人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选

目的　探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性。方法　从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因 ,以pcomb3H为载体 ,构建噬菌体抗体库 ,以 2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行 6轮亲和筛选 ,再以人成纤维细胞进行 2轮吸附 ,以筛选出抗肺癌细胞抗体。以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性。结果　构建成噬菌体抗体库 ,库容为 7.5× 10 7个克隆 ,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为 10 0 % (10 / 10 )和 90 % (9/ 10 )。通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗。结论　从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的 ,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的。     

从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体,对其抗原结合活性的序列进行分析鉴定。结果;经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判断所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定

目的: 构建人源噬菌体抗体库并制备抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段 (NH- LBP)的单克隆抗体 (mAb)。方法:以噬菌体展示系统(pComb3H/VCSM13)建立人源噬菌体抗体库(Fab), 并以昆虫细胞sf21在无血清培养基 (SF 900Ⅱ )中,通过BAC- TO- BAC杆状病毒表达系统来表达NH -LBP。再以NH -LBP为抗原, 从人源噬菌体抗体库中筛选可产生抗NH- LBPmAb的菌株并进行鉴定。结果: 昆虫细胞sf21可表达人源NH- LBP, 经亲和纯化柱芯 (TALON)有效纯化后, 获得约8mg的NH- LBP。成功地建立人源噬菌体抗体库, 库容达5. 0×108 CFU。经 8轮筛选后, 抗体库被富集 1. 85×104 倍。经ELISA法鉴定, 获得 3株可产生抗NH -LBPmAb的菌株(核酸序列及氨基酸序列见GenBank中的: AY337713,AY337714 )。结论: 以昆虫细胞sf21表达NH LBP及以其为抗原制备噬菌体mAb是可行的。本研究为进一步建立抗NH- LBP的二硫键稳定的Fv抗体 ( disulfidestabilizedFvfrag ments, dsFv), 研究人体内LBP的变化规律和过度炎症反应的防治奠定了基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选

用聚合酶链伸反应从人外周血淋巴细胞克隆出Ｆｄ段和ｋ链基因，重组到表达载体ｐＣＯＭＢ３中，构建了人源性噬菌体抗体，将乙肝病毒表面抗原固相化对噬菌体抗体库进行了三轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，使特异性噬菌体抗体得到了富集，筛选到了抗ＨＢｓＡｇ的人单抗。     

人源性天然抗体库的构建及初步鉴定

目的 构建较大容量的人源性天然抗体库。方法 以未经铭疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源，扩增多样性的Ｋ轻链基因和 ＩｇＧ／ＩｇＭ重链Ｆｄ段基因，分别构建铡库和重链库，然后组合为Ｆａｂ段面展示的噬菌体抗体库。通过多次重组积累达到理想的库容，对抗体库进行筛选和鉴定。结果 经过５次轻、重链基因的重组和转化，获得了库容为１×1０～９的人源性天然抗体库。该抗体库性能良好，用３种抗原进行“亲和吸附－洗脱－扩增”淘筛，获得针对其中两种抗原的７株特异性噬菌体抗体。结论天然抗体库为用于不经免疫制备人源性单克隆抗体创造了良好的条件。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display

Four human monoclonal antibodies (MAbs) to hepatitis A virus (HAV) were isolated from a phage-displayed antibody library constructed from the peripheral blood lymphocytes (PBLs) of HAV-immune donors. The four MAbs showed differences in their affinity: two (HA6, HA9) of them were dominant after four rounds of panning, and showed higher affinity than the other two (HA1, HA12). All four MAbs showed HAV-neutralizing activity in radioimmunofocus inhibition assay and their neutralizing activity was positively correlated with their affinities. Analysis of their epitope specificity by cross-competition binding assays suggested that HA6 and HA9 recognize extensively overlapping epitopes, which overlap with those of HA1 and HA12, although HA1 and HA12 recognize distinct epitopes. In addition, competition assays with known neutralizing murine MAbs suggested that the epitopes of four human MAbs extensively overlap with those of B5B3 and K34C8 which are distinct but reside within the single, immunodominant neutralization site on the HAV capsid. The human MAbs (HA6 and HA9) with highest affinity may be useful in the immunoprophylaxis of HAV infection.     

从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究

目的 从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体。方法ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定，竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体，中和试验进一步确定中和活性，进而对其序列进行测定和分析。结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体，竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合，中和试验确定其具有一定巾和活性，编号为M1A和P8A，测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆。结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性，它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础。     

从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛人单链抗体

目的：从半合成噬菌体抗体库中克隆抗地高辛（Dig）人单链抗体（ADA ScFv）,为Dig中毒的诊断和治疗提供人源性抗体。方法：①以改良法制备Dig-BSA偶联物②以固相化的Dig-BSA偶联物对人噬菌体ScFv抗体库进行了4轮筛选,通过ELISA筛选出能结合Dig的抗体克隆并鉴定其活性,通过ELIS竞争抑制实验分析其特异性,对阳性克隆的DNA进行测序分析。结果：①在对抗体库的筛选过程中可见有明显的富集;②获得一株可结合Dig及其类似物的阳性克隆;③阳性克隆的可变区分别属于VH5和Vλ1亚群。结论：利用噬菌体抗体库技术获得了能与Dig及其它洋地黄类药物结合的人ADA ScFv,经过一步分析及抗体工程改造后,有可能为临床上诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源性抗体。     

应用噬菌体展示技术筛选、鉴定抗汉滩病毒单克隆抗体的模拟表位

目的 :应用噬菌体 12肽文库筛选抗汉滩病毒单抗 (mAb)F3、B11的模拟配体肽 ,并对其免疫学特性进行初步分析。方法 :以纯化的mAb为筛选配基 ,进行噬菌体肽库的生物亲和淘选。用ELISA法鉴定筛选克隆的结合活性 ,对阳性克隆进行序列测定和分析。用动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒展示的抗原肽的免疫特性。结果 :通过 3～ 4轮生物淘选 ,ELISA显示筛选到的多数噬菌体克隆均可与mAb特异性结合 ;与mAbF3结合的阳性克隆的氨基酸序列高度一致 ,均为 MHGP TKNQMWHT ,与HTNV/SEOVM蛋白G2区第 75 0～ 75 9位氨基酸具有较高的同源性 ;而mAbB11特异性的结合肽在氨基酸水平上表现出一定的多态性 ,其序列的基序尚未能确定 ;动物免疫试验表明 ,噬菌体肽抗原具有良好的免疫反应性和免疫原性 ,是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物。结论 :获得了具有良好结合活性的模拟表位肽 ,为基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础。     

从噬菌体短肽库中筛选单克隆抗体识别的抗原表位

将随机合成的寡聚核苷酸重组到噬菌体表面单价表达载体，构建了噬菌体随机八肽库。以抗原识别性明确的单克隆抗体９Ｅ１０固相化，对噬菌体短肽库进行了４～５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，任选多个所获克隆进行ＥＬＩＳＡ检测。发现第４轮后６／２２个克隆可与９Ｅ１０结合，第５轮后１０／１０可与９Ｅ１０结合，此结合反应可被９Ｅ１０所针对的十肽抗原以及游离的９Ｅ１０特异性抑制。对所获阳性克隆进行ＤＮＡ序列测定发现，它们的序列可分为两种，其中一种序列与ｃ－ｍｙｃ十肽具有同源序列ＩＳＥｘｘＬ，而另一种的序列则完全不同。证实噬菌体表面单价表达体系用于构建噬菌体短肽库的有效性，为进一步筛选其它的具有高亲和力的特异性短肽打下了基础。     

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。