终点平衡尿酸酶法与动力学尿酸酶法联用测定尿酸

目的:考察终点平衡尿酸酶法和动力学尿酸酶法联用测定尿酸的可行性和线性范围.方法:在25℃下1.2 ml硼酸钠缓冲液(0.20 mol/L,pH 9.2)中用293 nm吸收跟踪尿酸酶反应;测定加入5 μl尿酸酶液前反应体系吸收,加入5 μl苛求芽孢杆菌尿酸酶液后记录5.0 min内吸收变化.终点平衡法以尿酸酶反应前吸收为起点而尿酸完全氧化后吸收为本底,二者之差为尿酸净吸收且同尿酸浓度成正比;动力学法分析尿酸酶反应过程预测本底.分析模拟尿酸酶反应曲线,探索从终点平衡法转换为动力学法的尿酸浓度界限值;实验测定联用法的可行性和线性范围.结果:分析40 U/L苛求芽孢杆菌尿酸酶模拟反应曲线,发现两种方法转换的尿酸浓度界限值可为5.0 μmol/L;分析实验反应曲线证实此界限值可行.在40 U/L尿酸酶时终点平衡法测量范围1.0~6.0 μmol/L;联用法测量范围1.5~60 μmol/L且对30 μmol/L黄嘌呤有抗性;在5.0 μmol/L以下变异系数小于10%而5.0 μmol/L以上可小于5%.结论:这种联用法测定尿酸成本更低、线性范围更宽且效率高.     

在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性

目的:以尿酸酶为模型,考察在底物浓度高于酶米氏常数(Km)时用积分法测定酶活性(Vm)的可靠性. 方法:用293 nm光吸收记录尿酸酶反应曲线. 用以反应时间为自变量的积分速度方程,以尿酸酶Km为常数而本底为非线性参数拟合尿酸酶反应曲线,搜寻对应最好拟合的Vm. 结果:此积分法测定Vm主要受剩余底物浓度影响,本底基本没有干扰. 剩余底物低于2.5 μmol/L时用10～70 μmol/L起始底物所得Vm无差异. 用25和70 μmol/L起始底物浓度时初速度和Vm都与酶量呈正比. 在此两种底物浓度下积分法的下限相同,且与初速度法下限无明显差异. 但用积分法测定酶活性的上限明显高于初速度法,而且起始底物浓度越低则差异越显著. 结论:在积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线,在高于Km的底物浓度下能可靠测定酶活性.     

尿酸酶在用氧嗪酸建立高尿酸血症模型大鼠体内的降尿酸作用

目的:用尿酸酶抑制剂氧嗪酸建立高尿酸血症大鼠模型,考察尿酸酶的体内降尿酸作用.方法:大鼠腹腔注射氧嗪酸钾建立高尿酸血症大鼠模型,尿酸酶滤菌后尾静脉注射给药;大鼠眼眶静脉采血,据对尿酸酶Vm/Km的改变测定血浆尿酸酶抑制剂含量,动力学尿酸酶法测定血浆尿酸水平.结果:每天腹腔注射氧嗪酸钾持续7 d后,大鼠血浆尿酸可维持在0.40mmol/L以上,但大鼠体内尿酸酶抑制剂也维持在很高水平.持续给予氧嗪酸钾21 d,每只大鼠给予0.5 U聚乙二醇修饰尿酸酶,配对t检验发现血浆尿酸有统计显著性下降,但降幅小于12%;给予低剂量或未经修饰尿酸酶则血浆尿酸水平无显著变化.结论:用尿酸酶抑制剂建立的高尿酸血症动物模型评价尿酸酶的降尿酸作用可靠性有限.     

静脉注射尿酸酶多囊脂质体的药代动力学和药效学研究

目的 研究尿酸酶多囊脂质体（uricase-multivesicular liposomes, UOMVLs）在大鼠体内的药代动力学,并与游离尿酸酶（uricase, UOX）进行药代动力学和药效学比较。 方法 采用复乳法制备UOMVLs,检测UOMVLs包封率、粒径和Zeta电位。将12只健康雄性SD大鼠随机分为2组,分别静脉注射UOMVLs和UOX进行干预治疗,测定给药后不同时间点大鼠血清中尿酸酶的活性,用DAS 2.1.1软件进行药代动力学参数计算。另取24只雄性SD大鼠,模型组采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾建立高尿酸大鼠模型（n=6),UOMVLs组（n=6)和UOX组（n=6)分别于建模后1 h静脉注射1 mL （0.47 U/mL）UOMVLs和游离UOX,并以正常组（n=6)为对照,于建模后1、2、3、5、7、9、12、24、36、48 h测定大鼠血清中尿酸水平。对其降尿酸作用进行考察。 结果 制备的UOMVLs包封率为（63.75 ± 3.65）%,粒径为（22.56 ± 1.70） μm,Zeta电位为（-41.81±6.59） mV。大鼠静脉注射UOMVLs和UOX后,药时曲线下面积（AUC0-∞）分别为（498.83±58.85）和（28.49±9.95） U/L·h;达峰时间（tmax） 分别为（1.00±0.00）和（0.00±0.00） h;峰浓度（Cmax） 分别为（73.04±6.35）和（31.00±6.03） U/L;半衰期（t1/2）分别为（3.49±0.80）和（1.17±0.33） h;UOMVLs相对于UOX的生物利用度为（1 750.90±206.56）%。 UOMVLs和UOX药效学特性分析显示,UOMVLs干预治疗9 h大鼠血尿酸水平降至正常组水平,而UOX干预治疗48 h大鼠血尿酸水平才与模型组一样降至正常组水平。结论 将UOX制备成UOMVLs后tmax延后,t1/2延长,生物利用度明显提高;UOMVLs比UOX更有效降低高尿酸模型大鼠血清中尿酸水平。     

用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用

目的: 以Candida species尿酸酶为模型,考察用积分法筛选抑制剂的条件. 方法: 用293 nm吸收记录尿酸酶反应. 用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant, Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki). 结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物<1/6 Kmapp而起始底物足够高,此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20%而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3),也与双倒数法一致. 结论: 被分析数据精度足够高,用无抑制剂时米氏常数(Michaelis-Menten constant, Km)4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6 Km,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.     

低于米氏常数底物浓度下酶动力学参数的测定

目的：联用设定底物浓度下初速度（initial velocity,Vi）和过程分析法所得酶最大反应速度（maximal reaction rate,Vm）与米氏常数（Michaelis-Menten constant,Km）比值（Vm/Km）,据米氏方程推算酶的Km和Vm。方法：以苛求芽孢杆菌尿酸酶（Bacillus fastidious uricase,BFU）及其突变体（A1R,A1R/V144A ）、牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIAP）及大肠杆菌碱性磷酸酶突变体R168K为模型。用A293 nm记录尿酸酶反应曲线、A450 nm记录碱性磷酸酶水解4-硝基-1-萘基磷酸酯（4-ni－tro-1-naphthyl phosphate,4NNPP）反应曲线;以反应时间为自变量、用积分速度方程拟合不超过10% Km初始底物浓度下酶反应曲线测定Vm/Km,分析设定底物浓度下初速度反应数据确定初速度Vi;据相同酶量Vi和Vm/Km按米氏方程计算Km;据所得Vm/Km和Km推算Vm。结果：以E-H（Eadie-Hofstee）法分析50%~200% Km底物浓度下Vi所得Km均值为其参考值;联用策略测定Vi所设定的底物浓度越高,则所得Km相对偏差越小;测定Vi所设定的底物浓度从35% Km逐渐升高到120% Km,所得Km趋于稳定且相对偏差不超过20%。据此联用策略发现,苛求芽孢杆菌尿酸酶在生理pH下活性降低的原因不是其Km明显升高,而是其Vm下降。结论：当底物溶解度低于Km时,这种联用策略更适合测定酶的Km和Vm。     

汕头市区健康成人血清尿酸浓度调查

目的　了解本地区人的血清尿酸水平及与其它地区的差异。方法　采用“尿酸酶 -过氧化物酶偶联法”调查本地区健康成人的血清尿酸浓度。结果　男性为 ( 4 0 6.8± 71 .4)μmol/L ,女性为 ( 338.6± 62 .3)μmol/L。结论　本地区的健康成人血清尿酸浓度明显高于内地地区 ,且存在性别、年龄之间的差别 ,有必要建立不同地区的参考范围。     

不同方法测定黄嘌呤对Bacillus fastidiosus胞外尿酸酶抑制效力的比较

筛选酶抑制剂常需测定米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）来确定抑制常数（Ki）.双倒数分析法测定Ki效率低,且靶酶Km越高则成本越高.积分法和线性动力学法[5,6]测定Ki所需底物浓度都高于Km,至今对高Km靶酶都测定极低底物浓度下的半抑制浓度,或再换算成抑制常数表示抑制效力.但测定低浓度底物下的初速度要求高灵敏度的定量方法.实际上在低浓度底物下用简化积分法也可测定Ki.Bacillus fastidiosus胞外尿酸酶Km接近0.2 mmol/L,黄嘌呤是其竞争性抑制剂.本文用低浓度尿酸,比较测定初速度确定黄嘌呤半抑制浓度和简化积分法测定黄嘌呤抑制常数的差异.     

复方芪苓配方颗粒对尿酸性肾病模型大鼠作用机制研究

目的研究复方芪苓配方颗粒降尿酸及改善肾功能的作用机制。方法 60只雄性SD大鼠按随机数字表法分为复方芪苓配方颗粒高剂量组(9.6g·kg-1·d-1)、中剂量组(4.8g·kg-1·d-1)、低剂量组(2.4g·kg-1·d-1),别嘌醇组(10.5mg·kg-1·d-1),正常对照组,模型对照组,每组10只。采用灌胃腺嘌呤联合腹部皮下注射氧嗪酸钾制备大鼠尿酸性肾病模型,连续造模2周。造模成功后各组给予相应药物灌胃,正常及模型对照组以等体积蒸馏水灌胃,连续给药2周。分别采用肌氨酸氧化酶法、尿素酶法、尿酸酶法测定其血清肌酐、尿素、尿酸,化学比色法测定肝脏黄嘌呤氧化酶,免疫组化检测肾脏组织有机阴离子转运体1(OAT1)、尿酸盐转运体1(URAT1)、有机阳离子转运体2(OCT2)的表达。结果与模型对照组比较,复方芪苓配方颗粒高、中、低剂量组尿酸性肾病模型大鼠血清尿酸水平显著降低[(107.80±9.27)μmol/L、(119.31±10.63)μmol/L、(129.41±9.27)μmol/L比(178.00±10.84)μmol/L,P<0.01];复方芪苓配方颗粒高、中剂量组血清肌酐、尿素水平显著降低[(51.00±5.30)μmol/L、(57.65±10.36)μmol/L比(101.67±9.84)μmol/L,(12.43±1.09)μmol/L、(18.37±2.41)μmol/L比(29.35±4.59)μmol/L,P<0.01];复方芪苓配方颗粒高、中剂量组肝脏黄嘌呤氧化酶明显降低[(38.38±3.85)U/L、(39.09±4.39)U/L比(45.90±5.02)U/L,P<0.05];复方芪苓配方颗粒高剂量组肾脏OAT1蛋白的表达显著上调[(636786.94±46980.65)比(330652.32±36608.14),P<0.01],且其高、中剂量组OCT2蛋白的表达显著上调[(698162.61±24727.35)、(668148.15±39230.42)比(462729.95±34117.12),P<0.01],URAT1蛋白的表达显著下调[(33202.67±2481.30)、(63795.48±5177.65)比(159163.58±16016.05),P<0.01]。结论复方芪苓配方颗粒能降低尿酸性肾病模型大鼠血清肌酐、尿素、尿酸水平,其作用机制可能与降低大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性,上调大鼠肾脏OAT1、OCT2水平,下调URAT1水平,从而抑制尿酸生成、并通过增加尿酸盐的分泌及降低肾脏尿酸盐重吸收能力促进尿酸排泄相关。     

排毒养颜胶囊对尿酸酶缺失大鼠的降血尿酸作用

目的 观察排毒养颜胶囊对尿酸酶缺失大鼠的降血尿酸作用。方法 取7只体质量180～220 g的雄性尿酸酶缺失大鼠,灌胃排毒养颜胶囊悬液（0.42 g/kg）,连续灌胃5 d。给药前和末次给药后2 h取血制备血清,用磷钨酸法测定血尿酸水平。同时收集给药前24 h和给药第5天24 h尿液和粪便,也用磷钨酸法测定排泄物中的尿酸含量并计算总量。结果 对比给药前,给药5 d后大鼠的血尿酸水平显著降低（P<0.05）,粪便中24 h尿酸总量显著增加（P<0.05）,但24 h尿液中的尿酸总量反而有减少趋势,差异无统计学意义（P=0.109）。结论 口服排毒养颜胶囊能通过增加尿酸在粪便中的排泄量而降低尿酸酶缺失大鼠的血尿酸水平。     

不同分子量聚乙二醇及其修饰的重组尿酸氧化酶对体外不同类型细胞产生空泡的影响研究

[目的]探究不同分子量的聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）及其修饰的重组尿酸氧化酶（recombinant urate oxidase,rUOX）对体外不同类型细胞产生空泡的影响。[方法]离体培养人主动脉内皮细胞系（HAEC）、人胚肾细胞株（293细胞）以及仓鼠卵巢细胞亚株（CHO-K1）,应用分子量为5kD和20kD的PEG及其修饰的rUOX,分别给药于上述细胞,观察细胞产生空泡的现象并对其进行评分,应用ELISA检测PEG或PEG修饰的药物是否进入细胞内。[结果]活化前后的PEG20k和PEG5k均导致293细胞产生大面积的空泡,ELISA显示PEG进入该细胞内,其他组无明显差异。[结论]这种体外空泡的产生局限于不同类型的细胞,与PEG分子本身有关,可能与所耦合的蛋白药物无关,且活化前后的PEG均能产生这种空泡。     

聚乙二醇修饰尿酸酶的研究(英文)

目的:为了降低尿酸酶的免疫原性并提高其稳定性,利用PEG修饰剂对尿酸酶进行修饰,以期获得性质更优的治疗痛风的药物。方法:用相对分子质量为40kD,活化基团为羟基琥珀酰亚胺的PEG修饰剂对尿酸酶进行修饰,并比较修饰前后在酶解稳定性、pH稳定性及温度稳定性方面的差异,以及PEG修饰对体内半衰期,免疫原性的影响。结果:发现PEG修饰后尿酸酶的酶解稳定性显著提高,PEG化尿酸酶保留了原有尿酸酶80%的活性,体内半衰期从45min延长至696min。PEG化尿酸酶与抗体的结合能力为原型蛋白的1/8。体内的免疫原性也明显降低。结论:化学修饰后的尿酸酶可望成为潜在的治疗痛风的有效药物。     

透明质酸修饰的尿酸酶脂质体的制备及特性

目的 制备透明质酸修饰的尿酸酶脂质体(hyaluronic acid-uricase liposomes,UHLP),并对尿酸酶(uricase,UC)和UHLP的体外活性及稳定性进行研究.方法 采用逆向蒸发法制备UHLP,测定UHLP的包封率、粒径与zeta电位,用透射电镜对UHLP进行观察.考察游离UC和UHLP中UC的最适温度和最适pH,还考察了其热稳定性、贮存稳定性、酸碱稳定性、抗胰蛋白酶水解能力以及抗部分金属离子和有机化合物能力,并对UHLP提高UC活性的机制进行了初步研究.结果 UHLP的平均包封率为(57.27±3.93)％(n=3),平均粒径为(322.6±8.2) nm(n=3),zeta电位为(-19.4±1.7)mV(n=3).透射电镜下UHLP呈分布均匀的圆形或椭圆形.游离UC和UHLP中UC最适温度均为40℃;游离UC最适pH为8.5,UHLP中UC最适pH为8.0.稳定性结果显示,UHLP中UC的热稳定性、贮存稳定性、酸碱稳定性、抗胰蛋白酶水解能力以及抗部分金属离子和有机化合物能力均优于游离UC.UHLP提高UC活性机制初步研究结果表明,UC经UHLP包裹后其活性发生改变,和UC与UHLP脂质膜的相互作用有关,它们在相互作用的过程中使UC的构象发生翻转,构效发生改变,UC活性中心暴露,从而导致其活性增强.结论 UHLP不仅能提高UC在体外的活性,还能提高UC在体外的稳定性.     

硼酸盐缓冲液制备尿酸酶复合脂质体及尿酸酶的特性

目的研究硼酸-硼砂缓冲液制备的尿酸酶-过氧化氢酶脂质体（BUCLP）中尿酸酶的体外特性。方法采用逆向蒸发法制
备BUCLP,并考察其部分理化性质特性。结果BUCLP中尿酸酶最适温度保持在40 ℃,最适pH值由8.5降为8.0,而Km值也
由14.207 μmol/L降为13.623 μmol/L;尿酸酶-过氧化氢酶（UAC）与空白纳米脂质体作用后,再与FITC结合,其荧光强度高于游
离UAC与FITC结合的荧光强度,且BUCLP在280 nm处的荧光强度高于游离UAC。结论尿酸酶和过氧化氢酶联合制备成
BUCLP后尿酸酶的活性增加。
     

75%摄食量对尿酸酶缺失大鼠的降尿酸作用*

为观察不同摄食量对尿酸酶缺失大鼠（昆明DY大鼠）血尿酸影响,将45 d日龄雄性昆明DY大鼠随机分成禁食组（禁食2d）或节食组（即给予正常摄食量的90％、80％、75％、70％、60％、50％、25％,持续14 d）;实验前、中、后断尾取血制备血清,记录体质量、24 h摄食和饮水量,收集大鼠24 h尿液和粪便,并使用磷钨酸法检测样品尿酸含量。结果表明,禁食2 d会使大鼠血尿酸会显著升高,每日给予大鼠正常摄食量的75%,其血尿酸、肌酐、总胆固醇和甘油三酯14 d后呈显著下降趋势,且体质量维持稳定;其余不同摄食量的组分对大鼠血尿酸有不同程度的增加倾向或无明显影响。综上,摄食量控制在75％,对尿酸酶缺失大鼠具有降尿酸的作用,同时对肾功和血脂也有一定的改善作用。     

痛风治疗新药研究进展

痛风的发病率在世界范围内呈逐年上升趋势,并且与高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖和胰岛素抵抗等疾病的发生密切相关,是当今世界尤其是中老年男性的常见病,已成为威胁人类健康的严重代谢性疾病。目前治疗痛风的药物倍受关注,主要包括以嘌呤代谢关键酶为靶点的降尿酸药物、以肾小管尿酸转运体为靶点的降尿酸药物、黄嘌呤氧化还原酶和肾小管尿酸转运体的双重抑制剂及尿酸氧化酶等4种类型。本文概括了痛风治疗新药研究进展。     

Kinetic method for enzymatic analysis by predicting background with uricase reaction as model

Objective：To investigate the reliability for kinetic assay of substance with background predicted by the integrated method using uricase reaction as model. Methods： Absorbance before uricase action （Δ0） was estimated by extrapolation with given lag time of steady-state reaction. With Km fixed at 12.5μmol/L, background absorbance （Δb） was predicted by nonlinearly fitting integrated Michaelis-Menten equation to Candida utilis uricase reaction curve. Uric acid in reaction solution was determined by the difference （ΔA） between Δ0 and Δb. Results .Ab usually showed deviation 〈3% from direct assay with residual substrate done fifth of initial substrate for analysis. ΔA showed CV 〈5% with resistance to common interferences except xanthine, and it linearly responded to uric acid with slope consistent to the absorptivity of uric acid. The lower limit was 2.0 μmol/L and upper limit reached 30 μmol/L in reaction solution with data monitored within 8 min reaction at 0. 015 U/ml uricase. Preliminary application to serum and urine gave better precision than the direct equilibrium method without the removal of proteins before analysis. Conclusion .This kinetic method with background predicted by the integrated method was reliable for enzymatic analysis, and it showed resistance to common interferences and enhanced efficiency at much lower cost.     

透明质酸修饰的尿酸酶多囊脂质体的体外特性及药效学过程

目的 研究透明质酸修饰的尿酸酶(UC)多囊脂质体(uricase in hyaluronic acid-uricase multivesicular liposomes,UHMVLs)的体外特性及其在大鼠体内的药效学.方法 采用复乳法制备UHMVLs并测定包封率及理化特性.取12只健康雄性SD大鼠,模型组采用次黄嘌呤和氧嗪酸钾建立高尿酸血症大鼠模型(n=3),UHMVLs组(n=3)和UC组(n=3)分别于建模后尾静脉注射UHMVLs和游离UC,并以正常组(n=3)为对照,测定大鼠血清中尿酸水平.结果 UHMVLs的平均包封率为(62.48±3.87)％ (n=3).UHMVLs和UC最适温度均为40℃,最适pH值分别为8.0和8.5.在同一温度(20～70℃)和pH(6.5～9.5)条件下,UHMVLs中UC的活性均高于游离UC(P＜0.05).除1、36、48 h外,其余各时间点UHMVLs降低高尿酸血症大鼠模型血清中尿酸水平的效果均较游离UC更显著(P＜0.05).结论 在相同条件下,UHMVLs不仅能提高UC的活性,还可以增强UC的稳定性;UHMVLs在大鼠体内降低血尿酸水平的能力优于游离UC.