人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的:克隆人天然颗粒溶素(granulysin,GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体,观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达.方法:提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA,经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列,插入pEGFP-C1质粒,鉴定正确后转染RAW264.7细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白及GLS的表达,采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性.结果:成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA,经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达,表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达,其表达产物具有良好的免疫反应性.     

9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

目的:构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果:成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素.结论:成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1-S9K.     

PCR产物靶向克隆法构建原核表达载体pET15b-CAT

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT.方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2( )-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增.将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6:1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经Xho Ⅰ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.结论:PCR产物靶向克隆法是一种简便、高效地将PCR产物定向克隆于目标载体的方法,而无需对PCR产物进行酶切、末端抹平、载体去磷酸化及连接反应,适用于任何载体、任何插入片段和任意酶切位点.     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

人颗粒溶素活性肽和小鼠白细胞介素-12基因真核穿梭共表达质粒的构建与真核表达

目的 构建含分枝杆菌复制子Orim,可分泌表达人颗粒溶素相对分子质量为9 000的活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核穿梭共表达质粒,并检测其蛋白表达.方法 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基凶片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段测序对质粒进行鉴定.同时,将mIL-12哑克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE41-S9K/mIL-12.然后,将分支杆菌复制子Orim亚克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,形成穿梭共表达质粒.采用RT-PCR、免疫细胞化学法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.ELISA检测mIL-12的表达.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达.结论 成功构建穿梭共表达质粒pBM9,并能体外表达.     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

颗粒溶素融合蛋白的克隆表达和免疫学鉴定

目的采用基因工程方法重组并表达颗粒溶素融合蛋白。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆颗粒溶素多肽分子的cDNA,经测序证实后定向插入表达载体pET28a( ),并经双酶切电泳鉴定。进而导入大肠杆菌BL21(DE3)plyS中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组融合蛋白。结果经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹法鉴定,在相对分子质量为9000处有明显的条带。结论经重组表达获得颗粒溶素融合蛋白,有助于进一步探讨颗粒溶素与临床疾病的相关性。     

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。     

粉尘螨Ⅱ类抗原(Der f 2)的cDNA克隆测序及亚克隆

目的 :获得粉尘螨Derf 2cDNA克隆及亚克隆 ,并进行测序。方法 :设计合成引物 ,从粉尘螨螨体中提取RNA ,经RT PCR获得cDNA ,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至 pMD 18T ,转化大肠杆菌E .coliJM 10 9,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序 ,将PCR筛检阳性重组子及 pET 3 2a( +)表达载体分别用SacⅠ和NotⅠ双酶切 ,连接转化至E .coliCompetentCellJM 10 9中过夜培养 ,挑选菌落进行酶切鉴定。结果 :从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf 2cDNA片段 ,成功构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚克隆 ,酶切产物的大小与预期相符。结论 :成功地对粉尘螨Derf 2cDNA进行体外扩增并构建 pET 3 2a( +) Derf 2亚 克隆     

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株，为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段，克隆入pET32a（＋），鉴定无误后，再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71，构建pLA71-omp载体，将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌，经卡那霉素筛选后，抽提质粒用PCR法鉴定，Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性，Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli／MS间进行穿梭，并在耻垢分枝杆菌中表达。     

人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的：获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体，进行核苷酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法：利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经kpnI、BamHI双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因，与GenBank的报道相比较，有1．4％的bp发生变异，1．6％的氨基酸残基改变。其同源性高达98％。结论：成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组栽体，进行核甘酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因，与GenBank公布的序列相比较，有l.8％的bp发生变异，0．35％的氨基酸残基改变，但同源性高达98％。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达

目的：构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21（DE3）中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果：酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a／rmcAg,SDS—PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64．3％。结论：应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。