人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定

目的:构建人抗HBsAg单链抗体(ScFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine, tP)融合基因,在大肠杆菌中进行表达纯化并分析ScFv/tP融合蛋白的活性. 方法:设计引物扩增人抗HBsAg ScFv HBs15基因,在其3'端引物引入tP的编码基因,PCR扩增获得ScFv/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-32a后,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导表达. 表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,用Ni-NTA螯合层析介质纯化. 间接ELISA分析ScFv/tP融合蛋白的亲和活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合的情况. 结果:成功获得人抗HBsAg ScFv/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达,表达的ScFv/tP融合蛋白不仅保持了与HBsAg结合的能力,同时具有DNA结合活性. 结论:ScFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,为该ScFv的进一步应用奠定了基础.     

Arg9/人抗HBsAg单链抗体/EGFP融合蛋白基因的构建、表达及活性分析

目的:构建带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因,将其转化入大肠杆菌中进行表达,并分析表达产物与HBsAg的结合活性. 方法:设计引物,将Arg9的编码序列引入单链抗体基因的5′端,PCR扩增后获得带有Arg9编码序列的ScFv14基因,将PCR产物连入pMD18-T载体,进行序列测定. 将测序正确的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分别与EGFP基因连接后转化入原核表达载体pET32a,获得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP两种融合基因的表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,以IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析,并用间接ELISA方法检测其与HBsAg的亲和活性. 结果:经酶切鉴定及测序证实ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正确.SDS-PAGE分析表明两种融合基因在大肠杆菌BL21中成功获得表达,表达量分别占菌体总蛋白的20% 和25%.间接ELISA检测证实所表达的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg结合活性. 结论:成功构建了带有转膜结构域Arg9编码序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因,并在大肠杆菌BL21中成功表达,表达产物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有与抗原HBsAg特异性结合的活性.     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的构建抗 CD44抗体的单链抗体(anti-CD44-ScFv),为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法从分泌抗 CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系 HII44a 中提取总 RNA,经 RT-PCR 分离获得了轻、重链可变区(V_L、V_H)基因,用连接肽将其构建成具有 V_L-Linker-V_H 结构的单链抗体基因,并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体 PET22b( )中进行表达。结果经测序表明,V_H、V_L 及 Linker 的序列正确。ScFv 在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16%。能够特异性与 CD44抗原结合。结论成功构建抗 CD44抗体单链抗体,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细菌内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

目的：研究乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)人源单链可变区抗体（ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒（HBV）基因治疗的作用。方法：用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体，聚合酶链反应（PCR）法扩增HBsAg单链抗体基因，并构建表达HBsAg ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBsAg ScFv,转染PA317细胞，将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。结果：成功筛选出HBsAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因，构建HBsAg ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBsAg ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg,HBeAg逐渐下降，到第14天时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化。结论：HBsAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg,HBeAg表达的作用。     

抗CD44抗体单链抗体构建及表达

目的 构建抗CD44抗体的单链抗体（anti-CD44-ScFv），为进一步应用基因工程抗体研究打下基础。方法 从分泌抗CD44单克隆抗体的杂交瘤细胞系HII44a中提取总RNA，经RT-PCR分离获得了轻、重链可变区（VL、VH）基因，用连接肽将其构建成具有VL-Linker-VH结构的单链抗体基因，并将构建的单链抗体基因克隆到分泌型蛋白表达载体PEV22b（＋）中进行表达。结果 经测序表明，VH、VL及Linker的序列正确。ScFv在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的16％。能够特异性与CD44抗原结合。结论 成功构建抗CD44抗体单链抗体，为进一步制备基因工程抗体奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的 构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法 应用重组ＤＮＡ技 术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保 证在同一阅读框架,然后分别插科到pcＤＮＡ３和ＰＭＪＫ３两种真核表达载体中。结果构建成可以在真核细胞中分泌表 达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcＤＮＡ３－Ｄ１和ｐＭＪＫ３－Ｄ１。结论为建 立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低相对分子质量单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体的构建

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对单链尿激酶融合基因真核分泌表达载体。方法：应用重组DNA技术,将人工合成的尿激酶原信号肽基因与鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合基因连接,并保证在同一阅读框架,然后分别插入到pcDNA3和PMJK3两种真核表达载体中。结果：构建成可以在真核细胞中分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的重组质粒pcDNA3-D1和pMJK3-D1。结论：为建立稳定分泌表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低相对分子质量单链尿激酶融合蛋白的细胞工程株奠定了基础。     

大容量天然人源单链抗体库的构建及抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体的淘选

目的：从大容量抗体库中淘选全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体。 方法：以60例健康供者的外周血淋巴细胞为来源,构建了10¹⁰人源天然单链抗体库,并以PreS1抗原肽进行淘选。3轮淘选后,单克隆经ELISA检测,富集的特异性单克隆经E.coli HB2151表达后进行Western检测并测序。 结果：3轮淘选之后,噬菌体的投入/产出比提高了100倍。抗原抗体反应结果显示,A₄₁₀=1.0的抗PreS1的单链抗体得到富集。Western结果显示其插入的单链抗体片段正确。该抗体基因序列的DNAPLOT软件分析结果进一步表明该抗体是人抗体,其V_H属于V_H1亚族,V_λ属于V_λ1亚族。结论：这一技术是获得全人源化抗PreS1的单链抗体的有效途径,同时为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础。     

抗前列腺特异抗原单链抗体/人羧肽酶A融合基因的构建及表达

目的 构建抗前列腺特异抗原（PSA）单链抗体（scFv)/人羧肽酶A(hCPA)融合基因,为前列腺癌的抗全导向酶-前体药物疗法奠定基础。方法 在已克隆抗PSAscFv和hCPA基因的基础上,用加端PCR分别在scFv基因的3′端和hCPA基因的5′端加上部分连接肽（linker)基因序列,回收后混合。应用重叠延伸拼接法,将抗PASscFv基因和hCPA基因通过linker序列串联为scFv/hCPA融合基因;并将构建的融合基因克隆到融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。结果 序列测定结果表明,构建的抗PSAscFv/hCPA融合基因中scFv和hCPA序列均正确,scFv和hCPA间有18bp的linker序列,推导的氨基酸序列为GSGGSG,与设计的序列相符,融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白并以SDS-PAGE分析,在Mr为94000左右出现一条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的34%。结论 成功构建并原核表达了抗PSAscFv/hCPA融合基因。     

抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的：实现二硫键稳定的抗肝癌单链抗体与PE38融合，免疫毒索在大肠杆菌中的可溶性表达，为下游的活性检测等工作打下基础．方法：设计了两种不同的表达载体(GST、硫氧还蛋白促可溶表达载体)，并通过改变宿主菌菌株、IPTG诱导浓度、诱导温度及诱导时间等，优化表达条件；通过ELISA法判断该免疫毒素中单链抗体的结合活性．结果：抗肝癌单链抗体与PE38融合蛋白在大肠杆菌Origami(DE3)的上清中得到表达，表达量占菌体总可溶蛋白量的21％：ELISA法证实该融合蛋白保持了亲本抗体的特异性．结论：dsFv-PE38融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达为其他融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达提供了思路．     

Tat47-57-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定

目的：探讨融合蛋白Tat47-57-HBcAg原核表达的可行性,并分析其表达形式,为研究其功能提供理论基础。方法：合成Tat47-57编码序列,PCR技术扩增HBcAg基因,通过重叠延伸PCR片段拼接法,将Tat47-57编码序列和HBcAg基因拼接,将融合基因克隆到pET28原核表达载体中。挑选测序正确的构建质粒转化大肠埃希菌Rosetta-gami^TM2（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达,表达产物超声破壁,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析融合蛋白的表达形式,Western印迹鉴定。结果：Tat47-57-HBcAg融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性形式过度表达,Western印迹分析表明Tat47-57-HBcAg融合蛋白可与HBcAg单克隆抗体反应。结论：融合蛋白Tat47-57-HBcAg以可溶性形式在原核表达系统中高效表达,并能特异性的被HBcAg单克隆抗体所识别。     

人干燥综合征B抗原的基因克隆及融合表达

目的：建立新的检测方法，克隆并表达人干燥综合征B抗原（SS-B）。方法：应用逆转录PCR（RT-PCR）技术，从HL-60细胞株中克隆SS-B全长基因，将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，转入大肠杆菌BL-21，阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达，产物行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）试验。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，测序结果与Gen-Bank报道的完全一致。pGEX-ST-SS-B重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白相对分子质量为71000，具有天然SS-B的免疫原性。结论：成功克隆表达SS-B，为下一步研究奠定了基础。     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

317例慢性乙型肝炎患者血清HBeAg、肝组织内HBsAg和HBcAg表达强度与临床的关系

目的 分析血清HBeAg阴性和阳性的慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织内的HBsAg、HBcAg表达强度与临床的关系.方法 31 7例CHB患者肝穿刺标本分成血清HBeAg阴性组和HBeAg阳性组两组,分析两组肝组织内HBsAg、HBcAg的表达强度及其与年龄、性别、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清HBV DNA载量、肝脏炎症活动度分级和纤维化分期的关系.结果 HBeAg阴性组患者的年龄、ALT、肝脏炎症活动度和纤维化程度大于HBeAg阳性组患者;但血清HBV DNA载量低于HBeAg阳性组患者(均P＜0.05).肝组织内HBsAg表达强度与年龄、ALT、肝脏炎症程度和纤维化程度均无相关性(P＞0.05).血清HBeAg转阴后,肝组织内HBcAg表达强度降低(t=12 349.0,P=0.00);HBcAg与血清HBV DNA载量出现正相关关系(r=0.251,P=0.007);与肝脏炎症活动度和纤维化负向相关性消失(P＞0.05).结论 血清HBeAg转阴后HBV其他抗原成分仍能与肝组织维持足够活跃的免疫状态.血清HBeAg转阴后,肝组织内HBcAg表达强度降低,与血清HBV DNA载量出现正相关关系,与肝脏炎症活动度和纤维化负向相关性关系弱化.     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

乙型肝炎患者血清HBV-DNA表达水平及其临床意义

目的　探讨乙型病毒性肝炎患者血清HBV DNA的表达水平及其与乙肝标志物的相互关系。方法　用定性PCR法和定量PCR同步检测 144例乙肝患者血清HBV DNA ,同时用ELISA法检测血清乙肝标志物。结果　定性PCR与定量PCRHBV DNA总体阳性率相同 ,均为 78 47%(113/ 144 )。乙肝患者血清HBV DNA平均滴度 (每毫升拷贝数 )为 4 3× 10 3 ,其中急性肝炎、慢性肝炎轻度、慢性肝炎中度、慢性肝炎重度、肝炎后肝硬化者血清HBV DNA平均滴度分别为 2 7× 10 3 、6 7× 10 2 、2 5× 10 5、6 .9× 10 5、9 9×10 4 。相互比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。HBeAg( )、HBeAg(- )患者血清HBV DNA平均滴度分别为 3 1× 10 5、6 7× 10 2 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。结论　HBeAg( )患者血清中HBV DNA水平高 ,定量PCR可更准确反映体内HBV增殖水平和传染性强弱     

乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测

目的：探讨乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白设计的合理性。方法：应用Gene Constructionkit2．5、DNAStar软件和WWW．expasy．org网站提供的分析方案分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性、亲水性、抗原性、表位等性质，并作了二级结构模拟分析。结果：重组体CMV启动子下游有完整的目的基因ORF，融合蛋白二级结构水平未出现新的抗原性及表位，亲水性无改变，Linker部位抗原性低，呈中性且柔性高，不影响两端的蛋白质二级结构及融合蛋白空间构象。结论：重组体设计合理，融合蛋白很大可能保留了乙肝表面抗原和CD40L胞外段的生物学活性，为进一步研究提供了理论依据。