白木香查尔酮合酶(AsCHS1)基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析.方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析.结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1.qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫.结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础.     

白木香查尔酮合酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因AsCHS1编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。方法:根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有查尔酮合酶保守结构域的CHS基因序列,采用RT-PCR技术,以不同伤害时间白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列,并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。另外,采用qRT-PCR方法,以组蛋白(histones)为内参对AsCHS1基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。结果:序列分析表明,所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框(opening reading frame,ORF)长为1 194 bp,编码397个氨基酸残基,命名为AsCHS1。qRT-PCR实验证明该基因表达量在伤害后12 h最大,说明该基因能够在早期响应伤害胁迫。结论:白木香AsCHS1基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究AsCHS1蛋白在白木香中黄酮合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

白木香转录因子AsWRKY62的分子克隆、原核表达及特性分析

目的对白木香AquilariasinensisAsWRKY62转录因子进行分子克隆、原核表达,并对其进行生物信息学分析和表达特性分析,为深入研究AsWRKY62在白木香生长发育、沉香形成等方面的功能奠定基础。方法以白木香愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板,采用RT-PCR及PCR技术克隆基因编码序列(CDS)全长;构建pET-21a-AsWRKY62原核表达载体,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态进行原核诱导表达;并通过生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等特性;用软件DNAMAN和MEGA5分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析,通过组织特异性表达分析不同组织中的基因表达模式。结果 AsWRKY62(GenBank注册号MH925301)基因CDS全长为1 581bp,编码一条由526个氨基酸组成的多肽,结构域分析表明其属于WRKY group I类蛋白;密码子优化后的pET-21a-AsWRKY62在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导的较适条件为0.5mmol/LIPTG37℃连续培养4h;As WRKY62基因具有组织特异性,其在根、茎中表达量最高,其次是沉香层和花中。结论本研究首次在白木香中克隆AsWRKY62,并进行原核表达和生物特性分析,表明其可能与沉香的形成有关,也为进一步研究其生物学功能提供了理论依据。     

白木香肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)基因的克隆及表达分析

对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羟基化酶基因 C4H 编码区进行克隆,并对其进行生物信息学分析和表达分析。根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有肉桂酸羟化酶酶保守结构域的 C4H 基因序列,采用RT-PCR技术克隆得到白木香 C4H 基因编码区序列,并对C4H蛋白进行生物信息学分析。另外,采用qRT-PCR方法对 C4H 基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。序列分析表明,所克隆的 C4H 基因编码区开放阅读框（opening reading frame,ORF）长为1 515 bp,编码514个氨基酸,GenBank登录号为KF134783。qRT-PCR实验证明 C4H 基因受不同伤害处理的诱导,分别在8,20 h达到最高表达水平。白木香 C4H 基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究C4H蛋白在白木香中黄酮及芳香族类化合物合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析

目的从白木香Aquilaria sinensis中克隆sHSP1和sHSP2基因,并对它们的生物信息学及表达模式进行分析。方法根据本课题组白木香转录组数据库进行分析获得2条具有小分子热激蛋白(sHSPs)保守结构域的sHSPs基因序列,利用RT-PCR技术克隆sHSP1和sHSP2基因的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sHSP1和sHSP2基因在不同组织和高盐及外源ABA、SA、MJ处理下不同时间的表达差异。结果克隆得到的白木香sHSP1和sHSP2基因开放阅读框都为474 bp,编码157个氨基酸。组织表达分析的结果显示,sHSP1和sHSP2基因主要在根中表达,在茎和叶中的表达量较少;白木香愈伤组织在高盐处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在36 h和24 h达到最高表达水平,而愈伤组织在外源ABA、MJ处理下,sHSP1和sHSP2基因都在12 h达到最高表达水平,在SA处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在12、24 h达到最高表达水平。结论获得了sHSP1和sHSP2 2基因全长c DNA序列,且2个基因在不同组织根、茎、叶中的表达存在差异性,在受到高盐和外源ABA、SA、MJ处理时,在不同时间的愈伤组织中的表达及积累情况也不同,该研究为后续深入研究白木香防御反应奠定了基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因(AsAACT)的克隆与表达分析

目的：对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase,AACT）基因AsAACT全长进行克隆并展开生物信息学分析和表达分析,为解析沉香萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法：根据获得的白木香转录组数据库AACT部分转录本序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术,以白木香茎cDNA为模板,克隆获得AsAACT全长,进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR,以GADPH为内参,分析白木香愈伤组织受不同伤害胁迫AsAACT的表达模式。结果：AsAACT开放阅读框（opening reading frame,ORF）为1 236 bp,编码411个氨基酸残基,酶命名为AsAACT;白木香愈伤受物理伤害（切割）后表达量没有明显变化,但受化学伤害（MeJA）后4 h表达量升高了5.5倍,说明该基因对MeJA诱导的化学伤害较敏感,且能够在早期响应伤害胁迫。结论：通过AsAACT基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定基础。     

铁皮石斛蛋白磷酸酶DoPP2C1基因的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛蛋白磷酸酶(protein phosphatase,PP)DoPP2C1基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用实时定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术获基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助qRT-PCR检测基因表达模式。结果分离到DoPP2C1基因(Gen Bank注册号KJ995533),cDNA全长1 221 bp,编码1条由285个氨基酸组成的多肽,相对分子质量31 080,等电点6.18;推定的DoPP2C1氨基酸序列具有植物PP2C蛋白家族保守的1个PP2C结构域(27-285);该蛋白预测无信号肽或跨膜域,定位在细胞质;DoPP2C1蛋白与多种植物PP2C蛋白一致性较高(56.3%~73.7%),与水稻OsPP2C62、高粱XP_002462907、大麦BAK00362和乌拉尔图小麦EMS47641蛋白等亲缘关系近,聚在PP2C分子进化树的F1分支;DoPP2C1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根和茎中表达量较高,分别为叶中的7.57倍和1.79倍。结论获得DoPP2C1基因分子特征,为深入研究该基因在铁皮石斛生长发育、逆境生理以及次级代谢调控中的生物学功能奠定基础。     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3的克隆与分子特性分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3,并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR和RACE技术获取基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用软件DNASTAR 6.0和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助定量PCR检测基因表达模式。结果分离到DoWRKY3基因(GenBank注册号KT957549),cDNA全长2 065 bp,编码1条由509个氨基酸组成的多肽,相对分子质量55 580,等电点6.58;推定的DoWRKY3氨基酸序列具有植物WRKY蛋白家族保守的2个WRKY结构域(217~279、381~449)、2个WRKYGQK位点和2个C_2H_2型锌指结构元件(C-X_4-C-X_(22-23)-H-X_1-H);该蛋白预测无信号肽或跨膜域,定位在细胞核;DoWRKY3蛋白与多种植物WRKY蛋白一致性较高(46.3%~57.4%),与拟南芥At WRKY3、At WRKY4和丹参Sm WRKY54蛋白等亲缘关系近,聚在WRKY分子进化树的Group 1分支;DoWRKY3基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根和叶中表达量较高,分别为茎中的2.32倍和1.69倍。结论 DoWRKY3基因全长的分子克隆与特征分析,为深入研究该基因在铁皮石斛生长发育、逆境生理以及次级代谢调控中的生物学功能奠定基础。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香倍半萜合成酶As-SesTPS1基因的克隆、生物信息学和表达分析

目的基于前期对白木香Aquilaria sinensis转录组测序结果,从白木香总RNA中克隆白木香倍半萜合成酶基因(As-Ses TPS1),并对其进行生物信息学及表达分析。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从白木香总RNA中获得倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1的c DNA全长序列;利用生物信息学手段对该序列进行相似性和同源性分析,并预测其编码蛋白的结构和功能;利用q RT-PCR技术检测该基因在白木香不同样品中的表达水平。结果得到倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1,开放阅读框(ORF)全长1 671 bp,编码556个氨基酸,其与多条倍半萜合成酶基因具有较高相似性,并含有RRx8W和DDxx D的保守序列;该基因在白木香的沉香样品中高表达。结论 As-Ses TPS1的克隆及其生物信息学和在白木香不同部位表达差异性分析,为白木香倍半萜生物合成代谢途径的研究奠定基础。     

当归MADS-box生物信息学及SOC1克隆与表达分析

目的 对当归Angelica sinensis MADS-box基因家族进行筛选与生物信息学分析,并对SOC1-4基因进行克隆与表达验证。方法 基于当归全长转录组筛选MADS-box基因家族,利用在线工具进行生物信息学分析,并利用q RT-PCR检测SOC1-4基因在不同材料中的表达水平。结果 当归全长转录组中含有29个MADS-box基因家族成员,可分为10个亚家族,共含有6个保守基序,蛋白质序列长度为49～422 aa,相对分子质量为5 697.56～49 624.90,等电点为5.06～11.00,亚细胞结果显示当归MADS-box基因家族成员分别定位于叶绿体、细胞核、细胞质和线粒体,二级结构预测及3D建模显示同一亚家族结构相似;SOC1-4基因克隆片段与全长转录组测序结果一致;SOC1-4基因随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现高表达,在抽薹植株、茎和叶中高表达,而在冷冻规避春化作用种苗中呈现低表达。结论 当归含有29个MADS-box成员,各成员理化性质和结构存在一定的差异,SOC1-4基因表达水平与当归抽薹开花生理调控一致,为当归MADS-box基因家族调控抽薹开花相关研究...     

茶树尿苷二磷酸-葡萄糖-脱氢酶基因的克隆及其表达分析

目的对参与多糖合成途径的茶树尿苷二磷酸-葡萄糖-脱氢酶基因(CamelliasinensisUDP-glucose-dehydrogenase gene,CsUGD)进行克隆、生物信息学分析、组织表达特异性分析及测定茶树不同器官组织多糖含量。方法通过转录组数据获得茶树同源基因序列。利用ProtParam、TMpred、signalP、NetPhos、SMART、SSPro 4.0等在线软件进行生物信息学分析。VMD编辑CsUGD基因蛋白质三维结构;Jalview软件进行多序列比对;MEGA5.0构建系统进化树。采用qRT-PCR对不同器官组织进行基因表达差异分析,通过蒽酮硫酸比色法测定不同器官的多糖含量。结果获得茶树CsUGD基因(MG366591)全长cDNA序列,该序列全长1 866 bp,编码480个氨基酸。CsUDP蛋白属于稳定亲水蛋白,不含信号肽,具有跨膜结构,并与柿树亲缘关系最近。荧光定量PCR显示,CsUGD在茶树的侧根中表达量最高;蒽酮硫酸比色法测定显示,在侧根中多糖含量最高。结论首次从茶树中克隆出CsUGD基因,阐明该基因在茶树生长发育中的重要作用,在茶树多糖合成途径中起到关键作用,为茶树育种并提高茶叶药用价值提供科学依据。     

当归抽薹开花过程中赤霉素代谢水平及其关键酶基因克隆与表达分析

目的 对当归Angelica sinensis 16个赤霉素（gibberellins,GAs）进行含量测定、GAs代谢酶基因筛选并进行生物信息学分析、关键基因克隆及表达验证,以期为调控当归抽薹开花提供理论依据。方法 利用HPLC-MS/MS对不同材料中GAs含量进行测定与分析,基于当归全长转录组筛选直接参与GAs代谢酶基因,利用在线工具进行生物信息学分析,并对关键酶基因GA2ox6和GA20ox1表达水平进行q RT-PCR检测。结果 在所测定的16个GAs中,8个GAs含量在早薹植株中高于非早薹植株,13个GAs含量随植株发育时期延长逐渐增加。当归全长转录组中含有9个直接参与GAs代谢的酶基因,可分为6个亚家族,共含有6个保守基序,亚细胞定位于细胞质。GA2ox6和GA20ox1基因克隆片段由于插入序列与全长转录组测序片段存在长度差异。GA2ox6基因在抽薹植株、随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现低表达,而在冷冻规避春化作用种苗中呈现高表达,GA20ox1基因则相反;GA2ox6和GA20ox1基因在叶和茎中相对于根均呈现高表达。结论 当归含有9个直接参与GAs代谢的酶基因,各成...     

地黄RgMATE6转运蛋白基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的克隆地黄多药及有毒化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)转运蛋白基因RgMATE6,并进行亚细胞定位与时空表达分析,为深入研究其在地黄转运次生代谢产物中的分子功能奠定基础。方法利用地黄转录组数据库候选基因序列,利用实时荧光PCR(RT-PCR)克隆RgMATE6基因;利用生物信息学软件对其编码蛋白的结构、理化性质、同源性和进化树进行分析;通过与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的方法测定该基因的时空表达模式。结果克隆获得1892 bp的RgMATE6基因序列,RgMATE6基因编码524个氨基酸、具有2个典型的MatE结构域和12个跨膜结构;RgMATE6蛋白与越橘的VcMATE6蛋白亲缘关系最近;RgMATE6-GFP载体瞬时表达的结果发现RgMATE6蛋白定位在液泡膜上;qRT-PCR分析发现RgMATE6基因在地黄不同时期的根中表达最高,尤其是块根膨大前期。结论 RgMATE6蛋白定位在液泡膜上,在地黄块根膨大...     

8个茶树WRKY转录因子基因的克隆与表达分析

目的克隆茶树WRKY转录因子(Cs WRKYs)家族中的8个成员,并对其进行生物信息学和非生物胁迫下的表达分析。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术从"铁观音"茶树品种中克隆8个WRKY基因,运用生物信息学的方法对8个WRKY基因编码的蛋白进行理化性质分析,同时通过与拟南芥同源基因的比较进行进化树的构建、多序列比对及保守基序分析。采用qRT-PCR方法检测8个WRKY基因在低温、干旱和脱落酸(abscisicacid,ABA)胁迫处理下的表达量。结果 8个WRKY转录因子基因开放阅读框(ORF)长度分别为1 407、2 208、1 302、849、978、879、1 443和810 bp,分别编码468、735、433、282、325、292、480和269个氨基酸,GenBank登录号分别为MG298951、MG298952、MG298955、MG298956、MG298957、MG298959、MG298960和MG298963。系统进化树及序列比对分析显示,8个CsWRKYs可以分成了2个大组;除CsWRKY39缺少锌指结构外,其他CsWRKYs均含有WRKYGQK保守七肽结构域及锌指结构组成的WRKY结构域。非生物胁迫下的表达模式显示,CsWRKYs基因在低温、干旱和ABA胁迫处理下均有表达且表达受到不同程度的诱导;CsWRKY2、CsWRKY21、CsWRKY23、CsWRKY44和CsWRKY65基因在低温处理后表达量上调超过2,显著响应低温胁迫;CsWRKY21、CsWRKY23、CsWRKY39和CsWRKY65在干旱胁迫处理12 h及ABA处理6 h时均上调表达。结论克隆获得来自不同组的8个茶树WRKY基因,推测与茶树抗逆密切相关。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。