荧光素酶标记的HBV细胞模型的建立

建立萤火虫荧光素酶(Fluc)为报告基因标记的乙型肝炎病毒(HBV)体外感染的细胞模型。利用分子亚克隆技术,以pAAV/1.2HBV质粒为模板,PCR扩增带有反向重复序列(ITR)的1.2倍HBV基因组片段,反向插入真核表达载体pGL3-CP-Fluc中,构建Fluc标记的HBV基因组表达质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,并将此质粒转染至Huh-7细胞中。全自动免疫分析仪进行HBsAg、HBeAg的定量检测,生物发光检测仪检测Fluc其在细胞的表达水平。成功构建了1.2倍HBV全基因真核表达载体,稳定转染Huh-7细胞后,质粒在细胞中高水平表达Fluc,并可以正常分泌HBsAg、HlBeAg。重组质粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2能在Huh-7细胞中表达,其稳定转染的细胞可作为一种新型的HBV体外感染模型,为抗病毒药物研究奠定基础。     

四环素调控系统对乙型肝炎病毒核心启动子活性及组织特异性的影响

目的:分析四环素调控系统对乙型肝炎病毒核心启动子(Cp)活性及组织特异性的影响.方法:利用PCR从质粒pTL-8扩增7个Teto序列,并将其克隆入T载体pMD19-T Simple中.测序正确后将7个Teto序列亚克隆入pGL3-Basic/Cp荧光素酶报告基因质粒中Cp启动子的上游,以构建质粒pGL3-Basic/7t/Cp.将能表达TetR的质粒pTL-8的荧光素酶编码基因切除后,与pGL3-Basic/7t/Cp共转染肝癌细胞系HepG2,宫颈癌细胞系HeLa,绿猴肾细胞系COS-7,乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在这些不同细胞系中的活性,以鉴定四环素调控系统对Cp活性及组织特异性的影响.结果:成功构建了质粒pGL3-Basic/7t/Cp,将其转染入不同组织来源的细胞系后表明将7个teto序列克隆入Cp上游后增强了Cp在各细胞系中的活性.结论:四环素调控系统明显增强了Cp的转录活性.但同时,Cp失去了其组织特异性的特点,即在这些细胞系中均有较强活性.     

以p53为靶点的新型抗肿瘤化合物细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有p53蛋白结合位点的p21或survivin基因启动子区的荧光素酶报告基因重组质粒,并获得稳定转染的细胞模型用于抗肿瘤化合物筛选。方法将含有p53蛋白结合位点的p21或survivin启动子区序列连接到pGL4.17-basic载体上,分别获得报告基因重组质粒pGL4.17-p21和pGL4.17-survivin;将两种重组质粒分别转染A549细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株A549-p21和A549-survivin;对该细胞模型进行条件优化,并将可调节p53蛋白表达的多种抗肿瘤药物作用于稳定转染细胞,通过荧光素酶检测和western blot方法验证细胞模型用于药物筛选的可行性。结果成功建立了分别含有p21或survivin启动子报告基因的A549-p21和A549-survivin稳定细胞模型,多种抗肿瘤药物作用该细胞后能够通过调节p53蛋白表达而影响报告基因荧光素酶活性。结论构建的稳定转染细胞模型可以用于筛选以p53为靶点的抗肿瘤化合物。     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

利用合适的启动子提高外源基因在Jurkat细胞中的表达

目的通过选择合适的启动子来实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达。方法以pGL3-MCS质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和UbC)驱动萤火虫荧光素酶Fluc报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc报告基因的质粒共转Jurkat细胞,检测Jurkat细胞中这两种荧光素酶与相应底物反应所产生的荧光强度,计算Fluc与Rluc荧光强度的比值即Fluc的相对酶活,通过比较Fluc相对酶活的大小来选取在Jurkat细胞中具有高表达活性的启动子。结果以pGL3-MCS质粒为基础成功构建了不同启动子驱动Fluc报告基因表达的重组质粒pGL3-CMV、pGL3-EF1α和pGL3-UbC。在Jurkat细胞中,不同启动了驱动的Fluc报告基因的相对酶活的强弱关系为pGL3-UbCpGL3-EF1αpGL3-CMVpGL3-MCS。结论可以选择高活性的人源泛素C启动子实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达,以利于Jurkat细胞系在哺乳动物T淋巴细胞以及免疫相关功能研究中的应用。     

以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立与初步应用

目的建立以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的高通量筛选模型,用于胰岛新生相关蛋白基因表达上调剂的筛选。方法以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA为模板扩增胰岛新生相关蛋白核心启动子序列,克隆至 pGL4.17质粒载体构建重组质粒。采用脂质体介导的方法将重组质粒和内参质粒 pRL-TK共转染金黄地鼠胰岛β细胞 HIT-T15,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达活性。对瞬时转染条件进行优化,以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作为阳性对照来评价模型的有效性,并利用该细胞模型对本研究所的化合物库进行筛选。结果构建了重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17-INGAP,并成功转染 HIT-T15细胞株。对模型进行优化后,应用阳性对照对其进行评价,Z＇因子为0.57,适用于进行高通量筛选。用该模型筛选了本所化合物库,其中白藜芦醇显示出较好的上调作用,EC50为1.6μg/ml。结论成功建立了以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

脂联素对HepG2细胞中脂肪酸 合成酶及激素敏感性脂肪酶基因启动子活性的影响

目的构建含人脂肪酸合成酶(FAS)及激素敏感性脂肪酶(HSL)基因启动子的荧光素酶报告基因表达质粒,探究脂联素对人肝癌细胞系HepG2中FAS及HSL基因启动子活性的影响。方法扩增人FAS及HSL启动子序列-622～+3 bp片段与-697～+53 bp片段,构建含人FAS及HSL启动子的pGL3-hFAS625-Luc(hFAS 625-Luc)与pGL3-hHSL750-Luc(hHSL 750-Luc)荧光素酶报告基因表达质粒。脂质体瞬时转染HepG2细胞,观察0.5～10.0μg/mL脂联素作用24 h或者5μg/mL脂联素作用2～32 h细胞中荧光素酶活性的变化。结果 hFAS 625-Luc与hHSL 750-Luc荧光素酶表达质粒均能在HepG2细胞中良好表达。1.0～10.0μg/mL脂联素作用24 h能剂量依赖性地促进转染hFAS 625-Luc及hHSL 750-Luc质粒的HepG2细胞中荧光素酶的表达,最高分别达到对照组的1.76倍(P0.01)和1.37倍(P0.01)。5μg/mL脂联素作用于转染hFAS 625-Luc质粒的HepG2细胞4 h和8 h能够促进荧光素酶的表达(P0.01),作用16 h和32 h则抑制荧光素酶的表达(P0.01);而脂联素对转染hHSL 750-Luc质粒HepG2细胞作用不同时间(2～32 h)均能促进荧光素酶的表达,最高为对照组的1.37倍(P0.01)。结论成功构建含人FAS与HSL启动子荧光素酶报告基因质粒。脂联素能够剂量依赖性地促进HepG2细胞中FAS及HSL启动子活性。脂联素作对FAS启动子的活性影响与作用时间有关,而对HSL启动子活性的影响一直表现为促进作用。     

以Apo A-Ⅰ为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立

目的 建立靶向人Apo A-Ⅰ转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增Apo A-Ⅰ上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17上游,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,在G418抗性存在的条件下,通过有限稀释法筛选稳定转染细胞株.对溶剂浓度和药物作用时间进行条件优化,应用阳性化合物染料木素评价模型有效性,通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.结果 通过PCR成功扩增了人Apo A-Ⅰ基因上游的启动予序列,构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP,并建立稳定转染细胞株ApoP-Luc HepG2.对筛选条件优化后,应用阳性化合物进行评价,筛选窗相关系数Z'因子为0.68,大于0.5,适于进行高通量筛选.应用该筛选模型对5000余种化合物进行筛选,4个黄酮类化合物和白藜芦醇显示出较好的活性,半数有效浓度均小于10μg/ml.结论 成功建立了人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂筛选模型,并利用该模型筛选到5个活性化合物.     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白通过降低P4启动子甲基化水平上调人IGF-II基因的转录

目的:构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2-HBx,探讨HBx对胰岛素样生长因子 II(IGF-II)基因P4启动子甲基化水平及转录表达的影响。方法:应用基因重组技术,构建含HBx基因的重组逆转录病毒载体pBABE-puro-HBx,采用磷酸钙共沉淀法将其转染293FT包装细胞产生逆转录病毒,感染HepG2肝癌细胞,采用嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting鉴定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx。采用亚硫酸氢盐测序法及实时荧光定量RT-PCR检测HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化水平及P4 mRNA表达水平变化。进一步将体外甲基化的人IGF-II基因P4启动子驱动的荧光素酶报告载体pGL3-P4及含HBx基因的pCMV-tag2B-X质粒共转染HepG2肝癌细胞,采用亚硫酸氢盐测序法及双萤光素酶实验检测pGL3-P4载体上P4启动子甲基化水平及转录调控活性变化。结果:(1)经Western blotting鉴定,成功构建了稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞株HepG2-HBx;(2)表达HBx蛋白的HepG2-HBx细胞中P4启动子甲基化CpG位点的比例(9.0%)明显低于对照细胞HepG2-control(25.0%)(P<0.01),而其P4 mRNA表达水平则为对照细胞HepG2-control的2.8倍;(3)共转染pCMV-tag2B-X质粒的HepG2细胞中pGL3-P4载体上P4启动子甲基化CpG位点的比例(60.8%)明显低于共转染对照质粒pCMV-tag2B的HepG2细胞(84.1%)(P<0.01),而前者P4启动子相对萤光素酶活性(14.12±0.89)则明显高于后者(4.61±0.76)(P<0.01)。结论:HBx蛋白可降低IGF-II基因P4启动子甲基化水平,进而上调其转录表达。     

以Apo A-I为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立

目的建立靶向人ApoA-I转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选ApoA-I基因表达上调剂。方法以人基因组DNA为模板,PCR扩增ApoA-I上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17上游,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,在G418抗性存在的条件下,通过有限稀释法筛选稳定转染细胞株。对溶剂浓度和药物作用时间进行条件优化,应用阳性化合物染料木素评价模型有效性,通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人ApoA-I基因表达上调剂。结果通过PCR成功扩增了人ApoA-I基因上游的启动子序列,构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP,并建立稳定转染细胞株ApoP-LucHepG2。对筛选条件优化后,应用阳性化合物进行评价,筛选窗相关系数Z’因子为0.68,大于0.5,适于进行高通量筛选。应用该筛选模型对5000余种化合物进行筛选,4个黄酮类化合物和白藜芦醇显示出较好的活性,半数有效浓度均小于10μg/ml。结论成功建立了人ApoA-I基因表达上调剂筛选模型,并利用该模型筛选到5个活性化合物。     

Construction and identification of a human liver specific microRNA eukaryotic expression vector

MiR-122 is one of the non-coding RNAs which showed its effects on the lipo-metablism, virus infection and HCC forming through regulation of liver gene expression. Its eukaryotic expression vector was constructed by using pSuper which was widely applied in the siRNA expression. The precursor of human miR-122 gene was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the human genomic DNA. The positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. The new expression vector of miR-122 was named pHsa-m122. PHsa-m122 and its controls were transfected to HepG2 cells. The miR-122 expression activity was evaluated by GFP122i sensor reporter plasmid through fluorescence detection and Western blot. It was shown that the fluorescence intensity of GFP122si and pHsa-m122 co-transfection group was weaker than that of the controls, so the functional activity of expressed miR-122 was detected. When HepG2 cells were co-transfected with HBV1.3 and pHsa-m122 plasmids, the results showed miR-122 may down-regulate the gene expression of HBV. The human liver specific microRNA eukaryotic expression vector of miR-122 was constructed successfully, which may facilitate further study of its function in the development of liver virus infection diseases and HCC. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

miR-483-5p通过上调IGF2基因转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭

目的:探讨miR-483-5p对人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因P3启动子驱动的m RNA(P3 m RNA)表达的影响及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:(1)采用real-time PCR检测人肝癌细胞株Huh7、Hep3B、Bel-7402、Hep G2和SMMC-7721,人正常肝细胞株HL-7702,83例人肝细胞癌组织和配对的癌旁组织,22例正常肝组织中miR-483-5p和P3 m RNA的表达水平,并应用Pearson相关分析评估P3 m RNA与miR-483-5p表达水平之间的关系。(2)将IGF2基因P3 m RNA的5’端非翻译区(5’UTR)克隆入p GL3启动子载体,构建P3 m RNA 5’UTR野生型(p GL3-P3-5’UTR-WT)及P3 m RNA 5’UTR突变型(p GL3-P3-5’UTR-MUT)重组萤光素酶报告质粒,将其分别与miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control共转染He La、293T及Huh7细胞,采用双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性。(3)分别将miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control转染Huh7及Hep3B肝癌细胞,应用real-time PCR检测这2种肝癌细胞P3 m RNA表达水平的变化。(4)应用real-time PCR检测肝癌细胞Huh7及Hep3B的细胞核和细胞质中miR-483-5p的表达水平;应用核连缀实验(nuclear run-on assay)分析miR-483-5p对P3 m RNA转录的影响;应用RNA稳定性实验分析miR-483-5p对P3 m RNA稳定性影响。(5)应用体外细胞功能实验研究miR-483-5p对Huh7肝癌细胞生长、凋亡、迁移与侵袭能力的影响。结果:(1)5种肝癌细胞株miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于正常肝细胞株HL-7702(P0.01),肝细胞癌组织中miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于配对的癌旁组织及正常肝组织(P0.01);线性相关分析显示,在5种肝癌细胞株及肝细胞癌组织中,P3 m RNA表达水平均与miR-483-5p水平呈正相关。(2)萤光素酶实验显示,miR-483-5p与P3m RNA 5’UTR的同源位点互补结合可促进P3 m RNA的表达。(3)瞬时转染实验显示,过表达miR-483-5p呈剂量依赖性促进Hep3B和Huh7肝癌细胞P3 m RNA表达水平的增高。(4)miR-483-5p表达实验显示,成熟miR-483-5p存在于肝癌细胞Hep3B和Huh7的细胞质和细胞核中;核连缀实验显示,miR-483-5p诱导Huh7肝癌细胞核中新生P3 m RNA转录;RNA稳定性实验表明,miR-483-5p不改变Huh7肝癌细胞P3 m RNA稳定性。(5)体外细胞功能实验显示,miR-483-5p促进Huh7肝癌细胞增殖,抑制其凋亡,并增强迁移与侵袭能力。结论:miR-483-5p高表达可部分通过上调IGF2基因P3 m RNA转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭,进而参与肝细胞癌发生。     

MicroRNA-122作用于HBx影响乙肝病毒复制

为了寻找与HBV感染相关的microRNA并初步探讨其作用机制,首先,我们前期研究发现在转染HBV表达质粒的HepG2细胞内,miR-122上调表达,推测miR-122与HBV的感染有关;在此基础上,本研究进一步将miR-122和表达HBV的质粒pCH9-HBV1.1共转染HepG2细胞,Southern blot检测发现miR-122可抑制HBV的复制。利用计算机软件miRanda预测表明,HBx可能是miR-122的作用靶序列;进一步利用荧光素酶报告基因系统和Western blot检测靶基因HBx蛋白表达改变,验证miR-122对HBx表达的调节作用。最终推测miR-122可能通过调节HBx的表达而影响HBV的复制。