基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌

目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。     

沙门菌invA基因荧光定量PCR检测

沙门菌是引起食源性感染的常见致病菌^[1],常规检测方法有分离培养、生化鉴定、血清学试验等.由于沙门菌有2 000多种血清型,因而监测工作多繁琐、费时、费力.实时荧光定量PCR检测技术是近年来的新方法,已经愈来愈多地用于病原体诊断^[2].研究表明,沙门菌侵袭基因invA高度保守,几乎存在于沙门菌所有血清型中,其编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白,决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力,与其致病性显著相关^[3].根据这一特点,为探讨快速、敏感、稳定的沙门菌检测方法,本研究应用沙门菌侵袭基因invA设计引物和探针序列,建立沙门菌荧光定量检测方法并研制沙门菌检测试剂盒.     

A型肉毒梭菌atx基因TaqMan探针荧光定量PCR检测

目的采用TaqMan探针荧光定量PCR方法对A型肉毒梭菌atx基因进行检测。方法以atx基因为靶基因,设计引物和TaqMan探针,优化反应条件,制作定量标准曲线,进行灵敏度、特异性和重复性验证,建立A型肉毒梭菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果构建质粒pUC57-△atx,标准曲线在10³～10³拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度达到22个拷贝数,比普通PCR提高约100倍;能选择性检测A型肉毒梭菌,与其他5种食源性病原菌无交叉反应,结果与普通PCR一致;重复性试验表明,同一浓度的15个平行样品的变异系数为1.0%。结论 A型肉毒梭菌TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以快速、准确、定量地检测A型肉毒梭菌。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立一种快速、灵敏、准确的检测方法,预防沙门菌食物中毒。[方法]根据沙门菌保守基因序列fimY基因设计合成了引物和TaqMan探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。[结果]其检测灵敏度达到4．5efu,比常规PER高100倍,而且稳定性良好,冷冻至少可以保存9个月。[结论]通过临床样品的检测,该试剂盒具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性强等优点,很适合大量样品的检测。     

实时荧光PCR方法检测水产品中沙门菌

[目的]探索沙门菌快速检验法，加快水产品检验检疫通关速度，促进外经贸经济的发展。[方法]用深圳太太基因工程有限公司提供的沙门菌实时荧光PCR试剂盒对水产品样本进行检验。[结果]用实时荧光PCR从多个水产品样品的增菌液中检出9份样品沙门菌阳性，用传统的微生物生理生化培养法从该9份样品中分离出9株沙门菌。根据血清分型、API鉴定和荧光PCR结果，确认所分离的菌株中有沙门菌B群3株、C1群4株、D群1株、其他群1株。[结论]实时荧光PCR方法在沙门菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势，有利于提高沙门菌的检出率，具有广阔的运用前景。     

荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定中的应用

[目的 ]　用taqman技术建立沙门菌荧光定量聚合酶链反应 (PCR)检测方法 ,尝试快速、准确地鉴定沙门菌。　 [方法 ]　根据沙门菌GenBankAccessionNOU2 5 3 5 2基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。将PCR扩增的沙门菌基因片段克隆导入载体 ,构建的重组质粒经筛选、鉴定后 ,作为阳性模板 ,用于标准曲线的制定。利用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术进行各类菌株的定性鉴定。　 [结果 ]　应用重组质粒制作的定量曲线 ,其循环阈值与模板浓度的对数值具有良好的线性关系 ,相关系数为 0 .999。检测各类菌株 ,其中沙门菌 41株、H抗原丢失的沙门菌 16株均阳性 ;非沙门菌 10 9株均阴性。　 [结论 ]　建立了鉴定沙门菌的荧光定量PCR方法 ,该方法简便、快速、准确 ,有很好的应用前景和研究价值     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法检测沙门菌的比较

目的:比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法检测沙门菌的灵敏度与特异性。方法:采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR方法,同时对沙门菌等细菌进行检测。结果:实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达33 cfu/m l,且有很高的特异性,对金黄色葡萄球菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是2种方法中最为快速敏感的方法,适用于临床实验室的快速诊断。     

多重荧光定量PCR检测沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌

目的基于SYBR Green I染料建立沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌的多重荧光定量PCR检测方法。方法针对沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因和virA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和femA基因片段设计引物,根据Tm值的差异分析确定荧光定量PCR扩增的靶基因和特异性引物,通过优化PCR反应体系,建立了用SYBR GreenⅠ多重荧光定量PCR熔解曲线来检测多种致病菌的方法。结果该方法检测的菌液灵敏度分别是沙门菌168 CFU/ml,志贺菌136CFU/ml,金黄色葡萄球菌1240CFU/ml,特异性强,整个过程只需要2h。结论该方法能快速、灵敏、特异检出沙门菌、志贺菌和金黄色葡萄球菌。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

Detection of Saccharopolyspora rectivirgula by quantitative real-time PCR

The thermophilic actinomycete species Saccharopolyspora rectivirgula has been associated with the exogen allergic alveolitis (EAA). EAA is caused by the inhalation of high amounts of airborne spores that can be found for example in environments of agricultural production, compost facilities, mushroom cultivation rooms, or rooms with technical air moistening. Because of the medical relevance of S. rectivirgula, a reliable detection system is needed. Therefore, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) primer system was designed, targeting the 16S rRNA gene of the type strain S. rectivirgula DSM 43747(T) and six other S. rectivirgula reference strains. Our investigation showed that S. rectivirgula presumably own four operons of the 16S rRNA gene, which has to be considered for estimation of cell equivalents. Furthermore, the DNA recovery efficiency from these strains was tested in combination with bioaerosol or material sample as well as the influence of non-target DNA to the recovery rate. Results showed a recovery DNA efficiency of 7-55%. The recovery rate of DNA in a mixture with non-target DNA resulted in ～87%. In summary, a high amplification efficiency using real-time PCR was found, for which estimated concentrations revealed cell numbers of 2.7 × 10(5) cells m(-3) in bioaerosol and 2.8 × 10(6) cells g(-1) fw(-1) in material samples from a duck house. The specificity of the new developed quantification system was shown by generation of two clone libraries from bioarosol samples, from a duck house, and from a composting plant. Totally, the results clearly show the specificity and practicability of the established qPCR assay for detection of S. rectivirgula.     

荧光定量PCR技术用于快速检测水痘-带状疱疹病毒的研究

目的:建立特异、灵敏、高效的TaqMan荧光定量PCR方法用于水痘-带状疱疹病毒(VZV)的快速检测。方法:从GenBank下载几十株VZV基因序列进行同源性比对,选取高度保守区ORF62(编码即刻早期蛋白IE62)设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针,并对反应体系与反应条件进行优化,同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果:本方法对VZV的检测具有高度特异性,与肠道病毒EV71型,柯萨奇A、B组,麻疹病毒,风疹病毒,流感病毒以及相关腺病毒B、C组等均无交叉反应;检测灵敏度达36 copies/μl;反应体系具有很高的稳定性;整个操作过程仅需3 h～4 h。采用该方法对9份疑似VZV患者标本进行检测均为阳性,检测灵敏度明显高于病毒分离法、普通PCR法。结论:本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、高效,适用于VZV早期感染病例的快速确认以及暴发疫情的应急诊断中。     

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的：建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法.方法：针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析.结果：应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异.结论：该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测.     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

荧光实时定量PCR检测溶藻弧菌方法的建立

目的 建立荧光实时定量PCR(qPCR)定量检测溶藻弧菌的方法,检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法 选择溶藻弧菌的鞭毛基因fliC为目的基因设计探针引物,建立Taqman探针qPCR体系。采用双盲法设计,分别用qPCR和Biolog Microstation System对溶藻弧菌和10株相关细菌进行鉴定,以考核qPCR检测体系的特异性。同时,通过梯度稀释和绘制标准曲线,评价利用qPCR检测溶藻弧菌的灵敏度。结果 本试验建立的qPCR方法能特异、准确、快速鉴定溶藻弧菌,敏感度达102CFU/ml。结论 qPCR方法能够有效快速检测溶藻弧菌。     

Taqman实时定量PCR检测产毒艰难梭菌方法的建立

目的 建立以毒素基因A/B为靶基因的产毒艰难梭菌的快速定量检测方法.方法 通过设计艰难梭菌毒素A/B基因的特异引物及探针,建立标准产毒菌株DNA(ng)含量与Ct值的标准曲线.结果 该方法仅对产毒艰难梭菌进行特异性扩增,11种其他常见的致病菌及非产毒艰难梭菌均不能扩增; tcdA和tcdB基因扩增标准曲线线性关系R值分别为0.9975、0.9984,检测低限均为2.5×10-3ng.结论 该研究建立的方法具有快速、灵敏、特异性高等优点,可用于艰难梭菌毒素基因的定量检测.     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

荧光定量PCR检测细菌NDM-1基因方法的探讨

目的:将Taqman荧光定量PCR技术与SYBRGreen染料RT-PCR技术比较后,应用于检测细菌NDM-1基因。方法:使用Taqman荧光定量PCR方法与SYBRGreen染料RT-PCR对已知特性的标准株中NDM-1基因检测,对比其扩增灵敏度。结果:Taqman荧光定量PCR技术灵敏度高于SYBRGreen染料RT-PCR法,所测标准株中NDM-1基因转录水平可高达7.5×104拷贝/μl,比SYBRGreen染料RT-PCR技术检测灵敏度高7.8倍。结论:Taqman荧光PCR技术对超级耐药菌NDM-1基因具有较高的敏感性和准确性,可以作为对超级细菌进行监控与防控的方法。