神经干细胞的增殖分化与神经变性疾病治疗

神经干细胞可作为细胞移植替代材料和基因转移载体,治疗神经变性疾病.除细胞因子对神经干细胞的增殖和分化调控外,中枢神经系统区域特异性和神经递质合成相关酶对神经干细胞的定向分化有重要影响.神经生长因子和基因工程化干细胞能改善神经元的退变,治疗神经变性疾病.     

神经生长因子诱导神经干细胞分化的作用机制探讨

目的探讨神经生长因子(NGF)对体外培养的小鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元的作用及可能机制。方法以无血清培养法从孕13～14 d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs,传至3代后,进行NGF处理,并对培养的细胞进行MAP-2免疫细胞化学染色,荧光显微镜下对MAP-2阳性细胞进行计数。同时运用蛋白免疫印迹法(Western blot)考察NGF对TrkA、Akt、Erk磷酸化水平的影响;在研究NGF作用的信号转导通路时,预先给予各种信号通路抑制剂处理,再进行NGF干预,通过MAP-2染色及Western blot考察NGF促进神经干细胞分化为神经元的信号通路。结果 NGF可以显著促使NSCs分化为神经元并可以促进TrkA、Akt和Erk的磷酸化,呈现剂量和时间依赖性;各种通路抑制剂结果显示PI3K/Akt抑制剂可以阻断NGF对Akt的磷酸化作用,同时阻断了NGF对NSCs的促分化作用,MAPK抑制剂处理可以阻断NGF对Erk的磷酸化作用,但未见明显阻断NGF的促分化作用。结论 NGF可以促进NSCs分化为神经元,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

神经干细胞定向诱导分化为神经元的研究进展

近年来神经干细胞的分离、培养成功为神经发育研究和中枢神经系统疾病的治疗提供了一条新的思路。从神经板的出现、神经管的形成到脑泡的发育都经历了从神经干细胞到祖细胞再到成熟神经细胞的发育过程,通过研究神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化将为阐明神经系统发育的机制     

神经干细胞的诱导分化

受传统的影响,以前人们一般不认为中枢神经系统有干细胞,这是因为人们长期形成的中枢神经系统不可再生的观念。1992年,Reynolds和Weiss从成年小鼠纹状体分离了能在体外不断分裂增殖,具有多种分化潜能的细胞群,并明确地提出了神经干细胞的概念。目前已经证实,这种具有自我更新、自我维持、多潜能的神经干细胞确实存在于发育中的神经系统,并     

神经干细胞向神经元定向诱导分化方法的研究进展

神经干细胞(NSCs)是一类具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞,它来源于神经组织,在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。NSCs体外诱导分化的成体细胞可以用于中枢神经损伤疾病及退行性神经系统疾病的治疗。因此,找到一系列体外诱导NSCs定向分化的模式,诱导其分化为特定的神经细胞,达到神经修复和细胞治疗的目的乃当今神经科学界的研究热点之一。该文主要阐述NSCs向神经元诱导分化方法的研究进展。     

神经干细胞分化的研究进展

自1992年Reynolds等[1]从成年鼠脑纹状体中首次分离出能在体外持续增殖且具有向神经元及星形胶质细胞分化潜能的神经干细胞(neuralstemcell,NSCs)后,人们又从其他成年哺乳动物的中枢神经系统中成功分离得到NSCs。目前NSCs的分离、体外培养已经取得了可喜的进展,但无论是体外还是体内研究的结果,NSCs分化为神经元的比例都明显低于胶质细胞,致使难以达到理想的替代因损伤和疾病等原因造成的神经元缺失的目的。究其主要原因是人们对NSCs分化的机制还不十分清楚,因此不能对各类神经系统疾病的治疗做到有的放矢。NSCs向神经元分化还是向…     

微环境影响神经干细胞分化的研究进展

神经干细胞是神经系统中能够增殖分化成神经元和胶质细胞的特定原始神经细胞,它具有高度的自我更新能力、多潜能分化、迁移功能及良好的组织融合性等特性。目前已在哺乳动物的中枢神经系统多个部位发现并分离出神经干细胞。同时,神经干细胞的分化又受到其所处微环境的影响,因此,对于微环境的研究将对临床治疗神经系统疾病有重要意义。     

神经干细胞接种密度对其增生和分化的影响

为探讨神经干细胞不同接种密度对其增生和分化的影响,取10～12周龄胎儿的大脑皮质用胰酶消化获得单细胞,分别以1×10~2/mL、1×10~4/mL和1×10~6/mL的细胞密度接种,用无血清培养基DMEM/F12、上皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)培养;用MTT法测OD值并观察神经干细胞的存活和增生情况。从培养基中剔除生长因子,继尔以10％胎牛血清诱导分化,用免疫细胞化学(ICC)方法,研究不同细胞密度培养后神经干细胞的分化能力。结果:在1×10~6/mL细胞密度下培养,神经干细胞增生活跃,形成神经球,Nestin表达阳性,10％胎牛血清诱导后神经干细胞可分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞;低细胞密度(低于1×10~4/mL)培养不利于神经干细胞的存活和增生,血清诱导未见分化的细胞。提示:适宜的神经干细胞接种密度有利于其增生和分化。     

维甲酸对MESPU35胚胎干细胞系神经定向分化的影响

目的 了解维甲酸(Retinoic acid,RA)对MESPU35胚胎干细胞系诱导分化的影响。方法小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养MESPU35细胞系，4—/4 法诱导其神经定向分化。结果 相差显微镜观察RA诱导MESPU35细胞系出现神经样细胞拟胚体百分率随分化时相点和RA浓度升高而升高，免疫细胞化学观察分化的NF200和GFAP阳性细胞随分化时相点和RA浓度升高而增加，NF200阳性细胞由无突起变为多极细胞，GFAP阳性细胞突起由短变长，最后联结成网状。流式细胞仪检测分化的GFAP、NF200阳性细胞比例变化与免疫细胞化学结果相符。结论 RA诱导MESPU35细胞系神经定向分化的调节以浓度和时间依赖模式进行，提示其神经定向分化产生的高比例神经细胞可以用于移植治疗。     

昆明小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESC)分化为神经干细胞(NSC)的方法.方法 自孕3.5d的昆明小鼠获得附植前的早期胚胎,在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养获得ESC克隆. 进行Oct-4免疫细胞化学鉴定、碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定及体外分化能力的鉴定.在无人重组白血病抑制因子(hLIF)存在的条件下将ESC悬浮培养4d,形成拟胚体(EB),再经全反式维甲酸(RA)诱导4d,在神经干细胞筛选培养基中扩增,采用免疫细胞化学方法检测NSC特异性标志物Nestin的表达.结果 所分离得到的ESC的AKP染色阳性,Oct-4表达阳性,符合ESC的一般特性.ESC经RA初步诱导,NSC选择性培养基筛选培养7d后,形成大量神经球样结构,所形成的神经球样结构呈Nestin抗原阳性.结论 体外分离得到的昆明小鼠ESC经RA诱导后,再经选择性培养基筛选培养可获得大量NSC,有望为神经系统损伤及神经变性疾病提供新的治疗途径.     

胰岛素样生长因子-1诱导新生小鼠海马源性神经干细胞增殖分化的研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对新生小鼠海马源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化的影响。方法通过取新生C57BL／6J小鼠海马组织,机械分离,体外培养NSCs,特异性标志蛋白Nestin免疫荧光鉴定。在细胞培养液中加入100μg／L的IGF-1记为IGF-1组,同时设立正常细胞对照组。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,GFAP、133Tubulin细胞免疫化学检测细胞分化情况。结果体外成功培养NSCs,特异性蛋白Nes-tin具有表达。IGF-1组NSCs较对照组增殖显著,且IGF-1组细胞具有显著的迁移和分化能力。细胞免疫荧光鉴定,IGF-1可促进细胞分化为星形胶质细胞和神经元（P〈0．05）。结论IGF-1能够促进体外培养的新生小鼠海马源性NSCs增殖,并诱导NSCs向星形胶质细胞和神经元分化。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响

目的：分析自体浓缩生长因子(concentrated growth factor,CGF)对比格犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外增殖及成骨向分化的影响。方法：取健康比格犬脂肪组织进行分离、培养ADSCs并鉴定其多向分化潜能,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖。将ADSCs分为CGF组及对照组,对两组细胞进行成骨诱导后分别检测其碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR法检测I型胶原(Col-I),Runx2等成骨相关基因表达。结果：CGF组细胞增殖能力明显高于对照组(P<0.05);经成骨诱导的ADSCs在CGF作用下ALP活性明显增强(P<0.05),Col-I,Runx2等成骨相关基因的表达亦明显高于对照组(P<0.05)。 结论：CGF能够促进ADSCs体外增殖和成骨向分化。     

BDNF和IGF-1对皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)对大鼠皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响.方法:采用细胞培养技术、免疫细胞化学方法观察BDNF和IGF-1对皮层神经干细胞向神经元定向分化的影响.结果:皮层神经干细胞在去除丝裂原后开始进行分化,至7 d可分化为成熟神经元,神经元特异烯醇化酶(NSE)明显阳性.BDNF、IGF-1组与对照组相比,定向分化为神经元的比率增加21.7%(P＜0.01).结论:BDNF,IGF-1对皮层神经干细胞向神经元的定向分化具有促进作用.     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

脑络欣通药物血清对大鼠胚胎神经干细胞生长分化的影响

目的研究不同浓度脑络欣通药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化的影响。方法采用细胞培养、血清药理学、免疫组化等方法,观察不同浓度脑络欣通药物血清对大鼠NSC生长分化的影响。结果不同浓度脑络欣通药物血清均可在一定程度上促进大鼠NSC生长,以10%的药物血清作用最明显。不同浓度药物血清均可诱导绝大多数NSC分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。10%药物血清诱导大鼠NSC向神经元方向分化的比例最高,且使分化的神经元在细胞形态学上更为接近发育成熟。结论脑络欣通有促进NSC生长分化的作用。不同浓度脑络欣通药物血清对离体培养大鼠NSC的生长和分化有不同影响,10%药物血清是最佳作用浓度。     

Cloning of the Eukaryotic Expression Vector with Nerve Growth Factor in Rats and Its Effects on Proliferation and Differentiation of Mesencephal Neural Stem Cells of Fetal Rats

The eukaryotic expression vector containing full-length cDNA sequence of rate nerve growth factor （NGF） β subunit was constructed and its effects on proliferation and differentiation of neural stem cells were observed. By using PCR, full-length cDNA sequence of NGF β subunit in rats was cloned and ligated into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1-NGF. The recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF was transfected into the mesencephal neural stem cells of embryonic rats by Lipofectamin and transiently expressed. MTT method was used to determine the effects of NGF on proliferation of neural stem cells, and under phase-contrast microscopy, the effects of NGF on growth of nervous processes following differentiation of neural stem cells were observed. Sequence analysis indicated that the cloned full-length cDNA sequence of rat NGF β was identical to that of published sequence encoding NGF in gene GeneBank. The transfection of recombinant plasmid pEGFP-N1-NGF into mesencephal neural stem cells of embryonic rats could obviously promote proliferation of neural stem cells and faciliate the growth of neural stem cells-derived nerve cells. It was suggested that neural stem cells could be used as a vehicle of gene transfer, and the expression of NGF β subunit in the neural stem cells could promote the growth of nerve cells derived from neural stem cells.     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法,探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞,并用EGF和血清诱导其分化,采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成,但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞,细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖,并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

黄芪皂甙诱导小鼠神经干细胞向神经元分化

目的：观察黄芪皂甙对体外培养的小鼠神经干细胞（NSCs）向神经元分化的影响.方法：采用机械分离、无血清传代培养法从胚胎（E14.5）小鼠室管膜前下区获得NSCs,观察不同浓度（20,40,60mg/L）黄芪皂甙在干预后不同时段（3,7d）的分化情况,通过免疫荧光检测神经元（β-Tubulin）,星形胶质细胞（GFAP）及少突胶质细胞（CC-1）的比例,并采用银杏内酯B（40mg/L）作为阳性对照,正常组为阴性对照,观察黄芪皂甙对小鼠NSCs分化的影响.结果：加入黄芪皂甙培养3,7d后,黄芪皂甙40mg/L及60mg/L组、银杏内酯B组分化为β-Tubulin（＋）神经元比例均显著高于正常对照组,黄芪皂甙两种浓度组间无统计学差异;银杏内酯B组分化为GFAP（＋）星形胶质细胞比例显著高于正常对照组,而黄芪皂甙对星形胶质细胞的分化比例无明显影响.结论：黄芪皂甙能促进NSCs定向分化为神经元,而银杏内酯B促进NSCs向神经元和星形胶质细胞分化.