NEDD4-1 shRNA真核表达质粒的构建和鉴定

目的：设计并构建靶向NEDD4-1基因shRNA真核表达质粒。方法：依据靶基因序列设计siRNA,克隆入pGPU6/GFP/Neo载体U6启动子的下游,建立shRNA表达质粒系统,采用酶切法和测序法进行鉴定。结果：将重组NEDD4-1 shRNA用BamHⅠ和PstⅠ内切酶分别单酶切。经酶切鉴定、测序分析,序列完全正确。结论：成功构建NEDD4-1 shRNA真核表达质粒,为进一步研究NEDD4-1在胶质瘤发生和发展中的作用提供实验基础。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的构建和鉴定Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体。方法用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连于pTRE-shuttle2质粒的EcoRⅠ酶切位点,经EcoRⅠ酶切鉴定。亚克隆重组质粒片段于腺病毒载体Adeno-XTM,构建重组Adeno-X-hTERT,以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切、聚合酶链反应(PCR)以及进一步测序鉴定其方向。结果重组质粒经EcoRⅠ酶切后得到预期的3.5、0.88、3.55kb大小的3条片段,重组腺病毒载体经PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切,出现预期32.6、5.09kb片段,与理论计算值完全一致,PCR及测序结果进一步确认了结构与方向的正确性。结论成功构建了Tet-on系统调控人端粒酶催化亚单位基因hTERT的重组腺病毒表达载体。     

基因工程法生产L-5-甲基四氢叶酸的研究

目的在E.coli BL21(DE3)中表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR),并检测MTHFR的表达情况及L-5-甲基四氢叶酸的增加量。方法采用PCR法获得MTHFR基因(metF)全长DNA,分别在其5'端和3'端加上BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。经BamHⅠ和SacⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)中,经限制性酶切、菌落PCR和测序验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测MTHFR表达量,HPLC检测L-5-甲基四氢叶酸量。结果经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET28a-MTHFR构建成功,表达产物相对分子质量约为33 000,与MTHFR大小相符,工程菌的L-5-甲基四氢叶酸的产量显著增加。结论通过将MTHFR的基因导入L-5-甲基四氢叶酸产生菌能够提高L-5-甲基四氢叶酸产量。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

Cloning of Extracellular Domain Gene of Human Thyroid Peroxidase and Construction of Its Baculovirus Expression Vector

目的:探索克隆人甲状腺过氧化物酶(hTPO)膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体.方法:PCR扩增hT-PO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBacl质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coli DH 10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体(hTPO-Bacmid),每一步均以PCR及酶切、基因测序等方法鉴定其正确性.结果:与预期一致,PCR扩增hTPO膜外区基因的产物为一约2.5 kb的条带;hTPO-pGEM3zf(+)经EcoR Ⅰ+HindⅢ、EcoR Ⅰ+SalⅠ双酶切后均获得2.5和3.2 kb条带;hTPO-pFastBAC1以EcoR Ⅰ+HindⅢ双酶切得到2.5和4.8 kb的带,均符合预期.分别以重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒为模板进行PCR扩增鉴定,均得到约2.5 kb的目的条带;对hTPO-Bacmid进行PCR鉴定,得到约4.8 kb的片段.对hTPO-pFastBAC1上下游接口测序正确无误.结论:本研究成功克隆了hTPO膜外区基因,并完成了其杆状病毒表达载体hTPO-Bacmid的构建.     

hTPO膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的:探索克隆人甲状腺过氧化物酶(hTPO)膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体。方法:PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coliDH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体(hTPO-Bacmid),每一步均以PCR及酶切、基因测序等方法鉴定其正确性。结果:与预期一致,PCR扩增hTPO膜外区基因的产物为一约2.5kb的条带;hTPO-pGEM3zf(+)经EcoRⅠ+HindⅢ、EcoRⅠ+SalⅠ双酶切后均获得2.5和3.2kb条带;hTPO-pFastBAC1以EcoRⅠ+HindⅢ双酶切得到2.5和4.8kb的带,均符合预期。分别以重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒为模板进行PCR扩增鉴定,均得到约2.5kb的目的条带;对hTPO-Bacmid进行PCR鉴定,得到约4.8kb的片段。对hTPO-pFastBAC1上下游接口测序正确无误。结论:本研究成功克隆了hTPO膜外区基因,并完成了其杆状病毒表达载体hTPO-Bacmid的构建。     

利用重组F26G酶实现呋甾皂苷向螺甾皂苷的体外生物转化

用BamHⅠ和XbaⅠ两种限制酶酶切质粒pKG27,获得了编码F26G（F26G：furostanol glycoside 26-O-β-glucosidase)的cDNA,然后将其重组到表达载体pET-22b上而得到了pET-22b-CSF26G,利用大肠杆菌E.coli BL21进行表达,用胞内可溶蛋白进行酶反应,通过TLC、HPLC分析证明重组菌表达出高活性的F26G酶,并实现了呋甾皂苷到螺甾皂苷的体外生物转化。     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

共表达人PUMA和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达

目的制备同步表达HGF／NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF／NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4。PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒。一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平。结果双酶切重组pad-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF／NK4正确克隆;重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒;病毒感染胰腺癌细胞后3-9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w。结论成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料。     

核酸疫苗pVAX1-F的构建及瞬时表达

目的:构建仙台病毒核酸疫苗pVAXl-F,并在COS 7细胞中表达.方法:利用PCR法以仙台病毒cDNA为模板扩增出F基因,与pMD18-T连接,测序正确后用HindⅢ/EcoR Ⅰ双酶切,将F基因引入经同样酶切的pVAX1载体,构建pVAX1-F表达载体,用PCR法和双酶切法鉴定,并将此重组质粒通过脂质体介导转染COS 7细胞,流式细胞术检测抗原蛋白表达、RT-PCR法检测外源基因的表达.结果:经PCR法和酶切鉴定,目的片段大小与预期相符,经测序目的基因序列与GenBank(EF679198)公布结果一致.重组质粒pVAX1-F转染COS 7细胞72 h后,能够表达抗原蛋白,流式细胞术检测达到58.3%,与对照组3.6%比较差异具有显著性(P<0.01),且F基因mRNA明显表达.结论:成功构建pVAX1-F,并能够在COS 7细胞中瞬时表达,为仙台病毒F基因核酸疫苗进行免疫学评价奠定基础.     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

pmRNA IRWS-hKDR重组质粒的构建、表达及鉴定

目的利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR重组质粒载体,为肿瘤的基因治疗研究奠定基础.方法利用本实验室保存的pDC520 hKDR用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,pmRNA IRES-Luc亦用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,通过分子生物学技术构建了pmRNA IRES-hKDR重组质粒,用PCR、酶切鉴定,然后用脂质体转染Hepall-6细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果重组质粒中含有pmRNA IRES-hKDR基因,转染Hepall-6细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用Westem blot检测证明能与特异性hKDR抗体结合.结论成功构建含pmRNA IRES-hKDR真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中

目的将突变SOD1cDNA亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。方法利用PCR方法从重组子pEGFP—N2-mSOD1中扩增突变的SOD1cDNA片断。以EcoRⅠ／salⅠ双酶切突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7，在T4DNA连接酶的作用下，连接突变SOD1cDNA片断和酵母穿梭表达质粒pGBKT7。转化感受态DH5α，筛选重组子，进行双酶切和测序鉴定。结果经酶切和测序鉴定，突变SOD1cDNA成功地亚克隆入酵母穿梭表达质粒pGBKT7中。结论亚克隆成功，可以对目的基因进行下一步研究。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的半合成及其克隆表达

目的 将人胰岛素样样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）基因克隆到ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ⅰ基因大在大肠杆菌中的表达。方法 利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ⅰ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ⅰ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ⅰ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ｐＥＴＩＧＦ－Ⅰ表达载体。结     

双启动子shRNA真核表达载体的构建

目的:构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.方法:通过PCR分别扩增带有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/E)和带有Bgl Ⅱ、HindⅢ酶切位点的人U6启动子序列(U6-B/H),用BamH Ⅰ与EcoRⅠ双酶切pcDNA3.1(+)与PCR产物U6-B/E后进行连接,重组质粒命名为psPRO.再用BglⅡ与HindⅢ双酶切psPRO与PCR产物U6-B/H后进行连接,构建含有双启动子的shRNA真核表达载体.结果:酶切鉴定以及DNA测序结果显示载体构建成功.结论:构建双启动子的shRNA真核表达载体,使其在细胞中表达2个不同的siRNA,不仅筛选方便,而且可以通过建立这种模式化工具载体,为今后RNA干扰实验研究的开展和深入提供手段.     

双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。     

胞质蛋白NOD2重组腺病毒载体的构建

目的构建人NOD2腺病毒表达载体。方法采用分子克隆技术,从CoCa2细胞DNA中PCR扩增NOD2片段,经pcDNA3．1克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV,以KpnⅠ和NotⅠ双酶切重组穿梭质粒,经电穿孔、抗性筛选,重组成pAdCMV-NOD2腺病毒质粒,经酶切鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组rvAdCMV-NOD2腺病毒,并进行PCR鉴定测定。结果成功扩增目的基因并鉴定,重组穿梭质粒pShuttle-CMV-NOD2鉴定,经酶切鉴定证实重组腺病毒质粒构建成功。结论腺病毒载体应用广泛,细菌体内同源重组腺病毒pAdCMV-NOD2合成效率高,为炎症的基因治疗研究奠定基础。