不同产地桔梗药材中总皂苷及桔梗皂苷D的含量比较

目的:比较不同产地桔梗中总皂苷及桔梗皂苷D的含量差异,为该药材的质量控制与生产提供参考。方法:采用2005年版《中国药典》方法测定桔梗总皂苷含量,2010年版《中国药典》方法测定桔梗皂苷D的含量,对36批桔梗药材总皂苷及桔梗皂苷D含量进行测定。结果:赤峰产区10批样品总皂苷质量分数在5.02%~9.20%,桔梗皂苷D质量分数在0.1%~0.175%,二者含量分布较窄。其他产区桔梗药材含量分布较宽,与内蒙古桔梗药材品质存在较大差异。结论:各产地桔梗的质量总体较好,但不同产地间及同产地各桔梗样品间的质量及其稳定性存在较大差异,浙江产桔梗的桔梗皂苷D和总皂苷含量均较高,而赤峰产桔梗品质稳定性较好;从整体质量评价角度看,桔梗质量标准中宜增加总皂苷含量的限量规定。     

不同产地桔梗药材中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的测定

目的建立测定桔梗Platycodon grandiflorum中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的测定方法,并准确测定我国不同产地桔梗药材中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的量。方法采用超声波甲醇提取法,称重法测定桔梗总皂苷量;采用HPLC法测定桔梗皂苷D量,色谱条件:Waters Symmetry-C18色谱柱,流动相为乙腈-水(22∶78),体积流量1.0 m L/min,检测波长为210 nm,柱温为30℃。结果不同产地的桔梗药材中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D量差别较大。在所测的桔梗药材中,浙江产桔梗总皂苷量最高,为12.03%;黑龙江、辽宁、安徽、山东、江西产桔梗总皂苷量均高于《中国药典》2005年版规定的6%;而其余各省的量均低于6%,最低的为河南,其量仅为1.57%。对于桔梗皂苷D来说,云南产桔梗的量最高,为0.654%;河北产桔梗的量最低,为0.017%。结论建立的方法操作简便,测定结果准确可靠,可用于桔梗药材中桔梗总皂苷和桔梗皂苷D量的测定。在我国不同产地桔梗药材中,桔梗总皂苷和桔梗皂苷D的量存在差异。同一药材中桔梗总皂苷与桔梗皂苷D的量,未显示出相关性。     

桔梗中总皂苷的含量测定

目的．探讨一种较为简便的方法对不同产地与年限的桔梗药材中总皂苷含量进行测定，为桔梗的质量控制提供依据。方法：以桔梗皂苷D为指标性成分，采用超声提取一香草醛比色法。结果：吉林产桔梗中总皂苷含量最高；不同采集时期以春季采收的桔梗中总皂苷含量为高；平均加样回收率为99．22％，RSD=1．8％。结论．此方法简便、快速、准确，便于对桔梗药材进行质量评价。     

桔梗中总皂苷的含量测定

目的:探讨一种较为简便的方法对不同产地与年限的桔梗药材中总皂苷含量进行测定,为桔梗的质量控制提供依据。方法:以桔梗皂苷D为指标性成分,采用超声提取—香草醛比色法。结果:吉林产桔梗中总皂苷含量最高;不同采集时期以春季采收的桔梗中总皂苷含量为高;平均加样回收率为99.22%,RSD=1.8%。结论:此方法简便、快速、准确,便于对桔梗药材进行质量评价。     

生态因子对人参皂苷合成及其关键酶基因表达的影响

目的研究生态因子和人参皂苷合成关键酶表达对人参皂苷合成、积累的影响。方法以人工栽培的4年生人参为研究对象,用实时荧光定量PCR法对在不同生长时期根组织中8个关键酶基因(HMGR、FPS、SS、SE、DS、β-AS、CYP82D47、CYP716A47)表达量进行测定;采用HPLC法测定根中8种单体皂苷(人参皂苷Rg_1、Re、Rf、Rb_1、Rb_2、Rb_3、Rc、Rd)的量;以小型气象站对人参样地气象数据进行采集;采用SPSS软件进行相关性分析。结果人参皂苷合成关键酶基因在人参皂苷积累的重要时期(开花期至果熟期)的表达高于果后参根生长期和枯萎期,人参皂苷合成关键酶基因的表达相互影响,协同增减,人参根组织中关键酶基因的表达对人参皂苷积累多表现出了正相关关系;人参根中人参皂苷Rg_1、Rb_1、Re、Rc量较高,8种单体皂苷量动态变化趋势并不相同;温度、光合有效辐射、土壤水势是影响根部人参皂苷合成的重要生态因子,温度与人参皂苷Rb_1、Rd显著负相关(P0.05),光合有效辐射对人参皂苷Rg_1的生成有显著的促进作用(P0.05),土壤水势与人参皂苷Rb_1显著负相关(P0.05);灰色关联度分析结果表明温度、光合有效辐射、相对湿度是影响人参皂苷量的主导生态因子,人参皂苷合成关键酶基因的表达是次要因子,在生态因子主导下人参皂苷合成关键酶基因调控人参皂苷的合成与积累。生态因子与关键酶基因的表达共同调控了人参皂苷的合成,对人参皂苷的积累有重要影响。结论明确了人参皂苷合成关键酶基因表达和人参皂苷量在人参中的动态变化,为人参皂苷合成生理生态机制的明晰及对人参药材质量的调控提供了理论依据。     

桔梗总皂苷含量测定方法研究

目的 建立一种香草醛-硫酸比色法测定桔梗中总皂苷含量的方法,为桔梗的质量控制提供科学依据.方法 索氏提取器提取,大孔吸附树脂纯化,香草醛-硫酸比色法测定桔梗总皂苷含量.结果 比色法测定的线性方程为A=0.003 4C+0.006 4,相关系数为r=0.999 7,平均加样回收率为96.97%,RSD=1.51%(n=6).对不同来源桔梗中总皂苷含量进行测定,其含量范围为1.07%～3.76%.结论 该法测定准确,重复性好,可用于桔梗药材中桔梗总皂苷的含量测定,便于对桔梗药材进行质量评价.     

HPLC法测定桔梗药材中桔梗皂苷D的含量

目的：建立HPLC法测定不同产地桔梗药材中桔梗皂苷D的含量。方法：HPLC分析采用Phenomenex LunaC18色谱柱,以0．1％磷酸水溶液～乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速0．5mL／min,检测波长210nm。结果：桔梗皂苷D分离良好,质量浓度与峰面积在测定范围内线性关系良好（r〉0．999）,重现性好,平均加样回收率为100．09％,13批不同产地桔梗药材中桔梗皂苷D占药材量的平均含量为0．2101％。结论：本研究所建立的HPLC方法稳定可靠,简便易行,可用于桔梗中桔梗皂苷D的定量．为桔梗的质量评价和质量控制奠定了基础。     

西洋参不同组织部位中皂苷生物合成相关基因的表达研究

通过皂苷含量与基因表达量之间相关性分析,获得西洋参中不同组织部位皂苷含量与人参皂苷生物合成相关基因表达之间联系。以四年生红果期西洋参的14个组织部位为材料,利用高效液相法和香草醛-硫酸比色法测定西洋参样本中6种单体皂苷（人参皂苷Rg1,Re,Rb1,Rc,Rb2,Rd）,分组皂苷和总皂苷含量;同时,利用实时荧光定量PCR法检测西洋参不同组织部位中7种（SQS,OSC,DS,β-AS,SQE,P450,FPS）人参皂苷生物合成相关基因的表达量。在西洋参中7种人参皂苷生物合成相关酶基因虽然参与人参皂苷合成,但是β-AS和P450基因的表达对单体皂苷,分组皂苷及总皂苷含量影响不显著;FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种基因表达对单体皂苷Re,Rg1,Rb1,Rd,分组皂苷PPD和PPT,单体总皂苷TMS和总皂苷TS含量影响显著或者极显著（P〈0.05或P〈0.01）。西洋参中部分单体皂苷,分组皂苷以及总皂苷的生物合成受着皂苷合成途径多种酶基因相互作用影响,生物合成途径中关键酶基因表达差异决定了西洋参中不同组织部位皂苷含量。因此,该研究通过相关性分析进一步明确了FPS,SQS,OSC,DS和SQE这5种酶基因是控制西洋参中皂苷合成的关键酶,它们通过集群协同表达互作的方式调控西洋参中人参皂苷的生物合成。     

不同产地桔梗性状、浸出物、桔梗皂苷D含量及HPLC指纹图谱比较

目的:对国家资源普查收集的产自10个省市的58批桔梗样品进行性状鉴别,测定其浸出物、桔梗皂苷D的含量,建立HPLC指纹图谱并对其进行比较。方法:按照2015年版《中国药典》方法测定浸出物及桔梗皂苷D含量;采用高效液相-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD),梯度洗脱,建立不同产地桔梗样品HPLC指纹图谱。结果:58批桔梗样品中有2批表面色泽,7批大小,11批断面特征不符合2015年版《中国药典》规定;浸出物、桔梗皂苷D的含量的总不合格率为36.20%;建立了58批桔梗样品的特征指纹图谱,共找到17个共有峰;四川省桔梗样品浸出物、桔梗皂苷D含量及HPLC指纹图谱相似度3个方面均较高,重庆市、湖南省桔梗样品3个方面均较低;对58批不同产地桔梗进行了聚类分析及性状、浸出物、桔梗皂苷D含量和HPLC指纹图谱的比较研究,浸出物、桔梗皂苷D含量及HPLC指纹图谱相似度不成正向相关,但样品中浸出物含量以及各成分含量的差异与样品性状特征(皮部)具相关性。结论:所鉴别的性状特征,测定的浸出物、桔梗皂苷D含量以及建立的HPLC指纹图谱可为优质桔梗的筛选,新版《中国药典》标准的修订以及桔梗质量评价,提供更全面、真实、具代表性的参考依据。     

基于多指标成分定量结合化学计量学评价不同产地和不同采收期桔梗质量

目的 采用多指标成分定量结合化学计量学方法对不同产地和不同采收期的桔梗Platycodon grandiflorum进行质量评价。方法 采用热浸法测定其醇溶性浸出物含量,应用超高效液相-电喷雾检测器（UPLC-CAD）法同时测定桔梗皂苷D、桔梗皂苷D₃、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷E、去芹糖桔梗皂苷E 5个活性成分含量,揭示不同采收期桔梗化学成分含量动态积累规律。运用主成分分析法分别对不同生长年限、不同产地桔梗进行综合评价,单因素方差分析比较不同产地桔梗各指标成分含量。结果 以春季4月、秋季9～10月、三年生为桔梗的最佳采收期。主成分分析、方差分析表明不同产地桔梗中指标含量存在显著性差异,同一产地不同批次间也有区别;根据主成分分析对不同产地桔梗进行综合评分,排名靠前的产地为甘肃陇南及河南省地区,陕西商洛、安徽亳州、内蒙古赤峰产地次之,山东淄博和山西太原产地排名较后。结论 以多指标成分定量结合化学计量学建立的评价方法明确了桔梗最佳采收期,评价了不同产地桔梗的质量,为桔梗药材质量控制研究提供依据。     

内生真菌对铁皮石斛多糖和生物碱合成关键酶基因表达的影响

目的分析内生真菌菌株GXRz2、GXRz3和GXRz10对铁皮石斛多糖含量和多糖合成途径关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因表达以及生物碱含量和生物碱合成途径中关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因表达的影响。方法铁皮石斛幼苗施加内生真菌菌液,采用分光光度法测定铁皮石斛多糖和生物碱含量。以18 S rRNA为内参照基因,荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测多糖、生物碱关键酶基因表达的变化。结果铁皮石斛活性成分多糖含量较高,主要集中于茎,根中最低;而生物碱含量较低,主要存在于叶,根中最低,3株内生真菌处理均能在一定程度上促进铁皮石斛多糖及生物碱的积累。qRT-PCR技术检测UGPase、HMGR和FPS基因在不同内生真菌处理下的相对表达,结果显示,内生真菌GXRz3和GXRz10均可显著提高铁皮石斛UGPase、HMGR和FPS基因的表达量;其中,多糖合成途径中,UGPase基因在茎中的相对表达量最高,叶次之,根中最少;生物碱合成途径中,HMGR基因在茎中的相对表达量最高,叶次之,根中最少,而FPS基因在叶中的相对表达量最高,茎次之,根中最少。结论内生真菌可能通过调控UGPase的表达,影响多糖的合成,结合多糖积累情况,推测UGPase可能是铁皮石斛多糖合成途径中的关键酶;内生真菌可能通过调控HMGR、FPS的表达,影响生物碱的合成,而结合生物碱积累情况,推测FPS可能是生物碱合成途径中的关键酶。     

膜荚黄芪法呢基焦磷酸合酶基因密码子偏性分析

目的法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)是调控黄芪甲苷生物合成途径关键酶,为该基因外源表达选择合适的宿主,进而为提高黄芪甲苷产量提供理论依据。方法以长白山膜荚黄芪为植物材料,克隆了FPS基因的编码序列。运用EMBOSS及Codon W等在线软件分析了FPS基因的密码子偏好性,并将其与玉米、青蒿等7种植物FPS基因及大肠杆菌基因组密码子偏好性进行比较。结果膜荚黄芪FPS基因偏好于以A或T碱基结尾的密码子,与大肠杆菌Escherichia coli基因组共有22个密码子存在差异。结论进一步提高膜荚黄芪FPS基因在大肠杆菌中的表达水平,需对其密码子进行优化。     

基于指纹图谱和多成分含量测定的丹参药材皮部和木部化学成分比较研究

目的 基于指纹图谱和多成分含量测定对丹参药材皮部和木部的化学成分进行分析与比较,阐明丹参药材不同部位活性成分的分布规律。方法 采用高效液相色谱法对不同批次的丹参皮部和木部样品进行分析,分别建立丹参皮部和木部指纹图谱;在此基础上,对丹参皮部和木部样品中的丹参素、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮II_A 8个活性成分进行含量测定,并结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等化学计量学方法对丹参皮部和木部化学成分进行比较。结果 建立了丹参药材皮部和木部化学指纹图谱,共标定了10个共有峰;含量测定和化学计量学分析结果表明,丹参皮部和木部样品的化学成分存在差异,其中丹酚酸类成分差异不大,而丹参酮类成分差异较大,丹参皮部样品中丹参酮类成分明显高于丹参木部样品。结论 通过指纹图谱结合多成分含量测定方法,明确了丹参药材不同部位活性成分的分布差异,为丹参药材资源的开发和利用提供了科学依据。     

海拔高度对蒙古黄芪主要药效成分积累及其关键酶基因表达量影响研究

目的研究不同海拔高度与蒙古黄芪Astragalus membranaceus var. mongholicus主要药效成分含量及其关键酶基因表达量之间的关系。方法采用HPLC法检测黄芪根中黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量,采用实时荧光定量PCR法检测黄芪甲苷生物合成过程中关键酶基因乙酰辅酶A乙酰基转移酶[AACT,acetoacetyl-co zymeA (CoA)thiolase]、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoAsynthase, HMGS)、 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶[3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeA(HMG-Co A)reductase,HMGR]、异戊二烯焦磷酸异构酶(iso-pentenyldiphosphateisomerase,IDI)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyldiphosphatesynthase,FPS)、鲨烯合酶(squalenesynthase,SS)、鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,SE)、环阿尔庭烷合酶(cycloartenolsynthase,CAS)基因的表达量。结果 4个样地中样地HQ-2(内蒙呼和浩特可可以力更镇)中黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量及总皂苷含量普遍高于其他样地;相关性分析表明,海拔高度对黄芪总皂苷合成的影响较大,IDI、SE和SS基因在黄芪总皂苷的合成过程中起主要作用,海拔高度有利于IDI、SE和SS基因的表达,海拔高度对黄芪皂苷合成途径中关键酶基因具有一定的调控作用。结论在处于海拔1730m左右的地区种植蒙古黄芪有利于其药效成分的积累。     

强光胁迫对茅苍术生长、生理生化及关键酶基因表达的影响

目的:探究不同梯度的强光胁迫对茅苍术生长、生理生化及关键酶基因表达的影响,为规范化栽培茅苍术提供科学依据。方法:以两年生茅苍术种苗为实验材料,杨树林下(透光率18.26%~36.04%)作为对照组(ck),采用不同密度的遮荫网于7月下旬模拟不同程度(51.10%,80.73%,100%)的强光进行胁迫。观察茅苍术生长状态,于第0,5,10,15,20天测定茅苍术叶片的生理生化指标丙二醛(MDA)含量、细胞膜透性、脯氨酸(Pro)含量、抗氧化酶活性及叶绿素含量。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术测定强光胁迫后茅苍术叶片中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMGR)和法呢基焦磷酸合酶基因(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)的相对表达量。结果:经过强光胁迫后,茅苍术叶片颜色由深绿色变为浅绿、黄绿色,叶片灼伤越来越严重;MDA含量、电导率及Pro含量随光强的增加总体呈上升趋势;过氧化物酶(POD),超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)均呈先升高再降低的趋势;叶绿素含量随光强的增加呈下降趋势;茅苍术叶片中HMGR相对表达量随光强的增加呈下降趋势而FPPS表达量呈先升后降的趋势。结论:实验结果表明在一定的强光胁迫下,茅苍术可通过提高抗氧化酶活性及调节渗透压物质含量以缓解强光胁迫的抑制作用;过高的强光胁迫则会导致茅苍术代谢机制失调,严重抑制植株生长。     

丹参酮生物合成相关SmERF108转录因子的鉴定及其靶基因分析＊

目的 鉴定与丹参酮合成相关转录因子AP2/ERF家族中SmERF108转录因子，并分析转录因子SmERF108的靶基因。方法 利用生物信息学在线分析平台如NCBI、PFAM等分析SmERF108的序列特征；MEGA-X软件用于构建SmERF108与不同功能转录因子的系统进化树；拟南芥原生质体转化法鉴定SmERF108蛋白的亚细胞定位；通过实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）对SmERF108基因在丹参不同器官和组织差异表达进行检测；利用酵母体系对SmERF108的转录激活活性进行探究并用酵母单杂技术确定其靶基因。结果 SmERF108具有典型的AP2/ERF保守结构域，属于ERF-B3亚组，系统进化树和保守基序分析显示SmERF108与丹参中SmERF128、青蒿中AaERF2亲缘关系较近且保守基序分布一致；亚细胞定位显示SmERF108蛋白定位于细胞核；SmERF108基因在周皮中表达最高，且呈现周皮（R1）>韧皮部（R2）>木质部（R3）的规律；酵母自激活验证SmERF108具有转录激活活性，同时酵母单杂交确认其能与关键酶基因SmCPS1启动子结合。结论 鉴定到丹参中一个新转录因子SmERF108，生物信息学分析及差异表达分析预测与丹参酮合成相关，分子互作初步证实靶基因为SmCPS1二萜环化酶。     

金线莲UGPase基因克隆与表达及在多糖合成中的作用

目的克隆出金线莲Anoectochilus roxburghii尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose pyrophoshorglase,UGPase)基因全长,并对其表达量及酶活性与多糖积累量之间的相关性进行分析,以研究UGPase基因在金线莲多糖合成代谢途径中的调控作用。方法利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆金线莲中UGPase基因序列;以金线莲尖叶、无纹等7个品种组培期及种植期茎段部位为材料,采用qRT-PCR、ELISA试剂盒法及苯酚-硫酸法分别测定UGPase基因表达量、酶活和多糖含量,并对其进行相关性分析。结果克隆得到的序列全长1786 bp。开放阅读框为1425 bp,编码475个氨基酸。7个不同品种金线莲中UGPase基因表达量、酶活与多糖含量具有极显著正相关(相关系数分别为0.823、0.785)。结论成功克隆出金线莲UGPase全长基因,初步证明UGPase基因是参与金线莲多糖合成代谢的关键基因之一。     

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。     

中国红豆杉TcAPLs基因的克隆及表达分析

目的克隆中国红豆杉altered phloem development(APL)基因,研究APL在中国红豆杉剥皮后树皮再生过程中的表达状况,以揭示其可能的调控作用机制。方法利用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆得到3个中国红豆杉APL(TcAPLs)基因的cDNA全长序列,分别命名为TcAPL1、TcAPL2和TcAPL3,进一步利用生物信息学工具对其进行分析,最后利用半定量RT-PCR对中国红豆杉不同组织和qRT-PCR技术对其剥皮再生不同时期的TcAPLs进行表达分析。结果系统进化树结果显示,TcAPL1与TcAPL2编码的蛋白与川桑的APL蛋白亲缘关系最近,聚为一类;TcAPL3处在APL另一个大的独立分支上。组织表达谱分析表明TcAPL1和TcAPL22个基因主要在根、茎、叶片和韧皮部(含形成层)中均高表达;TcAPL3在叶片中表达量较高,而在根和木质部(含形成层)表达较低。在中国红豆杉剥皮再生过程中,TcAPL1和TcAPL22个基因的表达水平随着时间的延长表现为先上升后下降的趋势,均在36 d下降最明显;TcAPL3的表达则在整个组织再生过程中被抑制。结论克隆了3个TcALs基因,3个基因在中国红豆杉剥皮再生过程中均有响应,推测它们在中国红豆杉植物剥皮后组织再生中起一定的调控作用。