人参皂苷Rb2体内抑制破骨细胞的作用及其机制研究

目的探究人参皂苷Rb2在体内调控破骨细胞的作用及机制。方法通过去势建立小鼠骨质疏松模型,分为4组(假手术组,去势组,低剂量组,高剂量组),腹腔注射不同浓度Rb2溶液[低剂量组5 mg/(kg·d),高剂量组20 mg/(kg·d),假手术组、去势组注射蒸馏水],常规饲养12周。使用Elisa试剂盒检测血清破骨细胞活性指标抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant factor acid phosphatase,TRAP)、I型胶原C端肽(C-terminal telopeptide-I,CTX-1)水平,股骨远端TRAP染色,从髓腔中提取和培养原代破骨细胞,TRAP染色并计数检测破骨细胞分化情况,Western-blot技术检测原代破骨细胞核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65蛋白及自噬相关分子自噬标志轻链3(autophagy marker light chain 3,LC3)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphateactivated protein kinase,AMPK)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase,pAMPK)蛋白表达水平。结果去势小鼠血清TRAP(64.10±1.18)pg/ml、CTX-1(70.43±1.71)ng/ml浓度最高,其余各组血清指标明显降低,高剂量组尤甚[分别为(44.62±2.02)pg/ml和(49.55±2.72)ng/ml](P<0.01)。去势组股骨远端TRAP染色阳性细胞密集,阳性区域最大,随着Rb2浓度增加,TRAP染色阳性区域面积减少(P<0.05)。去势组多核破骨细胞数量最多(152.00±18.55/孔),低剂量组(118.40±18.46/孔)和高剂量组(99.60±13.89/孔)。TRAP染色阳性细胞数量均有不同程度减少,低剂量组最少(84.00±15.23/孔),各组P<0.01。与去势组相比,各组NF-κB在细胞质增加(P<0.05),在细胞核减少(P<0.01);各组mTOR表达减少,AMPK、pAMPK表达增加,LC3 II/LC3 I比值增高(P<0.05)。结论人参皂苷Rb2在体内通过抑制NF-κB信号通路以及调控mTOR介导的自噬信号通路抑制破骨细胞。     

CaMKⅡγ基因沉默对破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src基因表达的影响

目的 研究钙调蛋白依赖性激酶II(Calmodulin-dependent kinase II,CaMKII)γ基因沉默对破骨细胞分化过程中活化T-细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)、非受体酪氨酸激酶(Cell-sarcoma receptor coactivator,c-Src)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)基因表达的影响,探讨CaMKIIγ在破骨细胞分化中的作用和分子机制。方法 用慢病毒构建CaMKIIγ RNA干扰载体,转染RAW264.7细胞,实验分为A、B、C三组,分别为对照组、阴性载体组和干扰载体组;三组细胞转染12 h后,用50 ng RANKL诱导向破骨细胞分化;诱导5 d后收获细胞,采用实时荧光定量 PCR、Western blot、免疫荧光化学检测三组细胞中NFATc1、TRAP、c-Src基因表达情况。结果 C组中NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平较A组分别下降了49.86%、43.65%和53.57%(P＜0.001),蛋白水平分别下降了54.22%、46.75%和45.86%(P＜0.001);而B组与A组比较无统计学差异(P＞0.05)。免疫荧光化学检测C组上述基因荧光强度明显弱于A、B组,且破骨细胞生成明显少于A、B组。结论 CaMKIIγ RNA干扰显著抑制了NFATc1、TRAP、c-Src基因表达,提示CaMKIIγ在破骨细胞分化中起着关键调控作用。     

CCN3在肺癌骨转移灶中高表达及其对破骨细胞的作用

背景与目的:肺癌易转移至骨并导致溶骨性破坏的具体机制目前还不清楚,本研究观察CCN3在肺癌骨转移灶中的表达水平以及在前体成骨细胞(MC3T3-E1)与前体破骨细胞(RAW264.7)共培养体系研究CCN3重组蛋白对前体破骨细胞分化的影响。方法:采用免疫组化检测9例肺癌骨转移转灶组织及相应癌旁组织中CCN3的表达;构建RAW264.7细胞与MC3T3-E1细胞共培养模型,向共培养体系中加或不加800 ng/mL的CCN3重组蛋白,采用Real-time PCR检测RAW264.7细胞的破骨细胞标志基因抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、组织蛋白酶K(cathepsin K,CK)、降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)mRNA的表达,并通过TRAP染色法对破骨细胞进行鉴定。结果:肺癌骨转移灶组织中的CCN3表达量明显高于癌旁组织;CCN3重组蛋白可显著促进共培养体系中的RAW264.7细胞的破骨细胞标志基因TRAP、CK、CTR的mRNA的表达量;TRAP染色可见对照组TRAP阳性细胞数[(6.2±1.48)个]明显低于加了CCN3重组蛋白的试验组[(21.4±3.04)个],差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:CCN3在肺癌骨转移灶中高表达及其可诱导破骨细胞分化,CCN3可能在肺癌骨转移和溶骨性破坏中具有重要作用。     

硼替佐米对多发性骨髓瘤患者破骨细胞生成的影响及机制研究

目的:观察多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者破骨细胞在体外诱导分化成熟过程中,硼替佐米(Bortezomib,Btzmb)对其分化和功能的影响,以及破骨细胞分化过程中上游关键信号分子肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)的改变.方法:患者外周血单个核细胞在经核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of NF-kB ligand,RANKL)及巨噬细胞集落刺激因子(macmphage colony stimulating factor,M-CSF)诱导后向破骨细胞分化过程中,采用不同剂量的Btzmb进行处理,观察抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)染色阳性的破骨细胞数量,检测培养液中的TRAP活性,并观察骨片上骨陷窝数量的变化.采用Westem印迹和RT-PCR法,分析Btzmb对破骨前体细胞中TRAF6蛋白和mRNA的影响.结果:2.5和5 nmol/L Btzmb组破骨细胞数量分别为(157±21)和(98±15)个,较对照组(307±25)明显减少(P均＜0.05),骨陷窝形成数量分别为对照组的(53±24)%和(29±7)%(P均＜0.05),上清液中破骨细胞活性分别为对照组的(86±24)%和(60±25)%(P均＜0.05).破骨前体细胞经Btzmb处理后观察24 h,TRAF6蛋白活性逐渐降低,TRAF6 mRNA水平也有所下降.结论:Btzmb抑制MM患者破骨细胞的分化和功能,该作用可能与TRAF6有关.     

siＲNA 介导的eIF3b基因沉默抑制乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和迁移

目的:探讨siＲNA介导的eIF3b基因沉默对乳腺癌细胞MCF-7侵袭和迁移能力的影响。方法:设计eIF3b基因的小分子干扰RNA(siRNA)片段,脂质体介导转染入乳腺癌细胞株MCF-7,转染分3个组:I组(空白对照组)、II组(转染非特异性对照组)和III组（转染eIF3b-siRNA组）。应用qＲT-PCＲ和Western blotting免疫印迹法检测转染前后eIF3b基因mＲNA和蛋白表达水平;运用Matrigel 胶模型细胞迁移和侵袭实验检测MCF-7细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:与I组（1.09±0.19）、II组（1.05±0.17）相比,III组eIF3b 蛋白表达水平（0.45±0.06）明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.05),I组和II组eIF3b蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。III组eIF3b mRNA相对表达水平为0.54±0.08,明显低于I组(1.12±0.16)和II组(1.08±0.18),差异有统计学意义（P＜0.05）,I组和II组eIF3b mRNA表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。细胞迁移实验中,III组细胞明显少于I组和II组(P＜0.05);细胞侵袭实验中,III组穿过人工基底膜的细胞明显少于I组和II组(P＜0.05)。结论:下调eIF3b表达可明显抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移。     

胫骨内接种建立乳腺癌骨转移大鼠模型的特点

目的研究胫骨内接种MRMT-1细胞制作的乳腺癌骨转移大鼠模型在行为学、影像学、核医学、病理学和分子生物学等方面的特点。方法使用雌性SD大鼠,随机分为假手术组和模型组,使用胫骨内注射法制成乳腺癌骨转移模型。造模后第19天时进行疼痛测定;第21天取材,测定肿瘤体积,通过影像技术评估骨质缺损程度,核医学测定骨矿物质含量(BMC)和骨密度(BMD),HE染色观察形态,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并计数破骨细胞,免疫组化法测定增殖细胞核抗原(PCNA)、护骨素(OPG)和核因子kB受体活化因子配体(RANKL),荧光实时定量RT-PCR测定甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)。结果模型组在造模后第19天已出现机械痛觉超敏、机械痛觉过敏和热痛觉过敏(P0.01)。第21天取材后胫骨影像评分升高(P0.01),BMD下降(P0.05);肉眼观察肿瘤生长明显(P0.01),镜下可见溶骨病变为主的混合性骨质破坏;破骨细胞数量和活性增加(P0.01),PTHrP、OPG水平与OPG/RANKL比值均下降(P0.05、P0.01),而RANKL无明显变化。结论乳腺癌骨转移大鼠模型具有疼痛和骨质破坏的表现,但未表现出PTHrP和RANKL升高,其损伤途径是通过抑制OPG破坏了OPG-RANKL-RANK系统的平衡,引起破骨细胞过度激活,造成骨吸收作用亢进。     

17β-雌二醇对破骨细胞骨架和骨吸收功能影响的实验研究

目的　研究17β-雌二醇对体外培养破骨细胞细胞骨架的影响,以及这种影响与骨吸收功能之间的关系。方法　在破骨细胞培养液中加入不同浓度的17β-雌二醇,用F-actin特异性抗体进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察破骨细胞细胞骨架的变化情况,同时用扫描电镜观察破骨细胞在骨片形成骨吸收陷窝数目及面积的变化。结果　随着17β-雌二醇浓度的升高,实验组破骨细胞F-actin相对荧光强度从(89 6±7 5)%下降至(34 7±5 4)% (与对照组荧光强度相比),细胞内微丝收缩变短,排列紊乱,细胞波状缘消失,破骨细胞伸展面积从(1289±53)μm2 /细胞核下降至(406±42)μm2 /细胞核,同时,骨吸收陷窝的数目和面积从(131 5 ±11 7)个/片和(2157±51)μm2 减少到(16 8±4 0 )个/片和(965±75)μm2。生理浓度(10-7mol/l)及其以上17β-雌二醇处理组与对照组比较,差异有显著性(P<0 01 )。结论　17β-雌二醇影响破骨细胞内细胞骨架的结构,下调F-actin的表达,降低破骨细胞的活动能力,从而抑制破骨细胞的骨吸收功能。     

肺癌A549细胞诱导RAW264.7破骨细胞分化中AMPK信号通路的作用

目的:探讨AMPK信号通路在体外肺癌细胞诱导破骨细胞分化中的作用。方法:将肺癌A549细胞与RAW264.7细胞共培养后随机分为阴性对照组、阳性对照组、AICAR组,药物干预后行TRAP染色观察破骨细胞的分化,流式细胞仪观察破骨细胞细胞凋亡情况,qPCR检测破骨细胞AMPK、mTOR和CTSK mRNA的表达,Western blot检测破骨细胞AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白的表达。结果:与阴性对照组比较,AICAR组破骨细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;对诱导破骨细胞凋亡的作用无差异;上调AMPK的mRNA和蛋白表达,下调mTOR的mRNA和蛋白表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:AICAR可以抑制肺癌细胞诱导破骨细胞分化,而AMPK/mTOR信号通路可能参与了肺癌细胞诱导破骨细胞分化过程。     

一种从骨巨细胞瘤组织中纯化破骨细胞的简单方法(英文)

目的从人骨巨细胞瘤组织中分离纯化及鉴定破骨细胞。方法我们利用0.25%胰酶-EDTA 和Ⅰ型胶原酶从人骨巨细胞瘤组织中纯化出大量破骨细胞,并进行表型特征的鉴定:包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP 染色),采用 RT-PCR 方法检测降钙素受体、组织蛋白酶 K 和破骨细胞分化因子受体(RANK)表达。结果该方法所得细胞纯度可达79.7%,具有破骨细胞表型特征。结论该方法所得破骨细胞可用于生化和分子生物学研究,是进行骨代谢研究较好的破骨细胞来源。     

骨疏康对1型糖尿病大鼠体外培养的破骨细胞影响的初步探讨

目的 探讨骨疏康对1型糖尿病大鼠体外培养的破骨细胞影响。方法 用RANKL和M-CSF诱导1型糖尿病大鼠的股骨骨髓进行体外培养生成类破骨细胞样细胞(OLC)。实验分为正常对照组,1型糖尿病组,正常对照+骨疏康组,1型糖尿病+骨疏康组。骨疏康的浓度为20μg/ml。细胞培养7天后,贴壁细胞固定,抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色,破骨细胞计数。结果 1型糖尿病大鼠与正常大鼠组的破骨细胞数比较无明显差别(P>0.05);经骨疏康干预后,1型糖尿病大鼠与正常大鼠的破骨细胞数都明显减少(P<0.01)。结论 1型糖尿病早期破骨细胞形成与正常对照组无明显差异。中药骨疏康明显抑制正常大鼠和1型糖尿病大鼠的破骨细胞形成。     

非小细胞肺癌组织中表皮生长因子受体磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶B1及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA表达及其临床意义

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt1/m TOR)通路与表皮生长因子受体(EGFR)基因的关系,及其PI3K/Akt1/m TOR通路导致EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药的具体机制。方法选择135例未经过放化疗或靶向药物治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤组织标本,检测其EGFR、PIK3CA、Akt1和m TOR的mRNA表达水平,并进行相关性分析。结果 EGFR与Akt1、m TOR的表达水平呈正相关(r分别为0.342、0.320和0.281,均P<0.01),与PIK3CA基因无关。结论 EGFR基因表达与Akt1和m TOR相关,与PIK3CA无关,提示EGFR基因可能直接激活Akt及其下游通路,而不经过PI3K。     

ANGPTL4在调控骨巨细胞瘤细胞增殖、血管生成和破骨分化作用的实验研究

目的探讨人血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)基因沉默对骨巨细胞瘤单核基质细胞(GCTSC)增殖、血管生成以及破骨分化的作用。方法体外培养GCTSC细胞系,采用ANGPTL4 shRNA、Scrambled shRNA转染作为ANGPTL4 shRNA组和阴性对照组,另设置无处理的空白对照组。采用实时荧光定量PCR(QPCR)和Western blotting法检测ANGPTL4 mRNA和蛋白表达。MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。将GCTSC细胞分别与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、小鼠骨髓单核细胞(BMM)共培养,观察HUVECs成管能力和BMM破骨分化能力。结果与空白对照组和阴性对照组比较,ANGPTL4 shRNA组ANGPTL4 mRNA(0.174±0.045)和蛋白表达量(0.098±0.020)均明显降低;而ANGPTL4 shRNA组GCTSC细胞增殖活性降低,凋亡率升高(P<0.05)。与HUVECs共培养后,ANGPTL4 shRNA组闭合管数量[(57.35±17.24)%]减少(P<0.05);与BMM共培养后,ANGPTL4 shRNA组TRAP染色阳性的破骨细胞样多核巨细胞数量[(48.36±21.79)%]减少(P<0.05)。结论沉默骨巨细胞瘤GCTSC细胞ANGPTL4基因表达后,细胞增殖活性降低,凋亡率增加,并且对肿瘤血管生成和多核巨细胞破骨分化有一定的抑制作用。     

针对核干细胞因子腺病毒干扰载体构建与干扰作用观察

目的构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用。方法根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒。实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组。不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平。计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化。结果靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建。蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势。P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P<0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P<0.001。P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P<0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P<0.001。细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006。表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过。结论成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础。     

RNA干扰ATG16L1抑制人胃癌细胞BGC823自噬并促进顺铂诱导的细胞凋亡

摘 要：［目的］ 检测RNA干扰自噬相关基因16L1(autophagy-related gene 16L1,ATG16L1)表达后胃癌细胞的自噬活性,观察在ATG16L1敲减下顺铂（DDP）对胃癌细胞凋亡的影响。［方法］ 用ATG16L1 siRNA 技术构建ATG16L1 低表达的人胃癌BGC823 细胞株作为干扰组,转染阴性干扰的BGC823 细胞作为阴性转染组,未转染的BGC823 细胞作为对照组;Western blot 检测各组细胞中ATG16L1 的表达和自噬标志物微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3,LC3) 及死骨片蛋白1(sequestosome 1,P62)的表达;免疫荧光观察LC3II情况。CCK-8实验检测DDP处理后各组细胞增殖能力,计算IC50值。经DDP刺激后,流式细胞术检测细胞凋亡,再用Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白表达。最后应用公共数据库Kaplan-Meier对多组胃癌患者mRNA 表达谱进行分析,预测ATG16L1 的表达水平对患者预后的影响。［结果］ ATG16L1 siRNA干扰组较对照组蛋白表达水平明显降低(P<0.001) ;LC3II水平下降(P<0.01),P62 水平上升(P<0.01),并且LC3荧光强度下降(P<0.05) 。经DDP诱导后,干扰组细胞增殖明显受抑（P<0.001）,细胞凋亡率明显增加(P<0.01) ;ATG16L1 干扰组中促凋亡分子cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达比对照组明显增加(P<0.001,P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2 表达减少(P<0.001) 。公共数据库Kaplan-Meier表达谱芯片分析结果显示高表达ATG16L1组较低表达组预后差,差异有统计学意义 (P=0.001)。 ［结论］ RNA干扰ATG16L1抑制胃癌细胞自噬,并能够明显增强顺铂诱导人胃癌细胞的凋亡,提示靶向干扰ATG16L1抑制细胞自噬后可能通过调控细胞凋亡提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。     

辛伐他汀在裸鼠模型中对乳腺癌骨转移的影响

目的 观察辛伐他汀在裸鼠模型中对乳腺癌骨转移的作用.方法采用完全随机分组方法 将60只裸鼠分为3组,每组20只,裸鼠左心腔注射乳腺癌骨转移细胞株(MDA-MB-231),7d后,分别皮下注射辛伐他汀、生理盐水及无任何处理(2次/周,19 d).应用图像分析软件评估骨转移瘤的面积.随后处死裸鼠,用放射免疫法检测骨转移癌髓腔内甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)浓度;应用骨密度检测软件进行组织形态学分析,计数骨转移灶每毫米癌组织与临近骨小梁之间破骨细胞的数量.计量资料比较采用方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 与生理盐水组和无处理组相比,注射辛伐他汀的裸鼠骨转移癌面积明显减小(0.51±0.18 mm2 vs 2.13±1.24 mm2 vs 2.29±1.22 mm2;F=15.600,P=0.002; F=15.673,P=0.001),骨转移癌周围髓腔内PTHrP浓度明显降低(0.98±0.20 pmol/L vs 2.11±0.31 pmol/L vs 1.99±0.29 pmol/L;F=61.469,P＜0.001;F=58.274,P＜0.001),并且其转移灶破骨细胞的数量明显减少(4.00±1.73个/mm vs 11.40 ±4.93个/mm vs 10.91±3.87个/mm;F=17.820,P=0.001,F=17.184,P=0.002).结论 辛伐他汀能够降低乳腺癌细胞PTHrP的分泌,从而抑制乳腺癌细胞在骨内生长及其对骨质的破坏.     

靶向survivin基因微小RNA真核表达载体的构建及其对人结肠癌细胞增殖的影响

目的 构建靶向survivin基因的微小RNA(miRNA)真核表达载体,探讨其对人结肠癌细胞(HT-29)增殖、凋亡的影响.方法 设计合成针对survivin基因的miRNA序列,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表达载体上,构建靶向survivin的miRNA重组质粒.HT-29细胞接种于6孔板,分为空白对照组、转染试剂组、空质粒组(阴性对照组)以及目的基因组(阳性对照组)4组.瞬时转染后收集各组细胞,应用流式细胞仪检测各组细胞的增殖指数及凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法(Western blot)检测靶基因(survivin) mRNA和蛋白的表达.结果 HT-29细胞转染后,目的基因组增殖指数与正常组、转染试剂组、空质粒组相比明显降低(17.98％±2.35％ vs 38.04％±2.11％ vs36.73％ ±2.51％ vs36.57％±3.05％;t=20.05,P ＜0.01;t =18.75,P＜0.01;t=18.59,P＜0.01),凋亡率明显增高(19.54％±1.74％ vs 3.13％±0.29％ vs 3.70％ ±0.44％ vs 3.61％±0.50％; t=16.40,P＜0.01;t=15.84,P＜0.01;t=15.92,P＜0.01).目的基因组survivin mRNA与其他各组相比明显降低(=0.68,P＜0.01;=0.58,P＜0.01;t =0.61,P＜0.01),蛋白的表达亦明显降低(t=0.64,P＜0.01;t =0.62,P＜0.01;t =0.67,P＜0.01).结论 靶向沉默结肠癌HT-29细胞的survivin基因可以明显抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

Tie-2在口腔鳞状细胞癌侵犯颌骨过程中的作用机制研究

目的:研究酪氨酸激酶受体-2（tyrosinekinase receptor-2,Tie-2）在口腔鳞状细胞癌侵犯颌骨过程中的作用机制。方法:免疫组化SP法比较Tie-2在颌骨侵犯前沿的口腔鳞状细胞癌与其他部位的口腔鳞癌中的表达差异;构建3种针对Tie-2的siRNA慢病毒载体（662、663、664）为实验组、空载病毒429和生理盐水（NS）为对照组,并将各组转染至人舌鳞癌细胞系（Cal-27）中,应用qRT-PCR筛选出抑制效果最好的siRNA;CCK-8法检测细胞活性;将抑制效果最好的慢病毒载体转染至Cal-27后,将其培养基上清添加至人单核细胞系（THP-1）培养基中,qRT-PCR和Western blotting检测THP-1中的破骨细胞功能相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）和组织蛋白酶K（cathepsin K,CTSK）的mRNA和蛋白量在各组中的表达差异。结果:颌骨侵犯前沿的骨旁鳞癌组织染色比其他部位鳞癌组织显著加深,骨旁鳞癌组织MOD值显著增大（P＜0.000 1）;siRNA-664对Cal-27中Tie-2表达的抑制效果最佳（P＜0.000 1）;用慢病毒转染Cal-27和THP-1后,细胞活性无明显变化,差异无统计学意义;沉默Cal-27中Tie-2的表达后,THP-1的破骨细胞功能相关基因和蛋白表达显著降低（P＜0.000 1）。结论:下调Tie-2表达后,THP-1向破骨细胞分化的潜力降低,表现为破骨细胞功能相关基因和蛋白表达下调。OSCC可能通过激活Ang/Tie-2信号体系释放某些破骨细胞分化因子,促进破骨细胞分化,从而导致局部骨侵犯发生。     

反义RNA技术对抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因表达的研究

目的:应用反义RNA技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达,探索采用该技术干预肝癌的可行性。方法:制备人POLD1基因的反义RNA表达质粒,同时建立空白对照组与阴性对照组,由此将实验分为阴性对照组(转染空载体的SMMC-7721细胞)、空白对照组(肝癌细胞SMMC-7721)和实验组(转染人POLD1基因反义RNA表达质粒的肝癌SMMC-7721细胞)3组。MTT实验分析细胞增殖变化,并在转染SMMC-7721细胞48h后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测POLD1基因的表达。结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,转染了反义RNA的实验组细胞增殖受到明显抑制。在转染后24～72h,实验组吸光度24h为0.306 7±0.015 4,48h为0.459 2±0.033 2,72h为0.567 1±0.061 1,与空白和阴性对照组相比,P值均<0.05。实时荧光定量PCR实验显示,实验组POLD1的mRNA表达明显下调为0.142 5±0.020 5,阴性对照组为1.017±0.188,空白对照组为1.00±0.00(F=26.5,P<0.05),说明POLD1基因表达受抑制。蛋白质印迹实验显示,POLD1基因蛋白水平(p125)变化趋势与mRNA相同,均为下调,其中实验组为0.222 3±0.009 7,阴性对照组为0.237 9±0.005 9,空白对照组为0.235 4±0.003 4(F=1 365.754,P值均<0.05),说明反义RNA可抑制p125蛋白表达,结论与基因水平趋势一致。结论:针对POLD1基因设计的反义RNA体外抑制了肝癌细胞SMMC-7721的增殖,这与POLD1在基因和蛋白水平的表达下调有关。     

乳腺癌MRMT-1细胞局部骨转移大鼠模型的研究

目的 研究乳腺癌MRMT-1细胞局部骨转移大鼠模型在痛觉反应、影像学、病理学和分子生物学等方面的表现,为进一步的发病机制和药理学研究提供资料.方法 将32只雌性SD大鼠用随机数字表法分为假手术组和模型组各16只,在模型组大鼠胫骨内注射乳腺癌MRMT-1细胞,引起局部骨转移.造模后19d测定痛觉反应,21d处死大鼠取材,测定肿瘤体积,用X线对骨质损伤进行评分并测定骨密度（BMD）,HE染色观察病理形态改变,抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）法染色观察破骨细胞,免疫组织化学法检测核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和骨保护素（OPG）水平,并计算比值;实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）水平.结果 与假手术组比较,模型组存在痛觉异常状态（P＜0.01）;胫骨在X线下损伤评分较高（P＜0.01）.模型组和假手术组大鼠左侧胫骨的BMD分别为（0.11 ±0.01）g/cm2和（0.13±0.02）g/cm2（P＜ 0.05）.模型组胫骨标本上肿瘤生长明显,体积为（1082.73±679.44）mm3,而假手术组无肿瘤生长（P＜0.01）,病理可见混合性骨转移,但以溶骨性病变为主;伴有破骨细胞数量明显增多,达到（40.84±25.59）个/高倍视野,而假手术组仅为（1.88±2.92）个/高倍视野（P＜0.01）.转移灶局部RANKL水平无明显变化,OPG水平下降（P＜0.05）,OPG/RANKL比值和PTHrP下降（P＜0.05）.结论 乳腺癌MRMT-1细胞局部骨转移大鼠模型存在癌痛、骨质破坏,甚至病理性骨折等表现.其发病机制可能是MRMT-1细胞在浸润生长过程中打破了OPG-RANKL-RANK系统的平衡,从而激活破骨细胞,引起骨吸收作用亢进,引起各种表现.     

Indian Hedgehog表达量在大鼠骨关节炎早期变化的研究

目的 (1)探究大鼠创伤后骨关节炎(osteoarthritis,OA)早期进展中印度豪猪(Indian hedgehog,Ihh)基因表达量的变化;(2)探讨可否通过检测Ihh基因的表达量早期预测OA。方法 SD大鼠80只分8组:1个伪手术组(Sham)和7个实验组(ACLT),依次为1天组、3天组、7天组、2周组、4周组、2个月组、3个月组。RT-PCR检测关节软骨细胞Hh信号通路基因及基质金属蛋白酶13、十型胶原的m RNA表达水平;免疫组化检测关节软骨内Ihh蛋白的表达;ESLIA检测血清中Ihh蛋白浓度;印度墨水染色、番红O染色观察关节软骨退变情况和糖胺多糖含量。结果 Ihh的m RNA相对表达量先升后降,7天组(6.58±2.94)比Sham组(1.03±0.27)、1天组(1.71±1.01)、3个月组(2.40±1.81),明显升高(P0.05);免疫组化示Ihh蛋白在3天组、7天组呈褐黄色颗粒,且数目超过细胞总数的50%。血清中Ihh浓度同样先升后降,3天组(0.53±0.24)ng/ml比3个月组(0.17±0.06)ng/ml明显升高(P0.05),7天组(0.57±0.32)ng/ml比Sham组(0.21±0.08)ng/ml、3个月组(0.17±0.06)ng/ml明显升高(P0.05);3个月组基质金属蛋白酶13和十型胶原的m RNA相对表达量[(19.1±9.52)、(8.13±5.12)]较其它组明显升高(P0.05);印度墨水、番红O染色和X线可见1个月内关节完整光滑,3个月组关节严重破损,纤维增生。结论 (1)大鼠OA进展过程中Ihh基因的表达量在早期有明显的升高阶段;(2)血清中Ihh蛋白含量有望成为早期发现OA的便利手段。