构建T载体快速克隆丙型肝炎病毒5′端非编码区扩增产物

为探讨自行构建Ｔ载体的简便方法，克隆丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５′端非编码区（５′ＮＣＲ）扩增产物，并为制备ＨＣＶ检测探针作准备。以ＳｍａⅠ消化质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋），酶切产物纯化后在仅含有脱氧腺苷酸的聚合酶链反应（ＰＣＲ）缓冲液中７０℃作用２小时，构建成Ｔ载体。根据ＰＣＲ扩增产物３′端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷酸原理，将扩增产物直接克隆入Ｔ载体。同时以ＳｍａⅠ消化的质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）与ＰＣＲ产物平端连接作为对照。限制性酶切长度多肽性分析，ＰＣＲ及ＤＮＡ序列测定等均证实克隆构建成功。ＡＴ克隆的连接效率约为平端连接的４２倍。以上结果表明，构建Ｔ载体经济、简便。ＡＴ克隆快速、有效。所构建的克隆可用作ＰＣＲ实验对照模板或制备探针。     

丙型肝炎病毒5'端非编码区的结构与功能研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为单股正链有包膜RNA病毒,为黄病毒科丙型肝炎病毒属成员,基因组长约9.6kb,5'端和3'端分别有一个非编码N(NCR),中间的编码区含有一个单一的长开放读码框架(ORF),转译出一条约3011个氨基酸残基的聚蛋白前体.该聚蛋白前体被宿主细胞信号肽酶和病毒蛋白酶水解加工成为至少十种成熟的功能蛋白,其排列顺序为:NH2-核心蛋白C-包膜蛋白E1-E2/NS1-非结构蛋白P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH[1].HCV ORF的翻译是由其5'NCR指导的,该序列可作为一个内部核糖体起始位点(internal ribosome entry site,IRES),被小核糖体亚基(40S)和真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3,eIF3)特异识别,允许ORF起始密码子近端与核糖体直接结合,使得病毒聚蛋白的翻译以非帽子(7-甲基鸟苷酸)依赖机制进行.由于宿主细胞mRNAs主要以帽子依赖机制起始翻译,因此IRES的功能特点使得5'NCR成为抗病毒作用研究和研制药物评价系统的理想靶位点,而5'NCR的结构及其IRES元件起始聚蛋白合成的机制也成为近年来的研究热点.本文将就这些方面的研究进展作一综述.     

丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅱ在其翻译启动活性中的作用

目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(NCR)的结构域Ⅱ序列(nt44-118)在其翻译启动活性中的作用.方法 用PCR扩增技术获得缺失5'端118 nt的截短型HCV 5'NCR片段,并以之替换萤火虫荧光素酶(Flue)真核表达质粒pCMVNCRluc中的完整HCV 5'NCR,构建截短型HCV 5'NCR调控Fluc基因表达的真核表达质粒pCN1-d3.将pCN1-d3、pCMVNCRluc和pCMVNCRhc缺失HCV5'NCR nt1-43后的重组质粒pCN1-d2以脂质体方法 分别转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc相对表达活性,RT-PCR检测Flue mRNA的相对表达水平.结果 酶切和测序结果 表明,重组质粒构建成功.各质粒转染细胞后Fluc mRNA的相对表达水平差异无统计学意义(P0.05);pCN1-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无统计学意义(P0.05),pCN1-d3的Fluc活性显著低于pCMVNCRIuc(P<0.01).结论 HCV 5'NCR的结构域Ⅱ(nt44-118)含有其发挥翻译启动功能的重要序列.     

真核生物mRNA3′非翻译区的调控功能

真核生物mRNA 3′非翻译区可以调节转录本的稳定性、亚细胞定位和翻译水平 ,决定某一特定mRNA的命运 ,是许多基因表达所必需的一个调节区。 3′非翻译区介导的功能的修饰可影响一个或多个基因的表达 ,从而导致疾病的发生。对相关mRNA 3′非翻译区的调节序列和与这些序列特异结合的蛋白质等具体信息的认识 ,将成为药物设计的新的分子靶。     

真核生物mRNA 3′非翻译区的调控功能

真核生物mRNA 3'非翻译区可以调节转录本的稳定性、亚细胞定位和翻译水平,决定某一特定mRNA的命运,是许多基因表达所必需的一个调节区.3'非翻译区介导的功能的修饰可影响一个或多个基因的表达,从而导致疾病的发生.对相关mRNA 3'非翻译区的调节序列和与这些序列特异结合的蛋白质等具体信息的认识,将成为药物设计的新的分子靶.     

小鼠p35nck5a基因5′侧翼非编码区基因表达调控作用研究

目的　探讨决定Alzheimer's病(AD)的相关基因p35nck5a神经特异性表达的分子机理。方法 通过构建荧光素酶表达载体,利用原代培养神经细胞进行瞬时表达实验寻找指导神经特异性表达的顺式作用元件,并通过引物延伸实验寻找转录起始位点,通过染色质DNase 1高敏位点(DNase 1 hypersensitive site, DHSS)实验确定与p35nck5a转录相关的DNase 1高敏位点。结果　瞬时表达实验结果显示在神经细胞和非神经细胞中,所构建的各载体的表达情况没有明显差异;在新生大鼠的脑组织和肝组织中存在染色质DNase 1高敏位点的差异,该位点大约位于脑基因组p35nck5a编码区上游-400 bp处。引物延伸实验结果显示主要的转录起始位点的位置与DNase1高敏位点的位置具有一致性,与瞬时表达实验结果也具有相关性。结论　以上结果提示在所克隆到的p35nck5a 5′侧翼序列中不存在决定该基因组织特异性表达的顺式作用元件,另外染色质水平上的某些调控机理可能对决定神经特异性表达具有重要意义。     

中国人丙型肝炎病毒基因组3′端非编码区的研究

目的分析中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３′端非编码区（３′ＮＣＲ）,以促进对ＨＣＶ基因组复制机制的研究。方法采用两种方法,从上海地区感染ＨＣＶ的病人血清中,扩增获得ＨＣＶ基因组３′端非编码区：一是用套式ＰＣＲ直接扩增,二是先分别获得ＨＣＶ３′ＮＣＲ的前半部分和后半部分,再将两片段进行融合ＰＣＲ。ＰＣＲ产物进行测序后作同源性分析。在此基础上,建立了针对３′端非编码区的ＲＴＰＣＲ方法,并与基于５′端非编码区的ＲＴＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ的特异性和灵敏度比较。结果序列分析表明,中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３′非编码区由４部分组成：高度变异区、Ｐｏｌｙ（Ｕ）区、Ｐｏｌｙ（Ｕ／Ｃ）区和９８碱基区。同源性分析显示,９８碱基区在不同分离株间高度保守并与国外报道株一致,而Ｐｏｌｙ（ＵＵＣ）区存在较大差异。３′端非编码区和５′非编码区ＲＴＰＣＲ检测血清ＨＣＶＲＮＡ有较高符合率（９５％）。结论ＨＣＶ基因组３′端非编码区的３′末端（９８碱基）,在不同分离株间的高度保守性提示,该区在ＨＣＶ基因复制中起重要作用。基于３′非编码区的ＲＴＰＣＲ方法,将有助于ＨＣＶ感染的诊断。     

PAX6基因5′端非编码区剪接突变能够引起先天性无虹膜症

目的对一先天性无虹膜症家系进行了致病基因PAX6的突变分析。方法PCR反应扩增PAX6基因的所有外显子,PCR产物进行SSCP（单链构象多态性）分析,通过患者与正常人带型的差异来确定突变发生的外显子,对有差异SSCP带型的PCR产物进行直接测序找到突变位点。PCR产物进一步亚克隆到pGEM-T载体,测序验证突变位点。结果发现基因突变为PAX6基因第2内含子和第3外显子之间的剪接识别位点＂AG＂中的碱基A的丢失（IVS2-2delA）。结沦PAX6基因5′端非编码区剪接突变能够引起先天性无虹膜症。     

HCV LNAzyme对病毒5'非编码区基因调控的特异性抑制作用

目的 探讨针对丙肝病毒5 '非编码区内源性核糖体进入位点的锁核酸核酶(LNAzyme)对病毒基因复制与表达的特异性抑制作用.方法 设计合成能切割HCV-5'-NCR-IRES位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme.实验设对照组和实验组.对照组包括空白对照组、脂质体对照组和无关LNAzyme对照组.实验组包括DNAzyme、硫代DNAzyme组和LNAzyme组.以阳离子脂质体介导转染hepG2.9706细胞,用荧光定量PCR和化学发光技术分别监测24、48和96 h细胞培养上清液中HCV RNA含量及荧光素酶基因表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞活性.结果 加入核酶后,LNAzyme对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达的抑制作用最强(P＜0.05),平均抑制率分别为48.02％和53.05％,且随用药时间延长,抑制率呈增高趋势,96 h后,平均抑制率分别为81.21％和84.25％.LNAzyme对细胞活性无影响.结论 LNAzyme能特异性抑制丙型肝炎病毒5 '非编码区的基因调控,且优于硫代修饰的DNAzyme.     

小鼠POMC基因5′端非编码区内的一个假想的AP-2结合部位

前阿黑皮素原基因(POMc)已被证明是研究神经多肽生物合成,合成后处理以及分泌的一个很有价值的模型。POMC生物合成的调节主要发生在转录水平,其它的神经多肽基因系统一般也是如此。然而,比较难以理解的是外来刺激最终导致POMC基因转录效率改变的传导途径。因为大多数     

庚型肝炎病毒5'端非编码区基因的扩增、鉴定、克隆及序列分析

庚型肝炎病毒５′端非编码区基因的扩增、鉴定、克隆及序列分析李刚姚集鲁陈青谭德汤文辉庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）是近半年来国外证实的一种非Ａ～Ｅ型肝炎病毒。参考国外发表的序列资料，我们在相对保守的５′端非编码区（ＮＣＲ）设计两对ＨＧＶ特异性引物。采用热变性法...     

汉滩病毒S片段基因cDNA 3′端非编码区对核蛋白在大肠杆菌中表达的影响

为了探讨汉滩病毒Ｓ片段ｃＤＮＡ３′端非编码区基因对核蛋白表达的影响，先后构建了两个核蛋白的表达质粒（ｐＢＶＳ２２和ｐＢＶＳＸ），其中ｐＢＶＳ２２不含非编码区基因，ｐＢＶＳＸ含有３′端非编码区基因。比较两者在大肠杆菌中表达核蛋白的水平后发现３′端非编码区对核蛋白的表达有明显的负调控作用，表达量下降近５０％。可能的原因是非编码区中含有非常丰富的ＡＴ碱基。该研究结果为进一步提高汉滩病毒核蛋白的表达量积累了经验，也为高效表达其它病毒结构蛋白提供了有益的资料。     

HSPA5基因3′非翻译区多态性与肝细胞癌预后的关系

目的调查70 kDa热休克蛋白5（HSPA5）基因3′非翻译区的变异与肝细胞癌预后的关系。方法从288例肝细胞癌患者外周血中提取DNA,采用TaqMan检测HSPA5基因的rs16927997、rs1140763和rs12009。Kaplan-Meier方法和Log-rank检验用于评价总生存率。结果 HSPA5单体型的分布与临床特性不相关。单变量分析显示等位基因、基因型、单体型和双体型不影响生存。多重比较结果显示临床特征与病人总的预后无关（P〉0.05）。结论中国人HSPA5基因3′非翻译区的变异对HCC的预后没有明显影响。     

庚型肝炎病毒5‘非编码区基因分析及基因型的初步划分

为了分析我国庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的基因结构特点，对２名个体供血者、２例慢性肝炎患者及２例肝硬化患者的血清标本进行了庚型肝炎病毒基因组５’非编码区２７７个核苷酸的基因扩增、分子克隆和序列分析，并利用基因分析软件处理结果。结果表明，分离出的６株ＨＧＶ５’非编码区基因序列（Ｇ００１～Ｇ００６）之间同源性在９６．２％以上。而与国外报道的３株ＨＧＶ序列比较同源性在８６．９％～９１．６％。通过对６株ＨＧＶ（Ｇ００１～Ｇ００６）及国外报道的３株ＨＧＶ基因序列变异性的比较，将ＨＧＶ基因型初步划分为不同的３个组。结果提示我国ＨＧＶ株５’非编码区序列有较高的同源性，而与国外报道的有较大差异，但不同毒株在此区域均可能形成稳定而相似的二级结构模式。     

SiRNA对丙型肝炎病毒5''非翻译区的干扰作用实验研究

目的研究多种siRNA对丙型肝炎病毒（HCV）5’非翻译区（5＇-UTR）的干扰作用。方法以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因，构建HCV5’UTR与GFP核酸序列连接的表达载体：pcDNA—HCV-5’UTR—GFP。设计针对HCV5’UTR区3段小干扰RNA（siRNA），siRNA与表达质pcDNA—HCV-5’UTR—GFP共转染HepG2细胞中，采用荧光显微镜观测细胞内荧光强度改变，并且用流式细胞术量化分析细胞荧光强度变化，评价多种siRNA对HCV基因表达的作用。结果成功构建含HCV5’UTR区的绿色荧光蛋白基因，siRNA能特异性地抑制绿色荧光蛋白基因的表达，siRNAA、siRNAB和siRNAC的抑制率分别为68．4％、72．6％、75．6％；siRNA＋siRNAB、siRNB＋siRNAC和siRNA＋siRNAc的抑制率分别为91．8％、87．2％、92．4％；siRNA＋siRNAB＋siRNAC的抑制率最高，为95．7％。结论多种siRNA对HCV5’UTR区具有干扰作用，组合使用效果更好。     

PPP1R3基因3′端非翻译区5 bp缺失/插入多态性与2型糖尿病相关性研究

目的　研究 1型蛋白磷酸酶骨骼肌特异糖原靶向调节亚单位 (PPP1R3)基因 3′-非翻译区 5 bp缺失 /插入 (deletion/insertion,D/I)多态性与 2型糖尿病 (type 2 diabetes,T2 DM)的相关性。方法　选取安徽省合肥地区汉族 T2 DM患者 2 6 8例 ,正常对照 10 6名 ,用聚合酶链反应扩增片段长度多态性技术进行基因型测定。结果　 (1) PPP1R3基因 3′-非翻译区 5 bp D/I多态性的基因型及等位基因频率在 T2 DM与正常对照组间分布差异无显著性 (P>0 .0 5 )。(2 ) T2 DM或正常对照组中不同基因型间发病年龄、病程、空腹血糖、餐后 2 h血糖、空腹胰岛素、胰岛素敏感指数、体重指数、腰臀围比、收缩压、舒张压差异均无显著性 (P>0 .0 5 )。(3) PPP1R3基因 3′-非翻译区 5 bp D/I多态性频率与日本人群和加拿大人群相近。明显低于 Pima印第安人、瑞典的白人。结论　 PPP1R3基因 3′-非翻译区 5 bp D/I多态性与安徽省合肥地区 2型糖尿病发病无明显关联 ,具有明显的种族差异。     

淀粉样前体蛋白5'端启动子非翻译区域的核因子结合区可调控基因表达

<正>细胞外大量β淀粉样蛋白(Aβ蛋白)的堆积是Alzheimer病(AD)和DOWN综合症的神经病理学表现。Aβ蛋白来源于大量的有差别剪接的淀粉样前体蛋白(APP)。有数据显示APP基因的表达水平对Aβ蛋白堆积的病理过程有重要作用。     

2a型丙型肝炎病毒5’非编码区的RACE护增及二级结构的分析

目的：获得真全长中国大陆2a型丙型肝炎病毒（HCV）5’非编码区（5’UTR）cDNA，并分析其一级结构和二级结构，为进一步研究其在HCR复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础。方法：利用逆转录套式聚合酶链反应（RT－PCR）联合限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）初步筛选出1例2a型HCV感染者，采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增出一条约800bp的cDNA片段，A－T克隆，用RFLP与PCR鉴定重组子，全自动序列分析仪测定插入子序列，RNAdraw预测二级结构。结果：RACE法获得真全长2a型HCV 5’端序列。5个克隆中，3个克隆含全长5’UTR序列，与HCV－1，HC－C2，HC－J6，HC－J8相比，同源性分别为93．6％－94．4％，92．1％－93．0％，98．8％－99．7％，96．2％－96．5％，与2a型标准株HC－J6相比，21，170，222，247，339位不同，分别为G，A，C，C，T,但这些突变不影响其二级结构。另外2个克隆为5’端缺失突变株，分别缺失54bp和144bp。结论：RACE技术快速、有效、实用，可用效获得病毒基因组的末端序列；依此获得中国大陆2a型HCV的5’UTR cDNA；在感染者血液中存在5’端部分缺失的HCV基因片段。     

人类α-、β-、γ-珠蛋白mRNA的5＇端和3＇端非翻译区的核苷酸顺序

导言快速DNA顺序法技术的建立使我们能描绘出人类珠蛋白mRNA的顺序。这些方法就是用反转录酶从mRNA合成互补的DNA (cDNA),并测定出它的顺序。在细菌质粒中,克隆这些双链的cDNA,从而可以获得大量纯DNA,这大大简便了顺序的分析。然而这些方法对推导珠蛋白mRNA的5’末端的顺序常常是无效的,因为在制备双链cDNA克隆期间,各种长度不同的5’端顺序就被消化并丢失。人类珠蛋白mRNA的5’端和3’端非翻译区是极为有趣的,虽然不知道它们的确切功能,但在蛋白质合成的过程中,似乎起着必要的作用。在本文中将阐述我们用作分析人类α、β、γ珠蛋白mRNA 5’端非翻译区顺序的方法。我们还利用γ珠蛋白cDNA的质粒获得的一种克隆来测定~Aγ珠蛋白mRNA的3’端非翻译区的全部顺序。