人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的 构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体（ScFv）。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果 成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论 成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选

目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。     

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的:筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)单链抗体(ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定, 为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法: 采用噬菌体表面展示技术, 以乙肝病毒核心抗原为包被抗原, 从人源性单链噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-感染-扩增"的筛选过程, 获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆, 并在大肠杆菌HB2151中进行ScFv可溶性表达, 对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果:筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性, 并可在大肠杆菌中进行可溶性表达;基因序列测定表明, 该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符, 轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论:利用噬菌体抗体库技术, 成功筛选出人源性抗HBcScFv并获得其基因序列。     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选

目的　构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法　用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果　17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论　成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。     

Calculation of monoclonal antibody affinity constants directly from antibody dilution curves

A method for estimating the affinity constants of monoclonal antibody directly from antibody dilution curves is described.     

治疗性抗体的改造

市场上已有18个被FDA批准的单克隆抗体,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人类疾病。治疗性抗体代表了生物制药业发展最快的领域之一。随着技术的发展,各种形式的工程抗体被构建来改善它们的特性和效能,包括:鼠抗体人源化,提高生物学活性,如亲和力成熟,改进效应功能,改善药代动力学。文章评述了这一领域的最新进展,同时也讨论了工程抗体的免疫原性和亲和力。     

A rapid method for the determination of antibody affinity

A rapid method for estimating antibody affinity is described. To perform the assay fixed amounts of radiolabeled antigen and antibody are mixed in different total reaction volumes. The fraction of antigen bound to antibody is measured in aliquots from each reaction volume by the ammonium sulfate precipitation technique. Affinity constants can be estimated from these data graphically or by means of a microcomputer. This method is much quicker and easier to perform than traditional techniques for estimating antibody affinity.     

免疫性抗体在不孕不育妇女诊治中的作用

目的探讨抗精子抗体（AsAb）、抗子宫内膜抗体（EMAb）、抗心磷子抗体（ACAb）和抗卵巢抗体（AO-Ab）在不孕不育过程中的作用。方法采用ELISA法检测AsAb、EMAb、ACAb和AOAb。结果AsAb阳性率为29.7%,EMAb阳性率为16.3%,ACAb阳性率为15.2%,AOAb阳性率为14.1%。结论AsAb、EMAb、ACAb和AOAb和不孕不育密切相关,对女性不孕不育有一定的诊断价值。可以作为不孕不育症妇女常规检查的项目。     

Identification of HBsAg-specific antibodies from a mammalian cell displayed full-length human antibody library of healthy immunized donor

Hepatitis B immunoglobulin (HBIG) is important in the management of hepatitis B virus (HBV) infection. Aiming to develop recombinant monoclonal antibodies as an alternative to HBIG, we report the successful identification of HBV surface antigen (HBsAg)-specific antibodies from a full-length human antibody library displayed on mammalian cell surface. Using total RNA of peripheral blood mononuclear cells of a natively immunized donor as template, the antibody repertoire was amplified. Combining four-way ligation and the Flp recombinase-mediated integration (Flp-In) system, we constructed a mammalian cell-based, fully human, full-length antibody display library in which each cell displayed only one kind of antibody molecule. By screening the cell library using fluorescence-activated cell sorting (FACS), eight cell clones that displayed HBsAg-specific antibodies on cell surfaces were identified. DNA sequence analysis of the antibody genes revealed three unique antibodies. FACS data indicated that fluorescent strength of expression (FSE), fluorescent strength of binding (FSB) and relative binding ability (RBA) were all different among them. These results demonstrated that by using our antibody mammalian display and screening platform, we can successfully identify antigen-specific antibodies from an immunized full-length antibody library. Therefore, this platform is very useful for the development of therapeutic antibodies.     

抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性研究

目的研究抗CD3/抗CD20双特异双链抗体的生物学活性.方法采用亲和层析法纯化本室构建的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体可溶性表达产物,并用SDS-PAGE,Westernblot和分子排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验测定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用3H-TdR掺入实验和51Cr释放试验测定该双特异双链抗体的生物学性质.结果纯化的抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与Jurkat(CD3+)和Daudi细胞(CD20+)的结合活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环,并能竞争性封闭亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47与Jurkat和Daudi细胞的结合位点;该双特异双链抗体具有促有丝分裂原作用和介导激活的T细胞杀伤Daudi细胞的活性.结论抗CD3/抗CD20双特异双链抗体具有与亲代鼠源性抗体HIT3a和HI47相同的性质,且能介导激活的T细胞杀伤表达CD20抗原的肿瘤细胞,是一个有望用于B细胞恶性肿瘤临床治疗的双特异性抗体.     

微型双功能抗体抗CD3／抗CD20的构建和表达

目的：构建和表达抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并测定微型双功能抗体的生物学活性。方法：采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot和分了排阻层析鉴定纯化产物;采用FACS法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。结果：DNA序列测定结果表明：抗CD3／抗CD20微型双功能抗体已构建成功,表达可溶性产物的产量达1mg/ml以上,纯化产物中二聚体的比例达90％,具有与Jurkat(CD3^ 0和Daudi细胞（CD20^ ）结合的活性,且能同时与Jurkat和Daudi细胞结合形成玫瑰花环。结论：利用Diabody形式,首次成功地构建了抗CD3／抗CD20微型双功能抗体,并获得较高表达,表达产物具有与相应2个靶抗原结合的活性。     

单克隆的抗-HBs在同系鼠体内诱导抗-HBs的观察

作者采用BALB/c鼠的抗-HBs单克隆抗体(Ab_1)作为抗原,免疫同系BALB/c小鼠,使其在自身体内产生Ab_2,观察了由Ab_2诱导的Ab_3的消长情况。经测定其血清,免疫小鼠在第7天出现Ab_2,随后第9天、第19天出现Ab_2的显著增高。Ab_3的出现是在第9天,随后在第11天,第17天和第21天出现增高现象。Ab_2与Ab_3的量的变化,呈周期性消长。一般说来,当Ab_2增高时,Ab_3减低;若Ab_2降低,则Ab_3增高。实验过程中,还发现Ab_3能与外界进入体内的HBsAg结合。上述实验中出现的Ab_2和Ab_3之间的相互刺激和相互中和的现象,表明是小鼠体内自身的抗个体型抗体的调节作用的结果,因而出现了上述周期性的动态变化,支持体内存在着一个个体型——抗个体型免疫网络的理论,本文依据实验事实,认为传统的被动免疫方法,在一定条件下,也能诱导出主动免疫。     

抗IgE抗体的诱导及其对血清IgE水平的抑制

用ＩｇＥＦｃε片段和钥孔血蓝蛋白聚合物（ＫＬＨ－ＩｇＥ）免疫小鼠，产生了内源性抗ＩｇＥ抗体，同时伴有血清ＩｇＥ含量下降。这种状况在新生小鼠可保持１２周，而在同剂量ＫＬＨ－ＩｇＥ免疫的成年小鼠体内只能保持４周。以５倍剂量免疫成年小鼠，诱导出较高水平的抗ＩｇＥ抗体，ＩｇＥ水平也显著被抑制，并保持１２周，同时，ＩｇＥ分泌细胞数也显著减少。提示诱导产生的内源性抗ＩｇＥ抗体既可加速体内ＩｇＥ抗体的清除，也可抑制ＩｇＥ抗体的产生。     

抗核抗体核型分布及核型与特异性抗体相关性分析

目的通过对ANA核型分布及核型与特异性抗体相关性分析,为临床对ANA和ANA谱检测结果判读提供参考。方法用间接免疫荧光法检测ANA,免疫印迹法检测ANA谱,对449例ANA或ANA谱阳性的结果进行核型和特异性抗体分析。结果 ANA核型分布以核颗粒型为主,占78.2%;核型与特异性抗体有一定的相关性,但同一种自身抗体可出现不同的荧光核型。结论 ANA和ANA谱同时检测能提高AID的检出率,有助于准确的判断特异性抗体,对AID的诊断、病情监测、预后判断有十分重要的作用。