人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA．并构建成pBV220-survivin原核表达质粒，将其导入Ecoli Bl21(Gold)中，诱导表达survivin蛋白。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Western blotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致，表达质粒在E-coli Bl21(Gold)中得到高效表达，表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白，其纯度达到95％以上。Western blotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白。为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

水蛭素基因在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

目的：利用ＤＮＡ重组技术在大肠杆菌中融合表达水蛭不基因。方法：将水蛭素变体１的基因ＨＶ１克隆到ｐＥＺＺ３１８表达载体，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，增减上清液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测，ｈＩｇＧ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析纯化。结果：表达的融合蛋白相对分子质量为２０ｋＤ，表达上清的抗凝血酶和为４７ＡＴＵ／ｍｌ。结论：在大肠杆菌中表达的水蛭素融合蛋白对凝血酶的凝血功能具有显著的抑     

人肥胖基因在pBV221中的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高效表达ｌｅｐｔｉｎ。方法；根据中国人肥胖基因ｃＤＮＡ序列高效表达质粒ｐＢＶ２２１的多克隆位点，设计ＰＣＲ引物，以含有人ＯＢ的重组质粒ｐＵＣ１９０Ｂ为模板，体外扩增人ＯＢ编码ｌｅｐｔｉｎ的片段（ＯＢ）并经内切酶消化鉴定。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

【目的】克隆人血管内皮生长因子165基因,并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。【方法】用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165,插入质粒PUC19中并测序鉴定。构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞,用RNA斑点杂交和Westernblot方法检测VEGF165基因表达,并通过Miles试验检测VEGF165蛋白活性。【结果】PCR产物为582bp,测序结果表明其序列正确,在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达,VEGF165蛋白相对分子质量为22ku,具有生物学活性。【结论】成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

人FLT3配体的克隆、表达与纯化

目的 克隆人FLT3配体（Flt3Ligand,FL)基因，并在大肠杆菌中对FL进行表达、纯化。方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用R T－巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析；将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;处重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导后，收集细菌、菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化，并进行SDS－PAGE及Westernblot检测。结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长462bp的FL基因，测序正确；经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达载体pRSET-B;构建的表达载体pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到90％，该融合蛋白具有FL抗原特性。结论 成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化 ，为大规模获得FL创造了条件。     

人血管内皮生长因子的克隆表达及活性鉴定

[目的]克隆人血管内皮生长因子165基因,并测定蛋白质的表达及鉴定其活性。[方法]用PCR法从人心脏cDNA文库中钓取目的基因VEGF165,插入质粒PCU19中并测序鉴定,构建真核表达重组质粒AdtrackCMV-VEGF165转染293细胞,用RNA斑点杂交和Western blot方法检测VEGF165基因表达,并通过Miles试验检测VEGF156蛋白活性。[结果]PCR产物为582bp,测序结果表明其序列正确,在RNA和蛋白水平检测到VEGF165基因表达,VEGF165蛋白相对分子质量为22ku,具有生物学活性。[结论]成功地克隆了有表达生物学活性的VEGF165基因。     

人肥胖基因在pBV221中的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高效表达人ｌｅｐｔｉｎ。方法：根据中国人肥胖基因（ｏｂｅｓｅｇｅｎｅ，ＯＢ）ｃＤＮＡ序列和高效表达质粒ｐＢＶ２２１的多克隆位点，设计ＰＣＲ引物，以含有人ＯＢ的重组质粒ｐＵＣ１９ＯＢ为模板，体外扩增人ＯＢ编码ｌｅｐｔｉｎ的片段（ＯＢ１），并经内切酶消化鉴定。将带有一对限制性内切酶位点的ＯＢ１和ｐＢＶ２２１分别进行双酶切，然后把ＯＢ１定向克隆于ｐＢＶ２２１中。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＶ２２１ＯＢ１，实现了人ｌｅｐｔｉｎ在大肠杆菌中的表达。结论：采用定向克隆技术，将ＯＢ１插入表达质粒ｐＢＶ２２１，连接效率高，且重组质粒中ＯＢ１均为正向插入，确保了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。     

鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的克隆及表达

为探索鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的高效表达条件，我们将鱼抗冻肽基因克隆到原核高效表达载体Ｐ＾ｋｋ２２３－３上，筛选到８个重组克隆，经转化大肠杆菌ＤＨ５α，ＩＰＴＧ诱导５￣６ｈ，超声裂解细菌产物，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳胶带中分子量９ＫＤ处显示一条表达产物带，证明插入的抗冻肽基因已表达，含量占菌体总蛋白的１０％左右     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因。方法；ＰＣＲ法克隆ＧＦＰ－Ｓ６５ＴｃＤＮＡ并改造其两端的限制性内切酶位点，构建重组原核表达载体ｐＲＳＥＴ－ＧＦＰＳ６５Ｔ。结果；在ＩＰＴＧ诱导条件下，ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ的表达量占细菌蛋白的 上。细菌培养物及其超声上清在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。     

凋亡抑制蛋白-survivin基因的克隆和表达

目的:克隆survivin基因、原核表达并鉴定. 方法:从培养的人喉癌Hep-2细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得survivin基因. 将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,测序、鉴定. 将测序正确的survivin基因亚克隆到pRSET-c载体中,构建survivin表达载体,IPTG诱导表达4～5 h,做SDS-PAGE分析,鉴定survivin蛋白的表达. 结果:DNA测序证明,获得了survivin基因,其序列与GeneBank中报道序列完全一致. SDS-PAGE分析表明,survivin蛋白获得高效表达,其相对分子质量为16.5×103,表达量约占菌体总蛋白的30%. 结论:Survivin基因的克隆和表达均获得了成功. 为进一步探讨survivin基因在肿瘤诊治中应用奠定了基础.     

颗粒酶B的表达纯化和鉴定

目的：克隆颗粒酶B(GraB)，构建GraB的原核表达载体，从而建立其原核表达体系，获得高效表达的重组GraB。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定，以GraB底物测定其活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，并能作用于GraB特异性底物。结论：建立了GraB原核表达系统。     

PKB/Akt 调节结构域的克隆,表达及初步纯化

目的: 克隆akt1的调节结构域 (regulation domain RD )的编码基因,表达并纯化 Akt RD蛋白,为研究 RD的功能奠定基础.方法: 用RT-PCR方法从胚胎肝细胞中获得Akt1调节结构域RD的编码基因,克隆至pMD18-T载体并测序,结果正确后亚克隆到含有6个His的融合表达载体pRSET-A中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达RD/6×His融合蛋白,超声裂菌,将上清通过金属螯合层析进行纯化.结果: 从人胚胎肝细胞中扩增出编码RD的cDNA,序列测定证实与文献报道的序列一致;成功构建了6×His融合的表达载体pRSET-A -RD;表达了RD/6×His融合蛋白,并纯化得到了RD/6×His蛋白. 结论: 成功克隆了人akt1的调节结构域RD基因,构建了6×His融合的表达载体,表达了RD/6×His融合蛋白并得到了纯化的RD/6×His蛋白.     

嗜热菌热休克蛋白基因的克隆与表达

克隆和在原核表达系统中表达超嗜热古球菌之热休克蛋白基因β亚基。方法：用ＰＣＲ技术从ＨＰＫ基因组ＤＮＡ中扩增ｃｐｋＢ基因片段，经克隆和核苷酸序列分析后再克隆至原核表达载体ｐＢＶ２２０，升温诱导ｃｐｋＢ基因表达，利用ＣｐｋＢ蛋白的耐温特性纯化该蛋白。结果：扩增和克隆了１．６ｋｂ的ｃｐｋＢ基因，并经ＤＮＡ测序证实，实现了ｃｐｋＢ基因在原核系统ＰＬＰＲ启动子控制下的表达，建立了纯化ＣｐｋＢ蛋白的方法。结论     

重组人α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８（ＩＦＮ－α８）高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬｌ－Ｂｌｕｅ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后比活为４．８×１０７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞核细胞趋化蛋白１（ｈｕＭＣＰ－１）。方法：从人外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中提取ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ。将ｈｕＭＣＰ－１ｃＤＮＡ插入融合表达载体ｐＧＥＸＩＮ,１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后获得高效表达。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证明与ｈｕＭＣＰ－１单克隆抗体有明显交叉反应。结论     

重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化(英文)

目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGS-GR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离。结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。     

Cloning and high-level expression of human interferon alpha-8 in E.coli

Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｐｈａ－８ｉｎＥ．ｃｏｌｉＺｈａｎｇＰｉｎｇｗｕ（张平武）；ＷａｎｇＹｉｌｕｎ（王易伦）；ＬｕＤｅｒｕ（陆德如）；ＬｉＹｕｙａｎｇ（李育阳）（Ｉｎｓｔｉ...