巢—聚合酶链反应技术的改进

作者改进了巢-聚合酶链反应技术.在第一轮聚合酶链反应(PCR)之后,进行低融点琼脂糖凝电泳.切下靶序列带或相应位置的凝胶,加热融化后稀释,再进行第二轮PCR.由于对第一轮反应的产物进行了电泳纯化,所以可进一步提高这种方法的特异性.用这种方法研究了转基因小鼠中抗体基因的表达.     

丙型肝炎病毒的聚合酶链反应检测法与抗体检测法的临床应用比较

按文献设计丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）引物，建立了聚合酶链反应检测法，并同时用抗体检测（ＥＬＩＳＡ）法检测了１０９例非甲非乙型肝炎所致的肝功能异常者。结果表明抗ＨＣＶ抗体检测阳性率明显高于聚合酶链反应法。其原因可能是并非所有抗ＨＣＶ抗体阳性者均含ＨＣＶ；抗ＨＣＶ抗体检测法假阳性率较高。为确保临床诊断的可靠、准确，建议对同一患者同时进行以上两种方法检测。     

应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库

目的: 克隆白癜风患者淋巴细胞中原始配对的自身抗体基因,构建噬菌体抗体库并筛选针对黑素细胞膜抗原的特异性抗体. 方法: 细胞内PCR法扩增人免疫球蛋白轻链和重链可变区基因,Cre重组酶介导下完成单个细胞内的轻重链连接,获得反映体内原始配对信息的单链抗体可变区基因,构建噬菌体抗体库,筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结果: 构建完成库容量约为3×l06的噬菌体抗体库,筛选得到1株针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结论: 利用细胞内PCR技术和噬菌体抗体库技术成功构建免疫文库,为进一步研究自身抗体在白癜风发生发展过程中的作用奠定了基础.     

丙型肝炎病毒的聚合酶链反应检测法与抗体检测法的临床应用比较

按文献设计丙型肝炎病毒(HCV)引物,建立了聚合酶链反应检测法,并同时用抗体检测(ELISA)法检测了109例非甲非乙型肝炎所致的肝功能异常者.结果表明抗HCV抗体检测阳性率明显高于聚合酶链反应法.其原因可能是并非所有抗HCV抗体阳性者均含HCV;抗HCV抗体检测法假阳性率较高.为确保临床诊断的可靠、准确,建议对同一患者同时进行以上两种方法检测.     

聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因

目的利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证。方法收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TR Izol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证。结果总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因。测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源。结论该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础。     

聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因

目的 利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证.方法 收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TRIzol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证.结果 总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因.测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源.结论 该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础.     

聚合酶链反应及其应用

聚合酶链反应(POlymerase chain reactioln,PCR),又称体外基因放大技术,是用耐热DNA多聚酶在体外系统中诱发一对引物间的DNA双链合成过程。即PCR产生的分子数在每一周期后增加一倍,这与体内DNA复制方式相似。经过20～30次循环后,可使目的基因片段成百万倍的扩增,使得对该基因片段的分析研究更为便利。     

两种聚合酶链反应在单纯疱疹脑炎诊断中的应用

比较并探讨两种聚合酶链反应技术在单纯疱疹病毒性脑炎早期快速诊断中的应用价值。方法选择３０例临床确诊的病毒性脑炎患者，分别运用由两种不同引物组成的聚合酶链反应和巢式聚合酶链反应测定脑脊液中的单纯疱疹Ｉ型病毒，另选择２５例非病毒性脑炎患者的脑脊液作为对照组。     

聚合酶链反应在MLCK表达载体构建中的应用

用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方法扩增 出含有Ｓａｌ Ⅰ位点和转录起始点ＡＴＧ的肌球蛋白轻链激酶（ｍｙｏｓｉｎ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＭＬＣＫ）ｃＤＮＡ片段，并入质粒ｐＢＫｒｓｖ中，构建成能在宿主细胞中表达的表达本，并通过酶切图谱、ＳａｌⅠ位点ＤＮＡ序列是到证实。为进一步研究ＭＬＣＫ的表达奠定基础。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体库的构建

目的 构建抗人血管生长素基因工程抗体文库。方法 采用ＰＣＲ等分子生物学手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体变可区重、轻链基因，通过噬菌体表面呈现技术表达抗体。结果 １获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段（ＳｃＦｖ），２得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库。结论 本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗文库的方法，该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。     

噬菌体抗体库技术应用中的几个问题及其对策

噬菌体抗体库技术已广泛应用于抗体工程研究领域,但在几个主要环节中(如构建、筛选及表达)仍存在一些尚待解决的具体问题,本文旨在探讨所遇问题及其解决方案。     

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源乳腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选乳腺癌特异性单链抗体(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织来构建抗乳腺癌噬菌体抗体库。通过正常乳腺细胞(MCF-10F)和乳腺癌细胞(MCF-7)筛选富集后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测噬菌体抗体活性。结果成功的构建了1个4.2×107的噬菌体抗体库,并从该库中筛选到6株对乳腺癌细胞株MCF-7有结合活性的阳性克隆。结论从人源乳腺癌噬菌体抗体库中筛选到6株特异性噬菌体抗体,为下一步进行单链抗体的乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原(EsAg)作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建

目的　构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法　用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果　ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论　成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选肺腺癌细胞A549特异性单链抗体。方法利用肺腺癌患者癌旁淋巴结组织构建肺腺癌噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别A549细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化E．coliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS—PAGE、Westernblot鉴定,通过ELISA法鉴定其与人肺腺癌细胞结合的特异性。结果成功构建了1个4．6×10^7的噬菌体抗体库。在筛选过程中,肺腺癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第5轮为第1轮的181倍。在E．coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS—PAGE与Westernblot结果显示抗体相对分子质量为30×10^3左右。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与A549细胞结合,而不与MDA—MB-435细胞结合。结论从肺腺癌病人癌肿周围淋巴结扩增免疫球蛋白基因成功地构建人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到肺腺癌特异性抗体。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究

目的:建立简便、可靠基因克隆菌落阳性重组子的筛选方法。方法:应用普通菌落PCR和改良的菌落PCR方法对TRIM28基因的阳性重组体进行阳性重组子的分析比较,同时探讨了PCR反应体系中模板浓度和DMSO对于扩增效率的影响。并对鉴定结果为阳性的克隆进行了进一步酶切和蛋白诱导表达分析。结果:运用改良的菌落PCR法简单快捷,结果可靠,反应体系中DMSO的浓度为4%左右可以很好地促进GC富集DNA模板的PCR扩增。其方法的可靠性得到了酶切验证和重组蛋白表达证实。结论:应用改良方法可以用于快速有效地筛选阳性重组菌落。     

人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选?鉴定

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定.方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞.用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库.以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstO I酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定.结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26.DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性.结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子.