柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV因的克隆及阻断

从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段。利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断，得到一株遗传稳定的破坏于。验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度。     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrX基因的敲除及多柔比星产生菌的构建

柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体,由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列,将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963,转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因,得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断,对酸敏感的副产物减少,柔红霉素的产量增加了近3倍,将原野生菌改造成为多柔比星产生菌,发酵效价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当,为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。     

表柔红霉素工程菌的构建及其原生质体紫外诱变

本研究将质粒pYG836转化到柔红霉素产生菌SIPI-DM中,采用同源重组双交换法,用aveBIV基因置换基因组上的dnmV基因,得到稳定遗传的表柔红霉素工程菌DM3.为进一步提高工程菌的发酵单位,对其原生质体进行连续4次的紫外诱变育种,最终得到一株发酵单位较出发菌株提高T93.7%的突变菌株.     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrV基因的克隆及应用

通过PCR从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约840bp的目的片段,其中包括了长度为828bp的dnrV全长序列。将dnrV基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )及pET-28a( )中,在宿主菌BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达,经SDS-PAGE电泳和Western blotting验证正确。进一步将dnrV和doxA基因克隆至链霉菌表达载体pYG505和pYG907并转化SIPI-1482,筛选得到的硫链丝菌素抗性转化子发酵实验证明两个基因的协同表达能提高柔红霉素的产量。     

柔红霉素C-14羟化酶基因在E.coli中的克隆、融合表达及酶的纯化

doxA基因编码柔红霉素C-14羟化酶（DoxA）。本研究将来自Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482的doxA基因克隆至高效表达载体pET32a中，并在E.coli中表达。经Western blotting实验证明产物融合蛋白表达正确且以包函体形式存在，并初步研究了DoxA的分离纯化方法。     

微生物来源化合物SIPI-763-1抗生素的研究分析

目的:对微生物来源化合物SIPI-763-1抗生素进行研究分析,为今后的临床合理用药提供可靠的参考依据。方法:采取培养基优化、大规模发酵、发酵液乙酸乙酯萃取、硅胶柱分离等措施,自SIPI-763菌株发酵液中分离得到SIPI-763-1化合物,分析其结构、生物学活性。结果:SIPI-763-1属于核苷化合物,同丰加霉素结构一致,具有较强的抗真菌活性。结论:SIPI-763-1化合物为抗真菌抗生素的主要活性成分,在今后的临床抗生素应用中值得给予关注。     

Avermectin C5-O-甲基转移酶基因的克隆、序列分析及其基因置换

C5 O 甲基转移酶基因 (aveD)位于阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis)染色体 3 4kbBamHI的片段上 ,通过构建avermectin基因组约 3 4kbBamHI片段的亚基因文库 ,用PCR的方法获得该基因的连锁基因C5 酮基还原酶基因 (aveF) ,并作为探针筛出aveD的克隆子。测序后和GenBank做同源比较 ,结果一致。构建基因置换穿梭载体 pHJ5 80 3 (pHZ13 5 8∷aveD&Amr) ,通过ET12 5 67::pUZ80 0 2属间接合转移导入S .avermitilis。放松培养后筛选出双交换重组菌株 ,并用PCR验证重组菌株的aveD已经破坏 ,将重组菌株摇瓶发酵液提取avermectin进行色谱质谱联机分析 ,发现重组菌株仅产生 4个组分 ,与出发菌株的 4个B组分完全一致。     

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。     

杆菌肽产生菌的诱变育种及培养基优化

以地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis SIPI-669-3为出发菌株进行诱变选育和发酵培养基优化,以提高杆菌肽产量.采用硫酸二甲酯(DMS)、紫外(UV)及钴-60(60Co)γ射线对SIPI-669-3进行诱变选育,并采用单因素试验和响应面法优化高产菌株发酵培养基.经过连续复合诱变,筛得高产突变株SIPI-γ93-14,产量较出发菌株提高了81.4％.优化后的发酵培养基碳、氮源为淀粉5.71％、豆粕10.0％和硫酸铵0.15％,此条件下杆菌肽产量较优化前提高14.5％.     

菌株SIPI-2013406的次级代谢产物分离纯化与菌种鉴定

利用阴离子交换色谱和反相C18色谱柱纯化菌株SIPI-2013406的代谢产物,获得纯度高于98％的化合物样品.采用质谱和核磁共振鉴定结构,推测该产物为富马酰-L-丙氨酸.产生菌经过形态和分子特征鉴定,确定菌株SIPI-2013406为产黄青霉种(Penicillium chrysogenum).     

降血脂候选新药SIPI-4884有关物质的HPLC法测定

SIPI-4884是由本室自主研发的降血脂候选新药.本研究以其合成路线中的各中间体及可能的副产物或降解产物为对象,建立了高效液相色谱法检测有关物质.采用C18色谱柱,以四氢呋喃-甲醇-0.02 mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调至pH4.5)(13∶48∶39)为流动相,检测波长255nm,以检测非手性有关物质.SIPI-4884对映异构体的色谱条件为:CHIRALCEL AS-H色谱柱,流动相为正己烷-乙醇-三氟乙酸(80∶20∶0.1),检测波长255 nm.3批样品的总杂质量都小于1％,其中最大杂质是5-羰基物.     

4′-甲基-7-(2-羟基-3-异丙胺基-丙氧基)-黄酮盐酸盐对冠脉血流和家兔实验性心肌梗塞的影响

SIPI-549 is a new cOmpound. In Langendorff's isolated rabbit heart, SIPI-549 significantly increased coronary blood flow (p<0.01), but did not change themyocardium contractibility and heart rate. A study of the uptake of ~(86)Rb by the mouse heart showed a significant increase of nutritional blood flow in the SIPI-549 treated group (p<0.05). On intact dogs, SIPI-549 also showed a significant increase of coronary blood flow (p<.05) and decrease of coronary resistance (p<0.01), but no change of cardiac output and blood presure was observed.In the model of myocardial infarction by high level double-ligation of the anterior descending branch of the left coronary in rabbits, iv SIPI-549 (4.1 mg/kg) significantly reduced the ΣST, NST and NO The size of infarct myocardium was significantly reduced (p<0.05) 24 h after ligation of the coronary artery Similar results were found in the propranolol (1 mg/kg) group. However, no obvious difference between the two groups was observed.     

SIPI-7623与辛伐他汀联合用药对高脂血症大鼠的降血脂作用

目的探讨SIPI-7623与辛伐他汀联合用药对高脂血症大鼠的降血脂作用。方法所有大鼠分为空白组、模型组、SIPI-7623低剂量组(20 mg/kg)、SIPI-7623中剂量组(40 mg/kg)、SIPI-7623高剂量组(80 mg/kg)、辛伐他汀低剂量组(5 mg/kg)、辛伐他汀高剂量组(10 mg/kg)、联合给药低剂量组(SIPI-762320 mg/kg+辛伐他汀5 mg/kg)及联合给药高剂量组(SIPI-762340 mg/kg+辛伐他汀5 mg/kg),每组6只。除空白组外,其他各组大鼠均按体质量给予脂肪乳剂灌胃造模。造模成功后分别给予相应干预药物。连续给药21 d后测定大鼠血脂指标,包括总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C),并计算相应抑制率。处死大鼠后取肝脏进行苏木精-伊红染色切片并在镜下观察病理变化情况。测定大鼠谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,AST)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)以观察安全性。结果SIPI-7623各剂量组、联合给药各剂量组及辛伐他汀高剂量组大鼠TC、TG及LDL-C水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)。SIPI-7623低、中及高剂量组对TC的抑制率分别为41.34%、42.61%和46.30%,对TG的抑制率分别为53.06%、56.12%和68.37%,对LDL-C的抑制率分别为46.84%、46.84%和56.98%。联合给药低剂量组及高剂量组对TC的抑制率分别为53.35%和52.23%,对TG的抑制率分别为63.27%和65.30%,对LDL-C的抑制率分别为65.05%和61.67%。辛伐他汀高剂量组对TC、TG及LDL-C的抑制率分别为39.26%、53.06%和42.43%。各组间大鼠ALT、AST、CK及CK-MB差异均无统计学意义(P>0.05)。病理观察结果显示,联合给药各剂量组和SIPI-7623中、高剂量组大鼠肝脏病理变化情况优于其他各组。结论SIPI-7623具有降低血脂的作用,且与辛伐他汀联用效果优于单独使用SIPI-7623和辛伐他汀。     

4′-甲基-7-(2-羟基-3-异丙胺基丙氧基)-黄酮盐酸盐对实验性血栓形成的影响

4′-甲基-7-(2-羟基-3-异丙胺基丙氧基)-黄酮盐酸盐(SIPI-549)对大鼠和家兔实验性血栓形成有剂量(或浓度)依赖性的抑制作用。ⅳ7.5～20.0 mg/kg,使大鼠颈动—静脉旁路血栓湿重减轻。家兔半体内试验(ⅳSIPI-549 10 mg/kg),可使Chandler管中的雪暴现象出现时间和血栓形成时间延长,血栓湿重和干重减轻。家兔体外实验与半体内试验的结果基本一致。     

SIPI—644对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的作用

用乌头碱诱发的大鼠室性心律失常模型观察了SIPI-644十二指肠给药(id)的抗心律失常作用。本品id 50,100和200 mg/kg,均能显著对抗乌头碱诱发的各种室性心律失常,但三个剂量组之间没有明显差异p>0.05),抗心律失常作用的强度和剂量没有明显相关性。其id的药效比iv的药效弱,它和胺碘酮、静注的ED_(50)分别为12.3和27.8mg/kg,它们约TI分别为11.7和5.3。     

多巴胺衍生物的合成及其对心功能的影响

合成了7个与三肽片段或活性分子联结的多巴胺衍生物。在麻醉犬心功能试验中,发现引入缓激肽片段 Phe-Ser-Pro 的多巴胺(SIPI-650)可非常显著地增加心肌收缩力、左心室压和平均动脉压;引入乙酰巯甲丙脯酸(SIPI-430)能显著增加心肌收缩力,对血压、心率则几无影响;在γ-谷氨酰多巴胺的α位再引入一个多巴胺(SIPI-689)能显著增加心肌收缩力、血压和左心室压。