微血管内皮细胞的分离、纯化和功能特性

近年来的研究表明,微血管内皮细胞在形态、表型和功能等方面都不同于大血管内皮细胞,因此,采用微血管内皮细胞,而不是脐静脉内皮细胞来研究发生于组织器官水平的病变已经成为一种共识。然而,由于细胞分离培养技术的限制,微血管内皮的研究在我国还是一个薄弱的研究领域。近年来随着微血管内皮细胞分离、纯化、培养技术的提高,各种不同组织器官的微血管内皮细胞相继培养成功。利用体外培养的微血管内皮细胞作为细胞模型来研究各种疾病的发病机制已经成为医学研究的重要手段。本文回顾了近年来的相关文献,就微血管内皮细胞的分离培养、鉴定及不同组织器官微血管内皮细胞的功能特性作一简要综述。     

人增生性瘢痕组织中微血管内皮细胞的分离、纯化和培养

目的　微血管内皮细胞 (MEC)增殖和血管发生存在于很多生理和病理过程中 ,为体外重建人增生性瘢痕组织微血管内皮细胞 (HSMEC)生长模型 .方法　正常人包皮和增生性瘢痕经 1.2 5 g· L- 1 dispase和 1.2 5 g· L- 1 胰蛋白酶依次消化 4℃ 2 4h后 ,机械挤压分离组织内 HSMEC和人真皮微血管内皮细胞 (HDMEC) ,经 5 0 0 0 U· L- 1 b FGF,2 0 0m L· L- 1胎牛血清的 DMEM内培养和 0 .1g· L- 1胰蛋白酶 ,0 .15 mmol· L- 1 EDTA的 TE分离、纯化 ,组织学 HE染色和 因子相关抗原免疫组化染色 ,观察 MEC的阳性细胞百分数 .结果　 MEC在含 b FGF培养基中增殖旺盛 ,少量混生的成纤维细胞经 TE分离 MEC而被基本遗弃 ,3代 MEC能获得 97.0 %～ 98.0 %的纯度 ,明显高于原代培养 (P<0 .0 1) ,HSMEC形态学与 HDMEC无明显差异 .结论　低浓度b FGF和 TE细胞分离液分别对 MEC的培养和纯化有可靠作用 ,HSMEC的培养成功为烧伤创面愈合和瘢痕增生机制的研究扩展了空间 .     

内皮细胞生长因子的分离和纯化

参照 Lobb 和 Fett 方法,用肝素亲和层析法从牛脑组织中提取出纯度较高的内皮细胞生长因子,后者能明显促进体外人脐静脉内皮细胞增殖。     

大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较

目的 对脑微血管内皮细胞分离、培养方法进行探索性研究,并对目前常用的纯化方法进行比较.方法 首先采用两次酶消化、两次梯度离心法对大鼠脑血管内皮原代细胞进行分离,然后分别采用免疫磁珠和Thy1.1抗体杀伤法分别进行纯化.结果 采用两次酶消化、两次梯度离心法可以成功分离到脑微血管内皮细胞,磁珠纯化法可得到纯度高但是数量较少的细胞,Thy1.1抗体杀伤法可得到纯度及得率均较高的内皮细胞.结论 我们所摸索的方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养.     

改良豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养

目的 探寻耳蜗微血管内皮细胞的分离与体外培养新方法。方法 选取豚鼠4只，无菌条件下分离其耳蜗血管纹和螺旋韧带，37℃下，Ⅳ型胶原酶(0．5mg／ml)消化3h，将消化获得的细胞接种后用内皮细胞条件培养液进行培养，反复刮除杂细胞。用ABC免疫酶染色法检测Ⅷ因子相关抗原来鉴定培养的内皮细胞，设阳性对照、阴性对照和空白对照。结果 所培养的耳蜗微血管内皮细胞纯度极高，胞浆内均含有内皮细胞特有的Ⅷ因子相关抗原。结论 本实验培养获得了纯净的耳蜗微血管内皮细胞，其方法简便、可操作性强，为血迷路屏障的体外研究奠定了坚实的基础。     

大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养

目的探讨一种分离和培养大鼠肺微血管内皮细胞(LMVEC)的简单方法。方法组织贴块法培养大鼠LMVEC,倒置显微镜下观察细胞的形态和生长特性,并采用免疫组化方法进行鉴定。结果获得的LMVEC具有规律的铺路石镶嵌状排列,内皮细胞特异性抗体CD31免疫组化染色阳性。结论组织贴块法培养LMVEC是简单可行的。     

小鼠脑血管内皮细胞的分离和培养

目的 探讨鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行形态学和功能学的研究。方法 取新生小鼠脑组织，采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术．进行原代培养；待细胞贴满瓶底时．进行传代培养。取原代和传代细胞各6孔，吸取培养上清液，用放免法和化学法测定ET和NO的含量。结果 经ⅧF：Ag免疫组化和细胞形态鉴定．证明培养的是血管内皮细胞．并且培养的脑微血管内皮细胞能合成和分泌ET和N()。结论采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术是获取内皮细胞的可靠方法，这为脑血管疾病的研究提供有用工具。     

不同脑部和脑区微血管内皮细胞的培养

培养不同脑部和脑区的微血管内皮细胞。取健康兔或猪的不同脑部或脑区组织，先经胰酶初步消化，浆浆，尼龙筛网过滤和右旋糖酐分离后，用胶原酶消化获到的微血管并进行营养２。用Ⅷ因子相关抗原抗血清进行免疫组织化学染色鉴定。     

新生大鼠心脏微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:介绍一种改良的心脏微血管内皮细胞(CMECs)的分离培养及鉴定方法。方法:应用酶消化法分离大鼠CMECs,再用差速贴壁进行纯化。结果:用光学显微境、免疫细胞化学法进行第Ⅷ因子相关抗原染色来鉴定CMECs,其纯度约98%。结论:该法简单且经济。     

模拟失重对肺微血管内皮细胞屏障功能的影响

目的 研究模拟失重对肺微血管内皮细胞屏障功能的影响,为防御失重所导致的不良影响寻找新的治疗靶点.方法 采用回转器模拟失重效应干预肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC),回转培养72h,同时设1g对照静置培养组.之后用免疫荧光染色标记细胞骨架肌动蛋白F-actin,并在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的改变;光镜下观察单核细胞(THP-1) 与PMVEC 的黏附作用,并计算黏附率;绿色荧光标记的腺病毒感染细胞,荧光显微镜下观察,并在流式细胞仪检测感染效率.结果 回转72h PMVEC 胞质内F-actin 的表达减少,微丝的拉丝感和方向感明显弱化,排列松散,细胞伸展不好,体积变小;模拟失重抑制PMVEC 对单核细胞的黏附,导致黏附率(37.69%±6.5% vs 51.25%±8.2%,P<0.05) 下降;模拟失重组的腺病毒感染率更高(84.55%±5.31% vs 66.32%±5.74%,P<0.05),更容易受到腺病毒感染.结论 模拟失重可以损伤PMVECs 的屏障功能.     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

一种改良的肺微血管内皮细胞培养方法

目的对目前常用的小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)原代培养方法进行改良,以期建立较为容易获取纯化的小鼠PMVECs的方法。方法应用C57小鼠,采用改进的组织块贴壁法分离、培养PMVECs,光镜观察细胞形态,Ⅷ因子相关抗原和CD31相关抗原免疫细胞化学法鉴定培养的PMVECs,并比较改良培养方法与传统培养方法的优越性。结果体外培养的原代PMVECs在光镜下呈类圆形或短梭形,形成单层后呈铺路石样排列,Ⅷ因子相关抗原和CD31荧光染色阳性,利用改良的培养方法培养的细胞生长较传统方法更加快速,分布更加均匀。结论改良的PMVECs分离、培养方法获得的细胞生长状态良好,克服细胞生长缓慢、杂细胞容易污染等难题,是一种较为理想的培养方法。     

大鼠心肌微血管内皮细胞的分离培养和鉴定

目的建立心肌微血管内皮细胞培养模型。方法以1%～2%鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用胶原酶和胰蛋白酶两次消化法从SD大鼠心肌分离培养微血管内皮细胞。结果通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度大鼠心肌微血管内皮细胞。结论以鼠尾胶原对培养皿作预处理,采用蛋白酶消化及机械剪切、过滤的方法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,纯度和获得率均较高。     

慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究

目的 分离、纯化慢性粒细胞性白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（MSC）,并对MSC进行功能、特性鉴定。方法 获取CML患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增;流式细胞术检测MSC免疫表型和细胞周期;通过油红O染色、Von Kossa染色和Western印迹检测MSC向脂肪、骨和神经细胞的分化。电镜检测CML患者骨髓MSC的超微结构;通过软琼脂培养法和裸鼠接种,确定CML来源的MSC是否存在致瘤性。结果 MSC在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪和神经细胞分化。CML来源的MSC在倒置显微镜下为梭形,表达CD29、CD44、CDl05,而CDllb,CD31、CD34、CD45、HLA—DR均为阴性。CML来源的MSCBCR／ABL融合基因阴性,不具备体内和体外致瘤性。结论CML患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSC,该细胞群体不具备体外和体内致瘤性,表现为正常MSC的生物学特征。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的：建立稳定可靠的耳蜗微血管内皮细胞分离培养方法。方法：采用 显微解剖法分离出耳蜗血管纹,组织块培养法进行体外培养。结果：按种后2d,部分组织块边缘有散在的细胞生长,之后细胞数逐渐增多,10d左右以组织块为中心可见成片细胞组成的细胞集落。倒置显微镜下,单个培养细胞多呈长梭形,而融合成片状单层的培养细胞排列紧密,有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观。经纯化后,95％以上的培养细胞第VIII因子相关抗原显示阳性反应。结论：本研究方法能够获取体外培养的耳蜗微血管内皮细胞。     

大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭蛋白-yijP的表达纯化

目的:研究大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物在大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞中的作用,以期阐明大肠杆菌穿过血脑屏障的机制.方法:应用PCR方法获取yijP基因C末端1.04 kb片断(编码333个氨基酸),将其克隆到PQE载体并转化到受体菌M15,以构建出表达N-末端带有6个组氨酸的yijP融合蛋白的工程菌.通过Ni-NTA Agarose亲和层析法提纯yijP融合蛋白,初步分析该蛋白对人脑微血管内皮细胞(HB-MEC)生长的影响.结果:成功获得了分子量为41kb的yijP融合蛋白,并发现yijP蛋白对HBMEC有较强的细胞毒作用.结论:大肠杆菌脑微血管内皮细胞侵袭基因yijP的编码产物-yijP蛋白可能是一种细胞毒因子.     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

牛视网膜微血管内皮细胞培养方法的研究

目的 探求一种简单、易行的体外培养牛视网膜微血管内皮细胞的方法。方法 采用胶原酶消化获得细胞，并用低浓度人血浆提纯细胞。加入视网膜提取液促进细胞生长。结果 经过多次探索、观察，比较成功的进行了视网膜血管内皮细胞的培养，并成功的进行了鉴定。结论 此方法适合一般实验室开展视网膜血管内皮细胞培养。     

人肾上腺微血管内皮细胞的形态、表型和功能特性

目的 研究人肾上腺微血管内皮细胞的表型和功能特性。方法 用亚细胞克隆法分离和纯化人肾上腺微血管内皮细胞;流式细胞术检测内皮细胞标志血管性血友病因子（vWF）和CD31的表达、低密度脂蛋白的摄取和细胞的表型;扫描电子显微镜检查细胞表面的微绒毛和窗孔样结构;RT—PCR和免疫细胞化学法检测细胞内源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,并比较各种不同器官微血管内皮细胞对肾上腺糖皮质激素诱导细胞毒的敏感性。结果 人肾上腺微血管内皮细胞表达经典内皮细胞标志vWF和CD31,并摄取低密度脂蛋白;同时表达α-1抗胰蛋白酶、肿瘤坏死因子受体（TNFR）p55和细胞间黏附分子-1。扫描电子显微镜显示细胞表面存在大量微绒毛和窗孔样结构。RT-PCR显示人肾上腺微血管内皮细胞高表达VEGF mRNA,免疫细胞化学法显示其细胞内高表达VEGF。对肾上腺皮质激素诱导的细胞毒性反应中,人脑微血管内皮细胞最敏感,人肺和肝窦内皮细胞次之,而人肾上腺微血管内皮细胞表现高度抵抗。结论 人肾上腺微血管内皮细胞是特殊分化的,具有不同于其他器官组织内皮细胞的表型和功能特性。