一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的：探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法：以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道（big-conductance Ca2＋-activated potassium channels,BKCa）宏观电流以及自发性瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）。结果：采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论：穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。     

表达在HEK293细胞上的BKCa通道基本特性与动力学调控研究

目的构建稳定表达人血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)的293细胞系,并研究其基本电生理学特征和动力学模型。方法通过脂质体(lipofectamine 2000)转染法转染BKCa表达质粒pcDNA3.1-BKα和(或)pIRES-BKβ1,筛选稳定表达的单克隆细胞系。使用膜片钳多种记录方式研究其基本电生理学特性,同时建立BKCa动力学研究模型。结果构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系,通过膜片钳能够记录到具有与天然细胞BKCa电生理学特性相似的电流,包括大电导特性[内面向外式构型下单通道电导为(216.38±3.55)pS]、电压依赖性、Ca2+依赖性、钾离子选择性和200nmol/L IbTX(BKCa特异性阻断剂)阻断;联合表达β1亚单位能够明显增加通道的开放时程。采用inside-out宏观电流记录方式可以记录到明显的尾电流。可以用于分析通道激活、去激活等动力学模型及药物动力学作用机制。结论成功构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系。膜片钳实验证明具有典型的BKCa电生理学特性,同时建立的细胞系可以很好的用于BKCa通道功能调控研究和动力学参数分析。     

钙激活钾通道电流在膀胱逼尿肌不稳定中的表达变化研究

目的观察膀胱逼尿肌不稳定(DI)中钙激活钾通道(BKCa)电流变化,探讨BKCa在DI发生机制中的作用。方法通过膀胱出口部位梗阻法建立大鼠DI模型,取其膀胱平滑肌,酶消化分离单个平滑肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录BKCa宏观电流,比较其电流密度在DI和正常大鼠中的变化。结果大鼠膀胱平滑肌细胞表达较为丰富的BKCa电流,具有其他平滑肌细胞BKCa相似的电生理特性,即外向整流特性,能够被BKCa通道特异性阻断剂IbTX(300 nM)阻断。DI大鼠膀胱平滑肌BKCa在多个膜电位时电流密度明显下降,在膜电位为+60时电流密度由(32.42±7.97)pA/pF(n=21)下降到(20.56±4.63)pA/pF(n=18),两组相比,P<0.01。结论 BKCa可能参与了大鼠膀胱DI的发生,调控DI时BKCa通道活性可能作为治疗DI的靶点之一。     

人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道在HEK293细胞上的表达方法研究

目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值.方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法.结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 pS,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性.结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致.     

动脉平滑肌细胞膜片制作及其大电导钙激活钾通道的特性

目的: 探讨人体小动脉平滑肌细胞膜片制作方法,观察其上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activatedpotassium channels,BK_Ca)的特性。方法: 将新鲜分离出的人肠系膜动脉,分离出平滑肌层,经酶解得单个平滑肌细胞。取平滑肌细胞置于含对称性高钾(K+140 mmol/L)浴液中,用膜片钳技术记录其单通道电流,输入计算机进行数据采集与分析。观察动脉平滑肌细胞三种膜片的制作过程和BK_Ca的特性。结果: 在肠系膜动脉平滑肌细胞膜上分别形成了细胞贴附式、内面向外式、全细胞记录三种膜片。用膜片钳技术观察到急性酶分离的人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性:表现为胞内游离钙离子浓度增加,通道开放事件数目增加;电压依赖性:表现为随着膜电位的增加,通道开放事件数逐渐增加;电导值大:本实验的电导值为198.6±38.09 pS;应用TEA+为50 mmol/L时通道活动完全阻断。结论: 人体肠系膜动脉平滑肌细胞上BK_Ca通道具有钙敏感性、电压依赖性、大电导、TEA+敏感特性。     

大电导钙激活钾通道对子宫平滑肌作用的分析

大电导钙激活钾(large conductance Ca2+-activated K+-channel,BKCa)通道在未妊娠和妊娠子宫平滑肌细胞中是最主要的钾通道。BKCa通道的激活可导致细胞膜超极化,从而抑制电压依赖性钙通道的激活及钙离子的内流,引起平滑肌舒张。近年来的研究结果证实,子宫平滑肌细胞中BKca通道的激活、失活和变异与产科多种生理现象及疾病的发生有关,如可调控妊娠维持、分娩启动、产后出血、早产等。本文主要分析BKCa通道的基本结构,并总结分析近年来关于BKCa通道在生理妊娠及病理妊娠中相关作用的研究进展。     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌大电导钙激活钾通道的特性

目的探讨肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的电生理特性及其与张力调节的可能机制。方法木瓜酶、胶原酶两步消化法急性分离大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞,膜片钳的内面向外式记录法记录BKCa。结果(1)在浴槽液和电极液均为高钾的条件下,BKCa通道的单通道电导为(221±6)pS,反转电位为-0.12 mV;(2)BKCa通道的电流幅度无细胞内钙依赖性,而开放概率(NPo)则同时具有电压依赖性和细胞内钙依赖性。在细胞内钙浓度为0.1 μmol/L时, 使NPo增加e倍的电压增加为(13±1)mV, 达到最大开放概率一半的电压(V1/2)为(22±2)mV;(3)在细胞内钙浓度为1 μmol/L时,可记录到通道长时间的关闭和失活现象,这种现象称为钙依赖性失活。结论肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上的BKCa具有大电导、高钾选择性、强电压依赖性和高度的细胞内钙敏感性。BKCa高度的钙敏感性可能与血管平滑肌病理情况下的代偿调节有关。     

平滑肌肌浆网Ca~(2+)释放与STOCs相关性的研究进展

平滑肌细胞肌浆网(SR)上存在两种不同类型的钙释放通道:三磷酸肌醇敏感的钙释放通道(IP3R)和ryanodine敏感的钙释放通道(RyRs)。肌浆网产生的局部瞬时钙释放如钙火花或Ca2+puffs激活邻近胞膜上的钙激活钾通道产生自发性瞬时外向电流(STOCs)。近来研究表明IP3Rs和RyRs都参与肌浆网内钙的调节和平滑肌的舒张。这两种释放通道是否存在协同作用,以及如何影响STOCs,进而调控平滑肌的舒缩活动,不同组织存在很大差异。本文就此方面的研究进展进行综述。     

大电导钙激活钾通道(BKCa)在胃肠道平滑肌的研究

大电导钙激活钾通道(BKCa)属于钙激活钾通道的一种,因其电导值较大而区别于其它亚型.它接受细胞膜电位和胞内Ca2+浓度的双重调节,又可通过负反馈效应反向调节细胞膜电位及胞内Ca2+浓度.BKCa通道在较多细胞中都有表达如:平滑肌细胞、神经细胞、感觉细胞、上皮细胞,因此参与了体内一些重要的生理过程的调节,如:平滑肌细胞的收缩舒张、神经递质的释放、炎症的发生发展.近年,离子通道在胃肠道动力中所起的作用引起广泛关注,BKCa通道在胃肠道平滑肌的研究已有一定基础,本文将就相关方面做一综述.     

氟灭酸对豚鼠微动脉平滑肌细胞BKCa通道的增强作用

目的 观察氟灭酸对微动脉平滑肌细胞电生理学特性的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术在离体豚鼠脑动脉(BA)和肠系膜动脉(MA)的平滑肌细胞上,观察氟灭酸(100～1 000 μ mol/L)对微动脉平滑肌细胞膜电流的影响.结果 4-氨基吡啶(1 mmol/L)和四乙胺(1mmol/L)都可以部分抑制微动脉平滑肌细胞膜电流.氟灭酸可以浓度依赖的增强微动脉平滑肌细胞膜电流,100、300和1000μmol/L氟灭酸分别使BA平滑肌细胞膜电流幅度(+40 mV)增强了(36±14)％、(136±26)％和(223±24)％,使MA平滑肌细胞膜电流幅度(+40mV)分别增强了(45±11)％、(166±24)％和(278±24)％.氟灭酸增强平滑肌细胞膜电流具有电压依赖性,氟灭酸主要增强0～+40 mV电压区间的激活电流,其中对+40 mV激活电流的增强作用最强.背景灌流四乙胺(1mmol/L)能显著抑制氟灭酸对微动脉平滑肌细胞膜电流的增强作用.结论 氟灭酸可以浓度和电压依赖的激活微动脉平滑肌细胞膜上BKCa通道.     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌大电导钙激活钾通道的特性

OBJECTIVE: To investigate the electrophysiological properties of large-conductance calcium-activated potassium channel (BKCa) in mesenteric arteriole smooth muscle cells of rat. METHOD: Mesenteric arteriolar smooth muscle cells from rats were isolated and inside-out patch clamp technique was used to study BKCa. RESULTS: The single channel conductance of BKCa recorded was 221+/-6 pS and the reversal potential was -0.12 mV in the presence of high potassium in the bathing and pipette solutions. The open probability (NPo) of the channel was both voltage- and intracellular calcium dependent, whereas the amplitude of the channel was not calcium-dependent. Prolonged closed state could be observed at intracellular calcium concentrations of 1 micromol/L or above, known as calcium-dependent inactivation. CONCLUSION: BKCa in rat mesenteric arterial smooth muscle cells has the properties of large conductance, high potassium selectivity, steep voltage dependence and high calcium sensitivity. The high sensitivity to calcium of BKCa may be related to the compensatory regulation of the smooth muscles in pathophysiological conditions.     

D型钠尿肽对豚鼠胃窦环形肌细胞钙敏感钾电流的影响及其作用机制

[目的]记录D型钠尿肽（DNP）对豚鼠胃窦环形肌钙敏感钾电流[IK（Ca）]的影响以探讨DNP抑制胃动力的离子通道机制。[方法]用全细胞式膜片钳技术观察DNP对豚鼠胃窦环形肌细胞IK。、和瞬间外向钾电流（STOCs）的影响。[结果]DNP明显增加豚鼠胃窦环形肌IK‰1和STOCs,并显示剂量依赖关系。0．1、1、10和100nmol/L的DNP能增加IK‰、的幅度,分别为（16．7&#177;1．12）％、（26．5&#177;2．3）％、（46．2&#177;3．3）％和（58．3&#177;3．7）％.细胞外液用无钙液或Rynodine受体的阻断剂均不能阻断此效应,但IP3受体的阻断剂肝素或鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583能抑制这种效应。另外,cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂Zaparinast可明显增强DNP对STOCs的增加作用。[结论]DNP通过增加cGMP的产生和激活IP3受体使豚鼠胃窦环形肌细胞上IK（Ca）增加,细胞超极化,从而实现对胃窦环形肌的舒张作用。     

大鼠海马神经干细胞外向电压门控性钾通道的电生理特性

目的 研究大鼠海马源神经干细胞(NSC)外向电压门控性钾通道(Kv)的电生理特性.方法 利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSC.以免疫细胞化学方法对NSC及其分化后的子代神经细胞进行鉴定.应用膜片钳技术全细胞模式记录不同外向Kv通道的电生理特性.结果 体外培养SD大鼠海马组织源NSC表达巢蛋白(nestin),在体外可诱导分化产生分别表达Tuj1和GFAP的细胞.全细胞膜片钳可记录到三种外向Kv通道:一种缓慢激活的、对四乙基胺(TEA)敏感的延迟整流钾电流(IDR);一种快速激活和失活、可被4-氨基吡啶(4-AP)阻断的外向瞬时钾电流(IA),其在+20 mV和+50 mV的电流密度分别为11 pA/pF±3 pA/pF和29 pA/pF ±7 pA/pF(标本数=11);一种可被iberiotoxin(IbIX)抑制的大电导钙激活钾通道(BKCa),钳制电位+80mV时,加入100 nM IbTX前后的电流密度分别为56 pA/pF ±4 pA/pF和45 pA/pF±4 pA/pF(标本数=6.P＜0.05).结论 体外培养的未分化状态下SD大鼠海马源NSC至少含有IDR、IA和BKCa三种外向Kv通道.     

雌激素激活血管平滑肌细胞钙激活钾通道的非基因组机制研究进展

大电导钙激活钾通道(BKCa)由形成孔道的α亚基及具有调节作用的β亚基组成,因其电导大,对调节平滑肌细胞功能起重要作用,从而成为近年来研究的热点。研究发现雌激素经细胞膜上的雌激素受体介导,通过胞内多种信号转导通路激活内皮型一氧化氮合酶进而产生NO直接或间接激活BKCa通道,产生快速血管效应。随着分子生物学及膜片钳技术的发展,人们在雌激素对BKCa调节机制方面进行了深入的研究,本文就此内容进行综述。     

新生大白鼠大脑皮层神经元的培养及其基本电生理学特性研究

目的建立一种较为理想的适用于膜片钳制技术的神经元培养方法,并观察其形态学和电生理学特性.方法改进的神经元原代培养方法及膜片钳单通道记录法.结果采用此方法能获得形态典型的神经元,用膜片钳单通道记录法能记录到两类正常的通道电流(KCa和KATP).结论该培养方法获得细胞数量多,细胞质量高,电生理特性正常.     

原代培养猪冠状动脉平滑肌的电压依赖和钙激活钾通道

目的：研究原代培养的猪冠状动脉平滑肌电压依赖性和钙激活外向钾通道的特性。方法：离子通道电流采用膜片钳技术进行记录。结果：在内面向外式膜片构型,当膜内外K^ 浓度梯度类似生理状态时,该通道单位电导值约为100pS,而当膜内外K^ 浓度为对称的140mM浓度时,该通道单位电导值约270pS。其平均电流显示该通道具时间和电压依赖性激活特性,而无任何时间和电压依赖性失活特性。另外,通道的开放时间常数和开放概率随除极及胞内Ca^2 的增加而显著增加。通过用EGTA降低胞浆内Ca^2 浓度,可使外向电流抑制。动力学分析显示通道激活时存在一种开放状态和至少两种关闭状态。四乙胺（TEA）可在胞外侧阻断该电流,但高达15mM的4－氨基吡啶（4－AP）在胞内外都对通道无影响。在全细胞构型,对细胞膜进行除极可引出宏观外向电流。随着细胞的除极,该电流的激活时间常数逐渐缩短,并显示快速激活动力学特性。结论：在原代培养的猪冠状动脉平滑肌上存在有电压依赖和Ca^2 激活的K^ 选择性离子通道。该类通道具有非常高的单位电导值,除极时快速开放,对胞内Ca^2 高度敏感,但无失活等特性。     

Rg_2与R_f对钙通道作用的单通道分析

在单个Ｗｉｓｔａｒ大鼠乳鼠心室肌细胞上，用连细胞电压钳法，观察人参三醇组皂甙单体Ｒｇ２、Ｒｆ６０μｍｏｌ·Ｌ－１对钙通道单通道活动的影响，并与钙通道阻滞剂异博定７９μｍｏｌ·Ｌ－１、钙通道激动剂ＢＡＫ８６４４５μｍｏｌ·Ｌ－１对照，证明Ｒｇ２对钙通道有阻滞作用，其机理在于使钙通道的开放时间缩短、开放概率减少、关闭时间延长，而对Ｂａａ＋流幅值无明显影响，Ｒｆ可缩短Ｌ型钙通道的开放时间、延长关闭时间、降低开放概率。     

K~+ Channels and Their Effects on Membrane Potential in Rat Bronchial Smooth Muscle Cells

In order to investigate the K~+ channels and their effects on resting membrane potential(Em) and excitability in rat bronchial smooth muscle cells (BSMCs), the components of outward K~+channel currents and the effects of K~+ channels on Em and tension in rat bronchial smooth musclewere observed by using standard whole-cell recording of patch clamp and isometric tension recordingtechniques. The results showed that under resting conditions, total outward K~+ channel currents infreshly isolated BSMCs were unaffected by ATP-sensitive K~+ channel blocker. There were two typesof K~+ currents: voltage-dependent delayed rectifier K~+ channel (Kv) and large conductance calcium-activated K~+ channel (BK_(Ca)) currents. 1 mmol/L 4-aminopyridine (4-AP, an inhibitor of Kv)caused a significant depolarization (from — 8.7±5.9mV to —25.4±3.1mV, n=18, P<0.001).In contrast, 1 mmol/L tetraethylammonium (TEA, an inhibitor of BK_(Ca)) had no significant effect onEm (from —37.6±4.8 mV to —36.8±4.1 mV, n=12, P>0.05). 4