杜氏利什曼原虫蛋白磷酸酶-2C的基因克隆化与序列分析

目的　克隆杜氏利什曼原虫 (Leishmaniadonovani,Ld) 1S株蛋白磷酸酶 2C(PP2C)的编码基因 ,为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法　体外培养杜氏利什曼原虫 1S株无鞭毛体 ,常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫 (Leishmaniachagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照 ,设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果　以杜氏利什曼原虫的基因组为模板 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明 ,杜氏利什曼原虫 1S株PP2C基因序列长度为 1317bp ,开放读码框架由 12 2 1bp组成 ,编码产物为 40 6个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫 1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为 95 % (387/ 40 6 )。结论　本研究克隆了杜氏利什曼原虫的PP2C基因 ,为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼原虫的基因疫苗研究奠定了基础     

杜氏利什曼原虫蛋白鳞酸酶—2C的基因克隆化与序列分析

目的 克隆杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani,Ld)1S株蛋白磷酸酶2C（PP2C）的编码基因，为应用这种编码T细胞抗原的基因进行基因疫苗研究奠定基础。方法 体外培养杜氏利什曼原虫1S株无鞭毛体，常规方法从虫体提取制备基因组DNA。以夏科氏利什曼原虫（Leishmania chagasi,Lc)的PP2C基因序列为参照，设计并合成利什曼原虫PP2C基因序列特异性的引物。结果 以杜氏利什曼原虫的基因组为模板，利用多聚酶链反应（PCR）技术，扩增获得了杜氏利什曼原虫PP2C的全长编码基因。基因序列测定结果表明，杜氏利什曼原虫1S株PP2C基因序列长度为1317bp，开放读码框架由1221bp组成，编码产物为406个氨基酸残基。获得的杜氏利什曼原虫1S株的PP2C基因与来源于夏科氏利什曼原虫的PP2C氨基酸残基序列的同源性为95％（387／406）。结论 本研究克隆了杜氏利什曼虫的PP2C基因，为应用诱导T细胞免疫应答抗原的编码基因进行杜氏利什曼虫的基因疫苗研究奠定了基础。     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋囟的基因克隆化与序列分析

目的　克隆墨西哥利什曼原虫(L.mer)WR972株的无鞭毛体蛋白(amastin)的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法　根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫VR972株的基因组DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增。将扩增的DNA片段克隆到pCR2.1T载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较。结果　从体外培养的墨西哥利什曼原虫WR972株提取基因组DNA,以无鞭毛体蛋白基因特异性引物进行PCR扩增获得550bp的DNA片段。克隆到pCR2.1T载体片段进行的序列测定结果　表明,获得了墨西哥利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因片段,与亚马逊利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因之间具有高度的同源性。结论　实现了墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化,为进一步研究其表达及作为疫苗研究的候选基因奠定了基础。     

利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆4株利什曼原虫表面无鞭毛体蛋白（amastin）的编码基因,并进行序列分析。方法 根据锥虫（T.cruzi)与利什曼原虫亲缘关系相近的原则,首先以锥虫无鞭毛体蛋白的基因为参考。对GenBank中的dbFST数据库检索,获得硕大利什曼原虫（L.major)一段309核苷酸片段,根据其序列合成探针,对硕大利什曼原虫基因组DNA文库筛选,首先获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因,再以硕大利什曼原虫无鞭 毛体蛋白编码 基因序列为依据,合成特异性引物,以多聚酶链反应（PCR）扩增获得亚马逊利会曼原虫（L.ama.)、巴西利什曼原虫（L.bra.)和墨西哥利什曼原虫（L.mex.)的无鞭毛体蛋白基因。结果 克隆了4株利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码的基因。均为国际上首次克隆化基因,已被美国GenBank收录。结论 实现了4株利什曼原虫无鞭毛体 蛋白编码基因的克隆化。     

亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化与序列分析

目的：克隆亚马逊利什曼原虫（L.ama)无鞭毛蛋白（amastin)的编码基因,并对其同源基因序列进行分析,方法：根据我们首次克隆的硕大利什曼原虫（L.major)无鞭毛体蛋白的编码基因,设计并合成核苷酸序列特异性引物,以亚马逊利什曼原虫基因组DNA为模板,以多聚酶链反应PCR技术扩增无鞭毛体的编码基因DNA片段,并进行核苷酸 列测定以及核苷酸序列的同源性分析。结果：克隆了亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因,含有单一开放读框,长度为552bp,编码的无鞭毛体蛋白由183个氨基酸残基（aa)组成,亚马逊利什曼原虫与硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因之间高度同源,在核苷酸与氨基酸残基序列水平上的同源性分别为96％和94％,结论：首次实现亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的克隆化。     

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的　测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。　方法　应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。　结果　用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。　结论　获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。     

硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆与序列分析

[目的 ]克隆硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因序列。 [方法 ]应用核苷酸序列数据库 (GenBank)和表达序列末端片段数据库 (dbEST)的计算机检索与DNA文库的杂交筛选方法。 [结果 ]从dbEST数据库中获得一段 30 9nt的来源于硕大利什曼原虫的基因片段 ,据此设计探针 ,筛选硕大利什曼原虫的DNA文库 ,获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因。其开放读码框架由 5 5 2个核苷酸组成 ,编码产物由183个氨基酸残基组成。序列分析表明 ,硕大利什曼原虫与锥虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性为 2 3 5 %。 [结论 ]克隆的基因系硕大利什曼原虫表面蛋白编码基因 ,即无鞭毛体蛋白的编码基因。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因。方法PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L．d．SC10H2与四川南坪犬株L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因,将该基因导入pcDNA3．1( ),构建真核表达重组质牲,转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达;RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达,结果2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因。同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting,在相对分子质量(Mr)约20000处检测到阳性杂交信号,表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。结论获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L．d．SC10H2和L．d．SC7的无鞭毛体蛋白基因序列,并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

我国山丘疫区杜氏利什曼原虫LACK保护性抗原基因克隆和序列分析

利什曼原虫的LACK抗原是利什曼原虫的蛋白激酶C受体的同源物 ,是新发现的一种抗原蛋白。本实验用分子克隆的方法获得我国山丘疫区杜氏利什曼原虫编码LACK保护性抗原的基因片段 ,测序并对其序列分析比较。我国山丘疫区杜氏利什曼原虫 (L dSC10 )LACK抗原基因片段的大小为 94 2bp ,与GenBank中LACK的核苷酸序列一致性在 94 %以上 ,呈高度同源性 ;推导的氨基酸序列与GenBank中LACK的氨基酸序列一致性达 95 %以上 ,具有高度保守性 ;该蛋白质属于WD蛋白家族 ,有重要的生物学意义。     

由表达产物克隆识别的一种杜氏利什曼抗原用于内脏利什曼病的特异性血清诊断

表达产物的克隆(单抗或多抗)已广泛用于分离与感染因子的抗原相应的 cDNA 和基因组 DNA 克隆。作者采用了这些技术研究杜氏利什曼(L.d.)病的特异诊断试剂,以进一步搞清原虫的基因组和基因表达,最终为合成疫苗提     

墨西哥利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析

目的 克隆墨西哥利什曼原虫（Ｌ．ｍｅｘ）ＷＲ９７２株的无鞭毛体蛋白（ａｍａｓｔｉｎ）的编码基因,并对其同源核苷酸序列进行分析。方法 根据已克隆的亚马逊利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因序列,设计并合成成无鞭毛体蛋白基因特异性引物,以墨西哥利什曼原虫ＷＲ９７２株的基因组ＤＮＡ作为模板,进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增。将扩增的ＤＮＡ片段克隆到ｐＣＲ２．１Ｔ载体中,进行测序,并对同源的核苷酸序列分析、比较     

Acquisition and analysis of lipophosphonoglycan 1 gene and the noncoding region of Leishmania donovani isolates from hilly foci of China

A fragment about 2.2 kb located at upstream of lipophosphonoglycan 1 (LPG1) gene of Leishmania donovani isolate from hilly foci of China was obtained by PCR. The nucleotide sequence of the fragment was determined by sequencing. The sequence of the LPG1 gene and its downstream fragment (about 2 kb) was determined by using genome walking method. The above two fragment splicing result showed that the nucleotide sequence of the LPG1 gene with the noncoding region was 4 121 bp (GenBank accession number: HMO27899). The BLAST results showed that the LPG1 gene of L. donovani isolate from hilly foci of China had 72%-78% nucleotide identity compared to that of other Leishmania spp. in GenBank.     

杜氏利什曼原虫动基体DNA种林特异片段的克隆

作者在质粒pUC18中克隆了限制性内切酶AIuI消化的Leishmania donovani四川人分离株kDNA片段,筛选后获得能区别杜氏利什曼原虫山丘疫区分离株和平原疫区分离株的的克隆pLK1-10和对杜氏利什曼原虫四川人分离株特异的克隆pLK1-14,对杜氏利什曼原虫种特异的克隆PLK1-1、pLK1-2等。这些克隆将是鉴定杜氏利什曼原虫,区别鉴定山丘及平原疫区黑热病病原体较好的探针。     

Evolution of the genus Leishmania as revealed by comparisons of nuclear DNA restriction fragment patterns.

Restriction endonuclease DNA fragment patterns have been used to examine the relationships among 28 isolates of Leishmania as well as Crithidia, Endotrypanum, and Trypanosoma cruzi. Fragments of nuclear DNA were generated with six restriction enzymes, and blots were hybridized with probes from three loci. Among the major lineages the fragment patterns are essentially completely different, while within the major lineages various degrees of divergence are found. Molecular evolutionary trees were constructed using the method of Nei and Li to estimate the percent nucleotide sequence divergence among strains from the fraction of fragments shared. Defined groups, such as species or subspecies within the major lineages, are also grouped by nuclear DNA comparisons. Within the donovani complex, we find Leishmania donovani chagasi and Leishmania donovani infantum to be as similar as strains within Leishmania donovani donovani, consistent with the proposal by other workers that New World visceral leishmaniasis originated quite recently.     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3' 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3 端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。