系统性硬皮病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的研究

目的：测定系统性硬皮病患者外周血中的内皮祖细胞（endothelial progenitors cells,EPCs）数量和增殖、迁移、黏附功能,探讨EPCs在其发病中的作用。方法：系统性硬皮病患者和健康者各20例。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞并培养,流式细胞仪检测CD133^＋、CD34^＋或CD133^＋、VEGFR2^＋双荧光标记的EPCs数。MTT比色法、Millicell小室和黏附能力测定实验分别检测EPCs的增殖、迁移和黏附能力。结果：系统性硬皮病患者外周血EPCs数为（0．10±0．09）％,健康对照组为（0．49±0．09）％,P〈0．01,系统性硬皮病患者外周血EPCs数较健康者减少。实验组外周血EPCs增殖、迁移和黏附能力分别为（13．01±4．33）％、（7．20±3．67）个／视野和（15．20±4．40）个／视野,健康对照组分别为（23．28±4．34）％、（14．15±2．98）个／视野和（24．80±3．58）个／视野,两组比较,P值均〈0．01,实验组EPCs增殖、迁移和黏附能力均较对照组有所下降。结论：系统性硬皮病患者外周血EPCs数量减少,增殖、迁移和黏附功能降低,可能参与了系统性硬皮病的发病。     

循环内皮祖细胞数量与抑郁症的关系研究

目的 抑郁症患者外周血中循环内皮祖细胞（EPCs）数量的变化,探讨抑郁症患者血管内皮功能的改变及其与抑郁状态的关系.方法 选择抑郁症患者30例为病例组,正常健康成人30例为对照组,以CD34、CD133/AC133、VEGFR2/KDR荧光抗体标记EPCs,采用流式细胞仪检测两组循环EPCs的CD34^＋、CD34^＋/KDR^＋、CD133^＋/KDR^＋、CD34^＋/CD133^＋/KDR^＋表达情况.结果 抑郁症组的CD34^＋、CD34^＋/KDR^＋、CD133^＋/KDR^＋、CD34^＋/CD133^＋/KDR^＋细胞数均明显低于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.Pearson相关分析显示汉密尔顿抑郁量表总分与循环EPCs CD34^＋、CD34^＋/CD133^＋/KDR^＋细胞数呈负相关（P＜0.05）,与CD34^＋/KDR^＋、CD133^＋/KDR^＋细胞数无相关关系（P ＞0.05）.结论抑郁症患者的循环EPCs数量减少,且EPCs水平与抑郁症状的严重程度存在负相关.     

降糖治疗对老年冠心病合并糖尿病患者外周血内皮祖细胞影响的研究

目的通过观察降糖治疗对老年冠心病合并糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的影响,为老年冠心病合并糖尿病患者的动脉粥样硬化治疗寻求新措施。方法以我院2012年4月-2013年1月接收诊治的47例老年冠心病合并糖尿病患者为降糖治疗组,45例健康者为对照组,采用流式细胞仪、DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I免疫荧光双染法和MTT比色法等进行鉴定计数、增殖功能、黏附功能和迁移功能检测,比较两组外周血内皮祖细胞数量与功能的差别,并且比较降糖治疗组治疗前后外周血内皮祖细胞的数量及功能的变化。结果降糖治疗组治疗前外周血内皮祖细胞数量和增殖、黏附和迁移功能均低于对照组,降糖治疗后与治疗前相比,CD34、CD133、VEGFR2、vWF、CD34/CD133细胞数量增加,增殖、迁移功能增强,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论老年冠心病合并糖尿病患者存在外周血内皮祖细胞数量减少及增殖、黏附和迁移功能的缺失,降糖治疗对体内受损的内皮祖细胞具有改善作用,有利于减缓冠状动脉粥样硬化进程。     

不稳定型心绞痛患者外周血内皮祖细胞与冠状动脉狭窄程度的关系

目的:探讨外周血内皮祖细胞(EPCs)的数量与不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度的相关性。方法:选取不稳定性心绞痛患者53例作为患者组,同期无冠状动脉病变患者33例作为对照组。患者入院后即抽取静脉血,采用流式细胞仪检测单个核细胞中CD34及CD133双阳性细胞(EPCs)的数量。然后行冠状动脉造影,采用Gensini评分系统对冠脉病变程度进行定量分析。分析外周血EPCs数量与冠脉病变程度的关系。结果:不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量较对照组明显减少(P<0.05);冠状动脉狭窄程度严重的患者外周血EPCs数量明显高于狭窄程度较低的患者(P<0.05);冠脉狭窄的严重程度与EPCs数量呈正相关(P<0.05)。结论:不稳定性心绞痛患者外周血内皮祖细胞的数量明显降低,冠脉狭窄可导致外周血EPCs数量增多。     

不同程度的妊娠期高血压疾病患者外周血中内皮祖细胞数量改变的研究

目的 探计不同程度的妊娠期高血压疾病患者外周血中内皮祖细胞数量的变化.方法 选择15例重度子癫前期患者为子癫前期组,15例轻度子癫前期患者为对照组,采用Beckman-Coulter EpicsXL型流式细胞仪检测两组孕妇外周血中内皮祖细胞表达情况.结果 子癫前期组CD+34/CD+45和CD62P+总数占外周血中有核细胞总数的百分比明显高于对照组,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 不同程度的子癫前期可能与内皮祖细胞数量的改变有关.     

外周血内皮祖细胞改善肢体缺血的研究

目的:研究人外周血来源内皮祖细胞(EPC)移植对改善肢体缺血的作用. 方法:人外周血单个核细胞在体外诱导扩增6 d和14 d后,分别检测其EPC特异性标志的表达,并将荧光染料标记后的培养第6日的贴壁细胞通过缺血局部多点注射移植到后肢缺血的裸鼠动物模型体内,以评价其治疗效果. 结果:人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6日的贴壁细胞表达KDR, CD133, CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%, (33.8±11.7)%, (73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%;培养第14日的贴壁细胞KDR, CD34和vWF的表达阳性率均增高,而CD133表达阳性率明显降低,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%, (88.9±5.4)%, (78.3±13.6)%和(3.8±8.7)%;移植EPC后裸鼠缺血后肢的坏死情况和毛细血管密度均较对照组明显改善(P＜0.05);移植EPC后缺血后肢肌肉石蜡切片中可见分散不均的红色和黄绿色双色荧光的细胞掺入. 结论:从人外周血单个核细胞中可诱导出EPC,而且移植的EPC可以定向整合到后肢缺血局部,明显改善裸鼠后肢缺血.     

人脐血内皮祖细胞体外扩增、鉴定和生物学活性

目的 建立一种稳定的体外分离培养和鉴定人脐血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的方法 ,并探讨利于EPCs增殖的最佳接种浓度.方法 采用密度梯度离心法分离得到单个核细胞,制成1×106/ml、1.5×106/ml、2 × 106/ml、2.5×106/ml、3 × 106/ml、3.5×106/ml、4×106/ml 7个密度接种于铺被人纤维连接蛋白的培养瓶,比较各接种密度的贴壁细胞数和细胞集落形成情况,并采用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和免疫荧光鉴定EPCs.结果 不同接种密度得到的贴壁细胞数和细胞集落数有差别,在2.5×106/ml密度接种时得到的最佳贴壁细胞数和细胞集落数,与其他密度比较差异有统计学意义(P<0.05);双染色阳性细胞为正在分化EPCs;流式细胞仪检测内皮祖细胞对CD34、AC133、VEGFR2的阳性表达率分别为(1.67±0.35)%、(12.63±9.70)%、(66.81±6.63)%;免疫荧光检测内皮祖细胞一致性表达CD34、AC133、VEGFR2;黏附能力和迁移能力检测结果 分别为(33.7±1.6)、(29.2±1.2).结论 采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以较好地分离人脐血EPCs,以2.5×106/ml的密度接种培养可获得良好的细胞分化和增殖.     

高浓度软脂酸体外抑制人外周血内皮祖细胞的增殖

目的 观察软脂酸对体外培养的人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖的影响.方法 采用密度梯度离心法分离培养人外周血单个核细胞,经FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)双染色鉴定为正在分化的EPCs,并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志CD34、CD133和VEGFR2.分别以不同浓度(0、50、100、200、400、800 μmol/L)软脂酸溶液作用48 h,以及400μmol/L软脂酸溶液作用不同时间(0、12、24、36、48和60 h)后,CCK-8法观察EPCs增殖的情况.结果 与对照组比较,400 μmol/L组及800 μmol/L软脂酸组均抑制了EPCs的增殖功能(P<0.05),在400μmol/L时最为显著;且400μmol/L软脂酸对EPCs增殖抑制作用随时问延长逐渐增强.48 h达到高峰(增殖抑制率为58.59%(P<0.05).结论 高浓度软脂酸体外能显著抑制外周血内皮祖细胞的增殖.     

大鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的: 探讨内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)分离培养鉴定方法及其生物学特性。方法： 采用梯密度离心法结合差速贴壁法分离获取大鼠骨髓单核细胞,培养于EGM 2 MV SingleQuots内皮细胞培养液中,分别取48 h内贴壁细胞(早期EPCs)和48 h后贴壁细胞(晚期EPCs),在倒置显微镜下观察细胞形态,应用流式细胞术鉴定EPCs表面抗原标志CD34,CD133和血管内皮生长因子受体 2（VEGFR 2）,激光共聚焦检测EPCs吞噬功能,透射电镜观察EPCs内部超微结构。结果： 单核细胞接种后呈小圆形,早期EPCs呈长梭形,晚期以纺锤形为主,培养7 d后有明显干细胞集落;增殖至第6代以后,形态开始逐渐接近于内皮细胞,并出现管腔样结构。内皮祖细胞表面标志CD34,CD133和VEGFR 2均呈阳性表达,能吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白并结合FITC标记的凝集素 1。透射电镜可观察到内皮细胞特征性细胞器Weible Palade小体。结论： 梯密度离心法结合差速贴壁法能够成功地从骨髓中分离、纯化、培养出内皮祖细胞,其增殖能力强,数量充足,生物学特性稳定。     

老年性耳聋患者外周血EPCs数量及增殖变化研究

目的探讨老年性耳聋患者的外周血中内皮祖细胞(EPCs)数量变化情况及增殖集落变化情况。方法测定老年性耳聋患者和听力正常健康老年人的外周血中内皮祖细胞数量及培养7 d后增殖集落数量。结果老年性耳聋组外周血中内皮祖细胞计数为(35.1±3.31)个/20万单个核细胞,听力正常健康老年人为(86.4±9.32)个/20万单个核细胞,EPCs增殖集落计数分别为(1.40±0.50)和(3.50±1.46)个/20万单个核细胞,两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论老年性耳聋患者内皮祖细胞数量及增殖集落数量较听力正常健康老年人降低,表明机体修复能力不能满足要求而导致血管损伤,从而引起耳聋等临床症状,人体内皮祖细胞改变对于研究老年性耳聋的治疗和研究均具有极大的促进作用。     

Changes in Number and Biological Function of Endothelial Progenitor Cells in Hypertension Disorder Complicating Pregnancy

To examine the changes in number and function of endothelial progenitor cells （EPCs） from peripheral blood （PB） in hypertension disorder complicating pregnancy （HDCP）, 20 women with HDCP and 20 normal pregnant women at the third trimester were studied. Mononuclear cells （MNCs） from PB were isolated by Ficoll density gradient centrifugation. EPCs were identified by positive expression of both CD34 and CD133 under fluorescence microscope and positive expression of factor Ⅷ as shown by immunocytochemistry. The number of EPCs was flow-cytometrically determined. Proliferation and migration of EPCs were measured by MTT assay and modified Boyden chamber assay, respectively. The adhesion activity of EPCs was detected by counting the number of the adherent cells. The results showed that, compared with normal pregnant women, the number of EPCs was significantly reduced in HDCP （4.29%±1.21% vs 15.32%±2.00%, P〈0.01）, the functional activity of EPCs in HDCP, such as proliferation （13.45%±1.68% vs 18.45%±1.67%）, migration （37.25±7.28 cells/field vs 67.10±9.55 cells/field） and adhesion activity （20.65±5.19 cells/field vs 34.40±6.72 cells/filed） was impaired （P〈0.01）. It is concluded that the number and function of EPCs are significantly decreased in HDCP.     

急性冠脉综合征患者的CD133~＋循环祖细胞水平研究

目的：研究急性冠脉综合征患者的CD133＋循环祖细胞水平的变化。方法：采用流式细胞仪测定对照组和患者的外周血白细胞膜上CD133＋的表达率。结果：急性心肌梗死组CD133＋表达的EPCs水平为（0.09217±0.01428）%。不稳定性心绞痛组CD133＋表达的EPCs水平（0.04507±0.02474）%。对照组为（0.03739±0.02127）%。结论：急性冠脉综合征患者的CD133＋循环祖细胞水平较对照组显著增高。     

Endothelial progenitor cells with Alzheimer’s disease

Background  Endothelial dysfunction is thought to be critical events in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Endothelial progenitor cells (EPCs) have provided insight into maintaining and repairing endothelial function. To study the relation between EPCs and AD, we explored the number of circulating EPCs in patients with AD.

Methods  A total of 104 patients were recruited from both the outpatients and inpatients of the geriatric neurology department at General Hospital, Tianjin Medical University. Consecutive patients with newly diagnosed AD (n=30), patients with vascular dementia (VaD, n=34), and healthy elderly control subjects with normal cognition (n=40) were enrolled after matching for age, gender, body mass index, medical history, current medication and Mini Mental State Examination. Middle cerebral artery flow velocity was examined with transcranial Doppler. Endothelial function was evaluated according to the level of EPCs, and peripheral blood EPCs was counted by flow cytometry.

Results  There were no significant statistical differences of clinical data in AD, VaD and control groups (P >0.05). The patients with AD showed decreased CD34-positive (CD34⁺) or CD133-positive (CD133⁺) levels compared to the control subjects, but there were no significant statistical differences in patients with AD. The patients with AD had significantly lower CD34⁺CD133⁺ EPCs (CD34 and CD133 double positive endothelial progenitor cells) than the control subjects (P <0.05). In the patients with AD, a lower CD34⁺CD133⁺ EPCs count was independently associated with a lower Mini-Mental State Examination score (r=0.514,P=0.004). Patients with VaD also showed a significant decrease in CD34⁺CD133⁺ EPCs levels, but this was not evidently associated with the Mini-Mental State Examination score. The changes of middle cerebral artery flow velocity were similar between AD and VaD. Middle cerebral artery flow velocity was decreased in the AD and VaD groups and significantly lower than the normal control group (P <0.01). There was no significant difference of the blood flow velocity between the AD and VaD patients (P >0.05).

Conclusions  The results provided evidence that patients with AD have reduced circulating EPCs. Endothelial function is impaired in patients with AD and vascular factors have a role in the pathogenesis of AD. CD34⁺CD133⁺ EPCs may be a novel biomarker of AD dementia.

     

Proliferation, migration and apoptosis activities of endothelial progenitor cells in acute coronary syndrome

Background There are numerous articles on the endothelial progenitor cells （EPCs） in different disease conditions. However, the functional properties of EPCs in acute coronary syndrome （ACS） are still uncertain. Here we aimed to study the number and functions of EPCs in ACS patients. Methods Patients were enrolled with admitted ACS （n=25） and another 25 gender-, age-, atherosclerotic risk factors-matched stable coronary artery disease （CAD） controls. EPCs were defined as CD34＋/CD133＋/VEGFR-2＋ and quantified by flow cytometry. Moreover, functional properties of EPCs including colony-forming unit （CFU）, proliferation, migration as well as apoptosis were evaluated and compared between the two groups. Plasma matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） was detected in all patients as well. Results The two groups had similar medication and clinical characteristics on admission. The EPCs in ACS patients were more than 2.6 times that in stable CAD subjects （15.6±2.7 vs. 6.0±0.8 /100 000 events, P 〈0.01）. CFU was not statistically different between the two groups （10.8±2.9 vs. 8.2±1.8, number/well, P 〉0.05）. Furthermore, EPCs isolated from ACS patients were significantly impaired in their proliferation （0.498±0.035 vs. 0.895±0.067, OD value, P〈0.01） and migration capacity （20.5±3.4 vs. 30.7±4.3, number/well, P 〈0.01） compared with controls. Moreover, the apoptosis cell in cultured EPCs was drastically increased in ACS group （（18.3±2.. 1 ）% vs. （7.8±0.4）%, P 〈0.01）. Conclusions Patients with ACS exhibited apparently increased circulating EPCs as well as cultured apoptosis percentage together with a remarkable impairment of proliferation and migration activities compared with stable CAD subjects.     

突发性耳聋患者外周血内皮祖细胞的变化

目的:探讨突发性耳聋患者外周血中内皮祖细胞(EPCs)数量变化及增殖集落变化情况。方法:测定突发性耳聋患者和听力正常健康人外周血中EPCs数量及培养7 d后增殖集落数量。结果:突发性耳聋组外周血中EPCs计数为(36.5±2.58)个/20万单个核细胞,听力正常健康人EPCs计数为(85.3±6.55)个/20万单个核细胞,EPCs增殖集落计数分别为(2.01±0.31)个和(3.80±1.05)个,两者比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:突发性耳聋患者由于EPCs数量及增殖集落数量下降,在机体修复过程中不能满足要求而引起耳聋等临床症状。     

不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度与外周血内皮祖细胞及高敏c反应蛋白的关系

目的探讨不稳定性心绞痛患者冠状动脉病变程度与外周血内皮祖细胞（EPCs）及高敏C反应蛋白（hs—CRP）的相关性。方法选取2010年12月～2013年6月在南方医科大学附属东莞市石龙人民医院心血管内科住院治疗的不稳定性心绞痛患者55例为实验组,选择同期无冠状动脉狭窄患者30例为对照组。使用流式细胞仪测定外周血单个核细胞中CD34及CD133双阳性细胞EPCs的数量,并且检测每位患者hs—CRP水平。于住院后次日行冠状动脉造影,使用Gensini评分系统定量分析冠状动脉的病变程度。统计冠状动脉病变程度与外周血EPCs数量及hs—CRP的相关性。结果实验组与对照组EPCs分别为（30．95±5．50）、（58．66±4．45）个／10万．而实验组与对照组hs—CRP分别为（40．25±9．80）、（3．45±1．68）μmol／L,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;实验组内EPCs数量随着冠状动脉狭窄程度Gensini评分的增加亦随之升高（P〈0．05）。冠状动脉病变狭窄的程度与EPCs数量呈正相关（r=0．593,P〈0．01）,而hs—CRP同冠状动脉病变程度无明显相关性（r=0．114,P〉0．05）。结论不稳定性心绞痛患者外周血EPCs数量减少,而hs—CRP则明显增加,但随冠状动脉病变程度加重,外周血EPCs数量增多,hs—CRP则没有明显改变,EPCs可以反映冠状动脉病变狭窄程度．而hs—CRP反映冠状动脉不稳定斑块的活动程度。     

人脐血内皮祖细胞的体外培养

目的从人脐带血中分离内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,建立人脐血内皮祖细胞体外培养的方法,为实现内皮祖细胞的移植及实验研究提供足量的细胞来源。方法采用密度梯度离心法分离人脐带血内皮祖细胞,在EGM-2培养基中培养,采用流式细胞仪、免疫组化和免疫荧光鉴定EPCs。结果脐带血单个核细胞在经EGM-2培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;1周后既分化成EPCs,细胞免疫荧光CD133染色率在培养第7天为（67.2±2.12）%,免疫组化CD34染色率为（89.67±2.05）%,流式细胞仪鉴定该种细胞CD133与KDR的双阳性率达87.8%。可确定该细胞为EPSc。结论采用本培养方法可获得良好的内皮祖细胞用于实验研究。