骨髓间充质干细胞作为胰腺癌基因治疗载体的实验研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞对胰腺癌的聚集作用。方法:体外分离培养纯化绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞,通过Transwell共培养体系观察骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PNAC-1的迁移;建立裸鼠胰腺癌移植瘤模型,经尾静脉回输骨髓间充质干细胞至荷瘤鼠体内,荧光显微镜动态观察肿瘤组织及其他脏器组织中骨髓间充质干细胞的分布及含量。结果:通过贴壁培养获得小鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测证实,CD44+CD45-、CD90+CD45-细胞均占细胞总数90%以上;Transwell共培养提示骨髓间充质干细胞向胰腺癌细胞PANC-1迁移,且随着肿瘤细胞数的增多,细胞迁移的数量增多(P<0.05);体内实验证实,骨髓间充质干细胞向胰腺癌组织特异性地靶向聚集,10 d内随着时间的延长骨髓间充质干细胞在胰腺癌组织中逐渐增多(P<0.05),10 d后增加不明显。结论:小鼠骨髓间充质干细胞体外向胰腺癌细胞迁移,体内向胰腺癌组织靶向聚集。     

骨髓间充质干细胞外泌体miR-25-3p调控骨肉瘤细胞增殖迁移及侵袭能力的功能与机制研究

目的:探究骨髓间充质干细胞外泌体miR-25-3p对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制.方法:流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞,提取并鉴定骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC exo),将miR-NC和miR-25-3p mimic转染至MG-63细胞(miR-NC组和miR-25-3p mimic组),将10μg/mL...     

流体剪切应力对人骨髓间充质干细胞增值及细胞周期的影响

目的观察流体剪切应力对人骨髓间充质干细胞增值及细胞周期的影响.方法人骨髓间充质干细胞受强度为3 dyne/cm2的流体剪切力刺激30 min,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞仪检测细胞的增殖能力和细胞周期.结果流体剪切力作用后,细胞增殖能力提高,细胞活性增强.S期细胞百分比(13.53±1.47)%较对照组细胞的S期百分比(7.45±2.65)%约增高近181.6%.结论流体剪切力对人骨髓间充质干细胞具有提高细胞增殖能力及增强细胞活性的作用.     

SDF-1/CXCR4轴介导大鼠骨髓间充质细胞向心肌梗死组织迁徙的体外实验研究

目的研究基质细胞衍生因子1（SDF-1）／CXCR4轴在骨髓间充质细胞迁徙到梗死心肌中的作用。方法全骨髓贴壁法培养骨髓间充质细胞,结扎SD大鼠左前降支制作急性心肌梗死模型并制备正常和梗死心肌组织提取液,利用Boyden小室体外迁移体系观察不同浓度SDF-1和心肌组织提取液对骨髓间充质细胞的趋化作用,及AMD3100处理骨髓间充质细胞对心肌组织提取液趋化骨髓间充质细胞的影响。结果成功培养了骨髓间充质细胞并建立了大鼠急性心肌梗死模型。SDF-1对骨髓间充质细胞有剂量依赖性的趋化作用,梗死1周的心肌组织提取液对骨髓间充质细胞有明显的趋化作用,而这种作用可部分被SDF-1受体CXCR4的阻断剂AMD3100抑制。结论梗死心肌组织提取液对骨髓间充质细胞有明显的趋化作用,SDF1／CXCR4可能是梗死心肌组织提取液中趋化骨髓间充质细胞的主要趋化因子／受体对。     

BrdU标记的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位数量的变化

目的 :观察BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率及移植后的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位不同时间中的数量变化情况。方法 :酶标仪分别测出骨髓来源间充质干细胞及BrdU阳性间充质干细胞光密度值 ,计算标记率。将经BrdU标记后的骨髓来源间充质干细胞注射入冠状动脉左前降支中段结扎处的大鼠左心室壁内 ,术后第 5、10、15、2 0天行抗BrdU抗体免疫组织化学染色。结果 :BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率约为 4 1.4 1%。移植后第 5天BrdU阳性细胞数多于移植后第 10天 (P <0 .0 5 ) ,而移植后第15、2 0天与第 10天相比BrdU阳性细胞数无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论 :BrdU能对骨髓来源间充质干细胞起到较好的标记和“跟踪”作用 ,移植入心脏壁内的间充质干细胞数量第 10天比第 5天减少 ,以后基本稳定的变化过程。     

干细胞因子对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的 初步探讨干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)定向迁移的影响.方法 密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代.利用KT-PCR方法检测BMSCs对干细胞因子受体c-kit的表达,使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,评估干细胞因子对BMSCs定向迁移的影响以及p38丝裂原活化蛋白激酶通路(p38MAPK)抑制剂SB203580对干细胞因子诱导BMSCs迁移能力变化的影响.结果 通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的MSCs.RT-PCR证实BMSCs表达c-kit;干细胞因子可趋化体外模型中BMSCs通过聚碳酸酯膜向下室内迁移,在0～50ng/mL浓度范围内迁移细胞数量随干细胞因子的浓度增加而增加.加入SB203580后干细胞因子诱导的BMSCs迁移受到抑制.结论 干细胞因子可以趋化BMSCs发生定向迁移,这一迁移过程的细胞内信号转导与p38MAPK通路有关.     

活化T细胞及IFN-γ对间充质干细胞中血红素加氧酶-1抗凋亡作用的影响

目的 探讨免疫活性细胞和免疫调节因子对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中血红素加氧酶-1(HO-1)的影响.方法 体外培养人骨髓间充质干细胞,在IFN-γ及PHA活化的T细胞刺激下,应用RT-PCR方法检测HO-1 mRNA的表达情况.应用流式细胞术分析细胞凋亡情况.结果 正常骨髓间充质干细胞中HO-1 mRNA在IFN-γ及活化的T细胞刺激后表达下调.流式细胞术结果显示,在IFN-γ锌原卟啉-Ⅸ(Znpp-Ⅸ)、IFN-γ+Znpp-Ⅸ的刺激下,间充质干细胞出现明显的凋亡,凋亡率分别为(56.50±0.16)%、(56.85±2.27)%、(82.53±2.65)%,较正常MSCs组显著增高[(7.56±1.43)%,P<0.05].结论 免疫活性细胞及免疫调节因子使骨髓间充质干细胞中HO-1 mRNA表达下凋,进而促进MSCs凋亡.     

骨髓间充质干细胞对肥大心肌细胞脂肪酸代谢影响的体外研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞对肥大心肌细胞脂肪酸代谢的影响及其机制.方法:体外培养的Wistar新生大鼠心肌细胞随机分为3组:正常对照组、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用组、骨髓间充质干细胞干预组,采用免疫荧光显微镜测定心肌细胞核因子NF-кB和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)PPARγ、PPARα的活性,紫外分光光度法检测心肌细胞内游离脂肪酸(FFA)含量.结果:AngⅡ刺激乳鼠心肌细胞NF-кB活性增强,抑制PPARα和PPARγ活性减弱,增加心肌细胞内FFA蓄积(P<0.01);MSCs干预组心肌细胞NF-кB活性及心肌细胞内FFA含量较AngⅡ作用组显著降低(P<0.01和P<0.01)而PPARα和PPARγ活性增强(P<0.05和P<0.01).结论:骨髓间充质干细胞可改善肥大心肌细胞的脂肪酸代谢,这可能是骨髓间充质干细胞移植改善心功能作用机制之一,NF-кB及PPARs可能是其作用的信号通路之一.     

肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究

目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间允质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变.方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72 h后观察H22细胞增殖状态.结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间允质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72 h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组.结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应.     

表面修饰PET材料对骨髓间充质干细胞增殖、迁移能力的影响及其机制研究

目的：研究表面修饰聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）材料对骨髓间充质干细胞增殖、迁移能力的影响及机制。方法：取SD大鼠进行骨髓间充质干细胞培养,并参考Atthoff的方法进行PET材料表面修饰;表面修饰的PET材料与骨髓间充质干细胞复合培养为观察组,常规PET材料与骨髓间充质干细胞复合培养为对照组,通过MTT的方法检测细胞活力,划痕试验检测细胞迁移能力,Western-blot的方法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的蛋白水平。结果：观察组细胞的细胞活力、迁移能力均高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;观察组细胞的MMP-2、MMP-9含量高于对照组,Caspase-3、caspase-9含量低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：表面修饰的PET人工韧带体与间充质干细胞复合培养有助于增强细胞的迁移和增殖能力,MMP-2、MMP-9、Caspase-3、Caspase-9是其可能的分子机制。     

不同组织源性细胞作为大动物骨缺损修复研究用骨组织工程种子细胞的增殖及成骨分化比较

【目的】比较源自同一大动物个体不同组织的成骨性种子细胞的体外增殖及成骨分化能力,寻找和筛选更符合大动物骨缺损修复研究要求的种子细胞来源和分离方法。【方法】选用中国青山羊模型,参照常规方法,分离骨膜、骨髓、脂肪源性细胞进行体外培养,倒置显微镜观察,记录原代细胞的汇合生长时间;细胞传代后成骨诱导培养21 d,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活力;细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性及细胞分泌骨桥蛋白测定、钙结节茜素红S染色检测细胞的成骨分化能力。【结果】骨膜、脂肪、骨髓源性原代细胞汇合生长时间分别为14、11和7 d;传代后MTT法检测显示细胞增殖能力从强到弱依次为骨髓、脂肪、骨膜源性细胞。细胞内ALP活性、细胞分泌骨桥蛋白及钙结节染色显示细胞进入成骨分化的先后顺序依次为骨膜、骨髓、脂肪源性细胞。【结论】在体外培养的各个阶段,来自同一大动物个体的不同组织源性细胞的增殖及成骨分化能力存在明显差异,其中骨髓及脂肪源性细胞更适于大动物骨缺损研究的需要。     

人脐带间充质干细胞的无动物血清培养及向肝细胞诱导分化

目的 探索从脐带组织中分离培养间充质干细胞的无动物血清方法,并将其向肝细胞诱导分化。方法 分离自体脐血清用于后续细胞培养,利用酶消化法从脐带组织中分离培养间充质干细胞,检测其形态和免疫表型,并采用两步法诱导其向肝细胞诱导分化。结果  流式细胞术检测结果表明,自体脐血清培养得到的贴壁细胞表型符合间充质干细胞特征,且在合适诱导条件下能肝样细胞分化,经过4周处理,能表达肝细胞特异性基因,部分细胞具有吞噬低密度脂蛋白的能力。结论  采用自体脐血清有效地培养脐带间充质干细胞,具备向肝细胞的分化能力。     

糖皮质激素对血清剥夺成人骨髓间充质干细胞及其RS细胞亚群的保护作用

目的:探讨血清剥夺(SD)导致成人骨髓间充质干/祖细胞群(hMSCs)中成熟MSC(mMSC)和快速自我更新细胞(RS细胞)亚群凋亡、坏死及糖皮质激素(GC)的保护作用。方法:以无血清体外培养hMSCs为模型,经细胞形态学观察和Annexin V-PI双染流式细胞仪检测,观察细胞形态变化、核变化及活性/凋亡率变化。结果:SD 12h后hMSC皱缩变圆、染色质固缩,出现凋亡各阶段形态特征;与对照组相比mMSC及RS活性明显降低并且凋亡率升高(P<0.01),与血清剥夺组相比添加10nM DXM后细胞活性显著提高(P<0.01);并且RS细胞亚群对SD环境表现出更强的耐受性,与mMSC亚群相比存活率提高2.75倍,凋亡率降低近三分之一,并在糖皮质激素的保护作用下继续保持良好增殖。结论:糖皮质激素可以提高干细胞自我保护能力,并且RS细胞具有更强的自我保护能力和自我调节机制。     

自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞治疗兔感染性骨缺损的实验研究

目的探讨自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞治疗感染性骨缺损的效果,为临床应用提供实验依据。方法将24只新西兰白兔制成双侧桡骨中段1cm的感染性骨缺损,随机分为两组,分别植入自体微小颗粒骨、自体微小颗粒骨与骨髓间充质干细胞,于术后2、4、8、12周行X线及组织学检查,并行Lane-sandhu评分。结果术后2、4、8周自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞移植组X线评分及组织学评分高于自体微小颗粒组(P﹤0.05);术后第12周两组X线及组织学评分差别无统计学意义(P>0.05)。结论自体微小颗粒骨复合骨髓间充质干细胞修复感染性骨缺损的能力优于自体微小颗粒骨移植。     

骨髓间充质干细胞移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用。方法按随机化原则将50只脑梗死大鼠模型随机分为BMSCs移植组、上清液移植组各22只及对照组6只。BMSCs组在脑梗死大鼠模型成功后3 h经静脉注入BMSCs 1 ml,上清液组注入上清液1 ml,对照组注入磷酸盐缓冲液(PBS)1 ml。术后28 d检测PBMSc在脑内的存活转化情况。分别于0、7、14及28 d观察记录各组大鼠的神经损伤严重程度评分(NSS)。结果 28 d后,BMSCs脑梗死灶边缘可见少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),而上清液组及对照组病灶边缘则无NSE;细胞移植后,各组神经功能均有不同程度的恢复;从第7天起,BMSCs移植组NSS评分明显低于上清液组及对照组(P<0.05),而后2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植入急性脑梗死大鼠体内后,可存活、移行至梗死灶周围,并分化为神经元细胞,而且能够减轻脑梗死大鼠的神经损伤程度。     

补骨脂素对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞Notch信号通路的影响

目的:观察补骨脂素对绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞Notch信号通路的影响。方法:无菌条件下抽取绝经后骨质疏松患者和体检健康女性的骨髓间充质干细胞,分离培养并进行传代。鉴定并确定培养细胞。比较绝经后骨质疏松患者骨髓间充质干细胞以及健康人群骨髓间充质干细胞的生物特征,根据实时定量聚合酶链式反应比较Notch信号通路关键因子的表达水平,对干细胞进行成骨诱导和成脂诱导,在补骨脂作用下根据RT-PCR检测Notch信号通路关键分子的表达情况。结果:与正常健康女性比较,绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞内Notch信号通路减弱,差异有统计学意义(P0.05)。给予补骨脂后能够逆转干细胞内已降低的Notch信号通路活性,其中Hes1表达水平升高3倍左右。在成骨分化和成脂分化过程中补骨脂能够促进成骨分化,同时抑制成脂分化和Notch信号通路活化。结论:Notch信号通路能够影响绝经后骨质疏松症的发生发展,可能是补骨脂治疗绝经后骨质疏松症的新机制。     

牛膝含药血清对体外培养人间充质干细胞增殖与分化的影响

目的研究牛膝对体外培养人间充质干细胞的增殖与分化的影响及其可能的分子机制。方法制备牛膝含药血清,分离与扩增人间充质干细胞,MTT法检测牛膝含药血清对体外培养的间充质干细胞增殖作用的影响,检测碱性磷酸酶与骨钙素以反映细胞分化水平的改变,RT-PCR检测成骨相关转录因子的表达。结果间充质干细胞的增殖速度加快,并能上调转录因子Msx2的表达,而碱性磷酸酶与骨钙素的表达没有变化。结论牛膝在体外有促进人间充质干细胞细胞增殖的作用,而不影响其分化。     

激素性股骨头坏死模型骨髓间充质干细胞的生物学特性评估

目的评估激素性股骨头坏死模型自体骨髓间充质干细胞增值能力及定向诱导能力。方法建立SD大鼠激素性股骨头坏死动物模型,行病理检查,验证模型。取模型组和对照组的骨髓间充质干细胞进行细胞生物学特性评估。结果联合运用牛血清和激素能够较好地建立激素性鼠股骨头缺血性坏死动物模型,激素性股骨头坏死SD大鼠的骨髓间充质干细胞,增值速率显著慢于对照组(P<0.05),其骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导后ALP染色阳性,但茜素红染色显示钙结节数量少于对照组,向成脂细胞定向诱后油红O染色示脂肪细胞少于对照组。结论实验组骨髓间充质干细胞仍具备干细胞的生物学特性,但相对于对照组其增殖能力减弱,成骨、成脂潜能减弱。     

rhBMP-2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞分化作用长期效应的实验研究

目的：检测重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)和重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞(BMSC)分化作用的长期效应。方法：采用考马斯亮蓝测定法检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后兔BMSC在第2、5、7和10天时的蛋白质含量水平，以反映对细胞分化作用的影响，并进行统计学分析。结果：rhBMP-2能在较长时间内明显促进细胞的蛋白质含量增加，而rhbFGF则起抑制作用，并且均呈浓度依赖性。rhBMP-2单独应用与两种生长因子联合应用的效应相近，而且均高于rhbFGF单独应用或两种因子序贯应用的效应。结论：rhBMP-2和rhbFGF的不同应用方式对BMSC分化作用的长期效应不同。     

兔不同部位脂肪间充质干细胞成骨能力的差异

目的观察兔不同部位来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）分化成骨的能力。方法分别从一只新西兰兔的腹股沟、腹膜后、颈背部取出脂肪组织并提取脂肪间充质干细胞,体外培养传至第5代,加入诱导剂分别进行成骨诱导,不加入诱导剂的为对照组。观察通过钙钴染色、茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测细胞成骨能力。结果经钙钴染色及茜素红染色后,诱导组大部分细胞呈阳性反应,以腹股沟部脂肪间充质干细胞的结节体积最大,对照组未见明显阳性细胞。细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性检测表明诱导组比对照组ALP活性明显升高（P〈0.05）;腹股沟部脂肪间充质干细胞ALP活性较颈背部及腹膜后高,差异有统计学意义（P〈0.05）;颈背部与腹膜后相比较无明显差异（P〉0.05）。结论兔ADSCs经过体外诱导后,具有成骨能力;腹股沟部脂肪可作为骨组织工程种子细胞来源的较佳取材部位。