HBVx转基因小鼠肝组织基因表达谱的微阵列研究

目的：研究乙肝病毒（HBVx)和黄曲霉素（AFB1）在诱发肝癌中的分子机理。方法：用Atlas^TM cDNA表达阵列方法比较研究HBx基因转基因小鼠HBVx基因整合（＋）和（－）的小鼠肝组织，以及转基因小鼠经AFB1一次攻击的肝癌组织的基因表达谱的差异。结果：经HBVX基因整合（＋）的小鼠肝组织的DNA修复基因，药物代谢酶基因以及应激反应的效应因子的cDNA基因表达谱显示了明显的变化。实验结果提出出现变异的30个cDNA基因表达谱中29个（96．7％），与X基因的整合相关及17个（56．7％）与AFB1的攻击有关，结论：HBF对宿主的感染，可能通过改变DNA修复系统和药物代谢酶系统来影响机体对AFB1的致癌敏感性，从而提高AFB1对肝组织的致癌效应。     

乙肝病毒对DNA修复基因和肝癌发生的作用

目的　以HBV转基因动物模型研究乙型肝炎病毒 (HBV) ,黄曲霉毒素 (AFB1) ,DNA修复基因和肝细胞肝癌 (HCC)发生的关系。方法　对HBVx基因转基因小鼠以相同的方式和剂量给予黄曲霉毒素 (AFB1)攻击 ,比较肝癌的发生率 ;同时用逆转录———热标记扩增 (RT -HOT -PCR)的方法 ,检查HBVx基因转基因小鼠HBVx整合阳性和阴性以及AFB1攻击后 ,癌组织与癌旁组织的DNA修复基因Brca2和Nthl1的RNA表达水平。结果　 (1)黄曲霉毒素诱导 ,5 2周肝癌发生率HBVx整合阳性小鼠 2 9只 ,14只发生肝癌 (48.3% ) ;HBVx整合阴性小鼠 15只 ,3只发生肝癌 (2 0 .0 % )。两者有显著的差异 (P <0 .0 1)。(2 )HBVx整合阳性小鼠的肝组织DNA修复基因Brca2和Nthl1的RNA表达水平都低于HBVx整合阴性小鼠。经AFB1攻击形成的肝癌和癌旁组织 ,其DNA修复基因Brca2和Nthl1的RNA表达水平也低于HBVx整合阴性小鼠。结论　结果表明HBVx在宿主细胞的整合 ,影响了宿主DNA修复能力 ,从而导致宿主对致癌物质的敏感性增加 ,最终引起肝癌发生率的增加。     

HBV和AFB1在树鼩肝癌发生中的作用

目的 :探讨乙肝病毒 (HBV)和黄曲霉毒素B1(AFB1)在肝癌形成中的作用及机理。方法 :用免疫组化、原位杂文及印迹杂交检测树鼠句肝和肿瘤组织。结果 :两次实验中 ,感染HBV又摄入AFB1的A组树鼠句肝细胞癌(HCC)发生率分别为 5 2 94%和 6 6 7% ;单纯感染HBV的B组分别为 11 1%和 0 ;只摄入AFB1的C组分别为 12 5 %和 30 % ;空白对照组D均无HCC发生。A组HCC的发生率均显著高于各组 (P <0 0 5 )。癌前病变r GT灶的个数及面积也如此。IGF Ⅱ的过表达与HCC发生密切有关 ;HBV和AFB1可协同激活ras基因 ;c myc主要参与HCC的演进 ,CDK4参与了HCC的发生和演进过程。这两种基因的改变与HBV感染有关。结论 :HBV能诱发肝癌前病变和肝癌 ,并与AFB1有协同致肝癌作用。在树鼠句肝癌形成过程有多种基因的改变     

不同因素诱发的树齮肝癌组织的基因表达差异

背景与目的：以往用基因芯片技术筛选肝癌相关基因的研究一般以癌旁组织作为对照与肝癌组织比较,但肝癌的癌旁组织常含有肝炎、肝硬化、增生结节等病变。为了探讨肝癌发生的分子机制及有关的基因改变,本研究用树鼩动物模型对病因不完全相同的两组动物的肝癌和其自身的癌发生前活检肝组织进行基因表达水平的比较。方法：实验树鼩分两组,黄曲霉紊B1(aflatoxin B1,AFBl)组单纯喂AFBl,HBV AFBl组先感染人乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),然后喂AFB1。实验期间定期抽血检查HBV感染标志,并剖腹取肝组织活检。动物出现肝癌后,两组各取2例肝癌组织及其冷冻保存的癌发生前活检肝组织,用cDNA微阵列技术检测、比较各例肝癌组织和其相应癌发生前活检肝组织的基因表达水平,分析不同病因的两组肝癌组织的差异表达基因的异同。结果：肝癌发生率在AFB1组和HBV AFB1组分别为73．3％和77．8％。两组肝癌组织都有较大量的基因发生表达水平的改变,但在AFB1组以上调改变为主,在HBV AFB1组以下调改变为主。在受测的588个(16个功能组)已知与人类肿瘤有关的基因中,两组有相同改变的基因共11个,它们主要分布在3个功能基因组,即凋亡相关蛋白组,DNA合成、修复和重组蛋白组以及生长因子、细胞因子和趋化因子组。结论：HBV对单纯AFB1引起的基因表达改变有一定影响。     

乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露因素下肝癌13号染色体畸变以及RB1基因表达的初步研究

目的探讨乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露下肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)13号染色体遗传学改变的特点,以及对定位于13q14.2基因座位点抑癌基因RB1的影响。方法 32例手术切除且经病理证实为HCC的癌组织,按照乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,分为4个亚组:A组HBV(+)/AFB1(+)10例;B组HBV(+)/AFB1(-)10例;C组HBV(-)/AFB1(+)6例;D组HBV(-)/AFB1(-)6例。应用微阵列比较基因组杂交技术(ArrayCGH)检测包括13号染色体在内的23对染色体区段的变化情况,并通过RT-PCR检测RB1mRNA的表达情况。结果 32例中有15例染色体13q14.2发生缺失,缺失率为46.9%(15/32)。13q14.2缺失的发生频率在A组、B组、C组、D组中分别为80.0%(8/10)、50.0%(5/10)、33.3%(2/6)和0%(0/6)。其中A组分别与C组、D组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);B组与D组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测显示RB1mRNA的表达半定量灰度值在13q14.2缺失组中显著低于13q14.2无缺失组(P=0.003)。结论染色体13q畸变在HCC中是一个常见的分子生物学事件,其中13q14.2的缺失可能与HBV和AFB1双暴露的协同作用有关,HCC中13q14.2的缺失是导致RB1基因失活的因素之一。     

广西乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露人肝细胞癌中PTEN mRNA表达及突变的初步研究

目的探讨乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露相关肝细胞性肝癌(HCC)中PTEN基因的突变特点及其mRNA的表达水平。方法 108例HCC来自广西不同地区样本,按照乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,分为4个亚组:A组:HBV(+)/AFB1-DNA(+),共48例;B组:HBV(+)/AFB1-DNA(-),共27例;C组:HBV(-)/AFB1-DNA(+),共19例;D组:HBV(-)/AFB1-DNA(-),共14例。采用PCR联合基因直接测序法,检测108例肝癌组织中PTEN基因第4、5、8外显子的突变情况。同时采用RT-PCR法检测其基因mRNA的表达状况。结果①PTEN基因第4、5、8外显子测序结果未发现发生在外显子上的突变。但在第4外显子与第4内含子交界处有61例发生大片段的缺失,缺失率为56.4%。②PTEN缺失率在A、B、C、D组中分别为60.4%、62.9%、47.3%和46.6%,其差异在4个亚组间均无统计学意义(P>0.05)。③PTEN mRNA在4个亚组中的表达半定量灰度值分别为:A组:0.54±0.13;B组:0.59±0.16;C组:0.97±0.16;D组:0.92±0.13。其中,A、B组分别与C、D组相比,其差异均具有统计学意义(PAC=0.002,PAD=0.032,PBC=0.000,PBD=0.011)。结论在广西乙型肝炎病毒/黄曲霉毒素B1的双暴露肝细胞癌中,PTEN mRNA的表达下调是一个常见的分子生物学事件,PTEN mRNA表达下调可能主要与HBV感染有关。AFB1对PTEN mRNA的表达下调可能有协同作用。     

SPRIDA对小鼠H_(22)肝癌相关基因表达谱的影响

目的 研究SPRIDA(施普睿达)对荷H_(22)肝癌小鼠基因表达的调节差异,探讨SPRIDA治疗小鼠肝癌的可能机制.方法 运用基因表达谱芯片技术检测SPRIDA对荷瘤小鼠的基因表达调节,并对差异基因进行Patlaway聚类和统计分析.结果 SPRIDA作用前后表达有差异的基因共358条(占芯片基因总数的8.74%),其中172条(172/41)96,4.20%)基因表达上调,186条(186/4096,4.54%)基因表达下调.经Pathway聚类分析,表达差异基因主要属于细胞凋亡、细胞周期、NK细胞介导的细胞毒、细胞黏附分子、肿瘤生长因子β、Wnt等信号通路.结论 SPRIDA主要是通过影响肿瘤细胞周期进程、调节肿瘤细胞凋亡和黏附相关基因的表达等多种途径抑制肿瘤的增殖和转移.     

广西黄曲霉毒素高危区肝癌p53基因序列改变

目的　检测广西肝细胞癌 p53基因的序列改变。方法　 4 0例肝细胞性肝癌 ( HCC)分两组 :一组 2 6例 ,来自广西扶绥地区已知 HCC、黄曲霉毒素 ( AFB1)和乙型肝炎病毒 ( HBV)高危区 ;对照组 14例 ,来自广西玉林地区 ,该地 HCC和 HBV高危 ,但 AFB1可能低 ,因居民以低 AFB1的大米为主食。第七外显子直接测序。 p53蛋白和 HBs Ag免疫染色。结果　扶绥组 16/ 2 6例 ,占 61.5% ,2 4 9密码子第三号位 G→ T颠换 ,形成公认的突变热点。玉林组仅在贵港地区 p53突变集中在热点 ,为 3/ 5例 ,其他地区第七外显子突变点则分散在不同位点。全组 38/ 4 0例 HBs Ag( ) ,占 95%。结论　除启东和南部非洲外 ,世界上第三个 AFB1高危区肝癌 p53基因出现特异突变位点。已知肝癌 p53基因突变发生在这热点则提示该地 AFB1高污染。 HBV常伴随这些基因改变。     

健脾理气合剂阻抑黄曲霉毒素B_1启动小鼠致肝癌机理

目的　探讨健脾理气合剂阻抑AFB1启动小鼠致肝癌的机理。　方法　选择2月龄ICR小鼠50只,随机分成两组:中药组与对照组。每组25只。预先予中药组小鼠灌服健脾理气合剂,每天25g/kg,共15天。16天时,给予AFB11mg/kg,腹腔内注射。用RIA法测定两组小鼠暴露AFB1后0、05、1、2、4、8、24h共7个不同时相肝脏AFB1DNA加成物的含量,并检测与AFB1代谢相关的两相酶系活性。　结果　健脾理气合剂能使小鼠暴露AFB1后高峰时相(1h)的肝脏AFB1DNA加成物水平显著降低(3491±481比4136±282pmol/mgDNA,P<005)。该合剂能诱导小鼠肝脏P450还原酶活性(15107±2889比9593±2642nmol/L细胞色素C/min/mg蛋白,P<001)及GST活性(804±082比595±081μmol/L产物/min/mg蛋白,P<001),并能提高肝脏GSH的含量(10164±0772比8032±0828nmol/g肝组织,P<001)。　结论　健脾理气合剂能通过增强小鼠肝脏Ⅰ相及Ⅱ相解毒酶功能、减少肝脏AFB1DNA加成物形成,而阻抑AFB1启动致肝癌作用。     

CYP3A4在黄曲霉毒素B1诱发大鼠肝癌过程中的表达及意义

探讨CYP3A4在黄曲霉毒素B1（AFB1）实验诱发大鼠肝癌过程中的活性变化及其在肝癌发生过程中的意义。方法:雄性、4周龄、Wistar大鼠随机分为AFB1组和对照组;AFB1组腹腔注射AFB1,对照组则给与溶媒二甲基亚砜。在诱发肝癌过程中,分别于第13、23、33、43、53、63周对大鼠进行肝活检;实验至第73周处死全部动物取肝组织;利用大鼠肝组织微粒体混合酶体外代谢体系,采用荧光分光光度定量法动态检测肝标本中CYP3A4酶活性。结果:AFB1组肝细胞癌发生率为58.8%（10/17）;对照组肝细胞癌发生率为0（0/16）,两组间肝癌发生率比较,AFB1组显著高于对照组（P=0.001）。两组大鼠肝组织代谢酶CYP3A4活性都有不同程度的变化。肝组织CYP3A4活性从13 w开始逐渐升高,至23 w达顶峰,然后逐渐降低,到43 w又升高,出现双波峰变化;从13 w至53 w不同时段AFB1组肝组织CYP3A4活性显著低于对照组（P<0.01）。但是至63 w时AFB1组肝组织CYP3A4活性基本接近对照组（P=0.5086）。结论:CYP3A4活性在AFB1诱癌过程中受到抑制,可能是由于癌变早期的细胞减少对致癌物质的活化有关;CYP3A4活性在AFB1诱癌过程中的表达起伏变化,是由于基因多态性较大程度上影响蛋白表达水平的结果。      

中国高发区肝细胞癌中HBVx基因的广泛存在及与p53基因249密码子高 …

目的 乙肝病毒（ＨＢＶ）是肝细胞癌（ＨＣＣ）的主要病因。ＨＢＶ中的ｘ基因被认为是它的癌基因。为确定ｘ基因在肝癌癌变中的重要性,我们主要针对ＨＢｓＡｇ阴性的ＨＣＣ,研究ＨＢＶｘ基因的存在、表达和突挛情况;同时也对ｘ基因与Ｐ５３基因２４９密码子热点突变的相关性进行了分析。方法 应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＤＮＡ序列分析方法,重点针对１９９１年－１９９６年在启东北京手术的的、病理确诊为Ｈ     

Minisatellite rearrangements are increased in liver tumours induced by transplacental aflatoxin B1 treatment of hepatitis B virus transgenic mice, but not in spontaneously arising tumours

Transgenic mice carrying an integrated subgenomic human hepatitis B virus (HBV) DNA fragment coding for the viral envelope polypeptides, represent a model for the study of the mechanisms involved in hepatocarcinogenesis. The mice develop a progressive liver injury characterized by inflammation, regenerative hyperplasia and dysplasia terminating in hepatocellular carcinoma (HCC) at around 18-21 months of age. No alterations in specific oncogenes and tumour suppressor genes in the HCC arising in this transgenic model have been observed. However, onset of liver tumours is significantly earlier in mice treated with aflatoxin B1 (AFB1). In order to examine more generally for genetic rearrangements during the natural history of the disease, DNA multilocus fingerprinting was performed using probes recognizing mouse minisatellites. Liver tumour samples from HBV transgenic mice either untreated or treated with AFB1 transplacentally were included in the study. In a total of 28 tumour samples from HBV transgenic mice receiving no carcinogen treatment, using three minisatellite probes, no alterations were detected. The frequency of rearrangements using any one of the three probes is calculated to be below 0.2%. This result demonstrates that genetic instability in minisatellite sequences is not a common event associated with HBV gene expression and liver injury in this model. In 11 liver tumours from mice exposed to AFB1 transplacentally six had minisatellite alterations (band gains and losses) revealed by at least one of the three probes used. The frequency of rearrangements was between 1.1% and 2% depending on the minisatellite probe. These data show that genetic alterations can be induced by transplacental exposure to AFB1 and suggest that genetic instability could be important in hepatocarcinogenesis with combined exposures to AFB1 and HBV.      

Expression of ras gene in experimental hepatocarcinogenesis in tree shrews

Objective: In order to investigate the relationship between the expression of ras gene and the development of hepatocellular carcinoma (HCC). Materials and Methods: The experimental tree shrews were divided into four groups: group A, infected human hepatitis B virus (HBV) and exposed to aflatoxin B1 (AFB1); group B, infected human HBV alone; group C, only exposed to AFB1; group D, use as controls. The serial bioptic liver tissues were detected for ras p²¹ protein using immunohistochemical method. Results: The total p²¹ protein positive rates in group A, B, C and D were 35.3%, 5.3%, 13.3%, 0, respectively, thus the significant difference were showed between group A and group B (P<0.05); The HCC incidences in group A, B, C and D were 47.1%, 0, 13.3%, 0, respectively, and there was a significant difference between group A and C (P<0.05). The incidences of HCC in the animals with and without p²¹ protein positive in group A were 100% and 18.2%, respectively, and there was a significant difference among them (P<0.01). Conclusion: HBV and AFB1 play a remarkable synergistic role in the development of HCC; they can enhance the expression of ras gene. The over-expression of ras gene is closely related to pathogenesis of HCC in tree shrews. This study was supported by National Natural Science Foundation of China (No. 39260033).     

广西乙肝病毒／黄曲霉毒素B1双暴露人肝细胞癌中PTENmRNA表达及突变的初步研究

目的探讨乙肝病毒／黄曲霉毒素B1双暴露相关肝细胞性肝癌（HCC）中PTEN基因的突变特点及其mRNA的表达水平。方法108例HCC来自广西不同地区样本,按照乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,分为4个亚组：A组：HBV（＋）／AFB1-DNA（＋）,共48例;B组：HBV（＋）／AFB1-DNA（-）,共27例;C组：HBV（-）／AFB1-DNA（＋）,共19例;D组：HBV（-）／AFB1-DNA（-）,共14例。采用PCR联合基因直接测序法,检测108例肝癌组织中PTEN基因第4、5、8外显子的突变情况。同时采用RT—PCR法检测其基因mRNA的表达状况。结果（1）PTEN基因第4、5、8外显子测序结果未发现发生在外显子上的突变。但在第4外显子与第4内含子交界处有61例发生大片段的缺失,缺失率为56.4％。②PTEN缺失率在A、B、C、D组中分别为60．4％、62．9％、47．3％和46．6％,其差异在4个亚组间均无统计学意义（P〉0．05）。@PTENmRNA在4个亚组中的表达半定量灰度值分别为：A组：0．54±0．13;B组：0．59±0．16;C组：0．97±0．16;D组：0．92±0．13。其中,A、B组分别与C、D组相比,其差异均具有统计学意义（PAC=0．002,PAD=0．032,PBC=0．000,PBC=0．011）。结论在广西乙型肝炎病毒／黄曲霉毒素B1的双暴露肝细胞癌中,PTENmRNA的表达下调是一个常见的分子生物学事件,PTENmRNA表达下调可能主要与HBV感染有关。AFB1对PTENmRNA的表达下调可能有协同作用。     

乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露相关性肝细胞癌的p53基因249位点突变与p53蛋白表达的关系

目的研究乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露相关性肝细胞癌的p53基因249位点突变与p53蛋白表达关系。方法通过IHG特殊免疫组织化学法检测55例手术切除经病理证实为原发性肝癌的HCC组织及10例正常肝组织中AFB1-DNA加合物的暴露情况,并根据是否同时存在HBV暴露加以分组,通过免疫组化S-P法检测并比较各组间p53蛋白的表达情况。同时,通过PCR结合直接测序的方法检测其p53基因第7外显子249密码子的突变情况。结果 p53基因第7外显子249位点的突变在实验组A与对照组C中均具有较高阳性突变率,其突变率分别为68.75%（22/32）、63.64%（7/11）,在对照组B中的突变率较低,为16.67%（2/12）,在正常对照组中无1例出现有突变。其中实验组A与对照组B及正常对照组D的比较差异具有统计学意义（P〈0.05）,而与对照组C比较差异无统计学意义（P〉0.05）;p53蛋白在其基因249位点突变阳性组与阴性组中的表达阳性率分别为92.86%（26/28）、60.87%（16/27）,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 HCC的发生过程中,AFB1暴露与p53第7外显子249位点的突变密切关系相关,当同时存在乙肝病毒暴露的协同作用的情况下突变率更高;p53基因的突变可能是造成HCC中p53蛋白高表达的重要因素之一。     

p16影响乙肝病毒相关性肝细胞肝癌的发生

目的　探讨乙肝病毒 (HBV)基因整合和p16基因表达改变及其与肝细胞肝癌发生发展的关系。方法　 35例肝癌及癌旁肝组织为标本 ,采用聚合酶链式反应 (PCR)及Southernblot检测HBVX基因整合 ,以单链构象多态性分析确定p16基因突变 ,以RT PCR检测p16mRNA ,以Westernblot检测p16蛋白。结果　肝癌中X基因整合与p16mRNA及蛋白表达相关 (P <0 .0 5 ) ,肝癌及癌旁肝组织中p16蛋白表达缺失率分别为 6 2 .9%和 4 0 .0 % ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ;癌组织中p16蛋白表达缺失与肝癌分化程度、癌细胞浸润有相关性 (P <0 .0 5 )。结论　X基因整合与p16蛋白缺陷有关 ,p16改变在肝细胞癌变各阶段发挥重要作用 ,并与肝癌的演进和侵袭有关。