用流式细胞仪检测细胞周期,MTT法、细胞集落形成实验检测Hela细胞系增值能力变化。结果：转染成功的Hela细胞系caveolin-1基因及蛋白表达明显上升,高表达caveolin-1使细胞阻滞在G0/G1期,增殖指数降低。与对照组相比,转染成功的Hela细胞系增值能力降低,细胞集落形成率降低。结论 过表达caveolin-1基因能够抑制宫颈癌Hela细胞的增值能力。     

以Celecoxib为基础的联合方案对宫颈癌细胞抑制作用的研究

目的:探讨环氧化酶-2(cox-2)抑制剂Celecoxib与化疗药顺铂(DDP)联合应用对人宫颈癌Hela细胞的作用及机制。方法:用免疫细胞化学SP法检测Hela细胞cox-2蛋白表达后,将Celecoxib、DDP单独或联合处理Hela细胞,用MTT法检测细胞增殖的抑制率,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。结果:Celecoxib可下调Hela细胞cox-2蛋白表达,抑制其增殖作用呈浓度和时间依赖性。在一定浓度范围内DDP也抑制Hela细胞生长,作用呈量效关系。Celecoxib与DDP联合应用后抗增殖作用较单一用药显著增强(P<0.05),DDP浓度≥1 mg/L时两者有协同或相加作用。Celecoxib及DDP均可有效诱导Hela细胞凋亡,联用凋亡率明显增加并出现G0-G1期细胞阻滞。结论:Celecoxib与DDP联用可通过抑制增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞对Hela细胞有协同抗肿瘤效应,提示两者联合可能在宫颈癌临床治疗上具有潜在价值。     

hTERT反义寡核苷酸对宫颈癌Hela细胞体外增殖的影响

目的观察人类端粒酶催化亚基(hTERT)反义寡核苷酸(ASODN)对Hela细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ASODN对Hela细胞增值能力及细胞生长的影响，用流式细胞仪检测细胞周期和细胞增殖指数。结果不同浓度的ASODN转染细胞后，均不同程度地影响细胞的生长。ASODN作用细胞后，使细胞周期发生变化，表现为G0／G1期细胞增多，S期细胞减少，细胞增殖指数下降。结论以hTERT基因为靶点的反义寡核苷酸能抑制Hela细胞的体外生长，使细胞阻滞于G0／G1期。     

小檗碱对宫颈癌Hela细胞Caspase-3基因表达的影响

目的:研究小檗碱(berberine)对人宫颈癌Hela细胞体外增殖、凋亡及凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。方法:MTT法测定不同浓度(0～40μmol/L)berberine干预Hela细胞后的凋亡率;RT-PCR检测Caspase-3mR-NA表达水平。结果:berberine呈剂量-时间依赖方式抑制Hela细胞的生长(P<0.01);且随着berberine浓度增高,细胞凋亡增加,Caspase-3mRNA表达上调(P<0.001)。结论:berberine抑制人宫颈癌Hela细胞生长、诱导凋亡的机制可能与上调Caspase-3mRNA表达有关。     

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。