支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞联合培养对IL-8释放的影响

目的:探讨支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞联合培养对细胞趋化因子白细胞介素(IL)-8分泌的影响。方法:人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞与人外周血嗜酸性粒细胞联合培养;应用流式细胞微珠实验(CBA)方法定量细胞培养上清液中细胞趋化因子IL-8的浓度;用RT-PCR方法分析经与嗜酸性粒细胞联合培养后BEAS-2B细胞中IL-8的基因表达。结果:与嗜酸性粒细胞联合培养后,BEAS-2B细胞中IL-8基因表达显著上调,细胞联合培养上清液中IL-8释放显著增加。结论:嗜酸性粒细胞与支气上皮细胞联合培养可活化支气管上皮细胞中IL-8基因表达和促进其蛋白质分泌。     

p38 MAPK在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP-1中的作用

目的:探讨支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞联合培养过程中炎性介质的释放及其机制. 方法: 应用流式细胞微珠实验(CBA)方法定量比较嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞及其联合培养上清液中单核细胞趋化蛋白(MCP)-1的释放以及p38 MAPK抑制剂SB 203580干预的影响;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析联合培养过程中嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞MCP-1基因表达的活化及SB 203580对MCP-1表达的抑制作用. 结果: 经嗜酸性粒细胞活化后,支气管上皮细胞中MCP-1基因表达明显上调;嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP-1蛋白质释放显著增加[(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L, P《0.001];多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞不能释放MCP-1,但其在与支气管上皮细胞联合培养过程中仍可增加支气管上皮细胞释放MCP-1 [(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P《0.001];p38 MAPK抑制剂SB 203580可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达MCP-1基因,显著降低正常嗜酸性粒细胞和多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞联合培养过程中MCP-1的释放[(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L和(868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P《0.001]. 结论: 嗜酸性粒细胞可通过p38 MAPK信号传导通路活化支气管上皮细胞表达MCP-1,调控过敏性气道炎症反应.     

支气管上皮细胞表达IL-6和IL-8的研究

目的以支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞为研究对象，观察在Th2型细胞因子和促炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNFα)的作用下，IL-8和IL-6的表达变化。方法通过RT-PCR方法测定Th2型细胞因子IL-4、IL-13以及促炎症因子TNFα单独和协同刺激下BEAS-2B细胞IL-8和IL-6的基因表达；通过ELISA方法测定细胞培养上清液中蛋白质的表达。结果在IL-4、IL-13和促炎症因子TNFα的单独刺激下，IL-6和IL-8的基因和蛋白质表达均较未刺激组显著增高；但IL-4、IL-13和TNFα协同刺激后，IL-8的基因和蛋白质表达进一步增高，而IL-6反而降低。结论支气管上皮细胞在TNFα和Th2型细胞因子的协同刺激下，通过调节IL-6和IL-8的表达，进一步调节嗜酸粒细胞性和非嗜酸粒细胞性炎症。     

支气管上皮细胞表达IL-6和IL-8的研究

目的以支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞为研究对象,观察在Th2型细胞因子和促炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNFα)的作用下,IL-8和IL-6的表达变化.方法通过RT-PCR方法测定Th2型细胞因子IL-4、IL-13以及促炎症因子TNFα单独和协同刺激下BEAS-2B细胞IL-8和IL-6的基因表达;通过ELISA方法测定细胞培养上清液中蛋白质的表达.结果在IL-4、IL-13和促炎症因子TNFα的单独刺激下,IL-6和IL-8的基因和蛋白质表达均较未刺激组显著增高;但IL-4、IL-13和TNFα协同刺激后,IL-8的基因和蛋白质表达进一步增高,而IL-6反而降低.结论支气管上皮细胞在TNFα和Th2型细胞因子的协同刺激下,通过调节IL-6和IL-8的表达,进一步调节嗜酸粒细胞性和非嗜酸粒细胞性炎症.     

白细胞介素-4对支气管上皮细胞表达嗜酸性粒细胞趋化因子-3的影响

目的:研究嗜酸性粒细胞趋化因子-3(eotaxin-3)在支气管上皮细胞的表达以及Th2细胞因子白细胞介素-4(IL-4)对其表达的调节,探讨支气管上皮细胞和IL-4在气道变态反应性炎症中的作用.方法:以BEAS-2B细胞和NHBE细胞为研究对象,用IL-4刺激细胞24 h,RT-PCR法检测eotaxin-3在mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中eotaxin-3蛋白的表达.结果:未经处理的支气管上皮细胞不表达eotaxin-3,用IL-4刺激细胞24 h后,可见mRNA和蛋白水平的eotaxin-3的明显表达,IL-4的这种诱导作用呈浓度依赖性增强.结论:支气管上皮细胞不仅是一种屏障细胞,也是一种效应细胞,在炎症介质IL-4的刺激下能表达eotaxin-3,可能是其参与支气管哮喘嗜酸性粒细胞炎症的机制之一.     

白三烯受体拮抗剂影响支气管上皮细胞表达Eotaxin的研究

目的：研究白三烯受体拮抗剂（leukotrienes receptor antagonists,LTRAs）对支气管上皮细胞表达嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxin,Eot）的调节,探讨LTRAs的抗炎机理。方法：用白三烯D4（leukotrienes D4,LTD4）预处理人支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞1 h,然后用白介素-4刺激细胞24h,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中Eot蛋白浓度;用不同浓度的普仑斯特预处理细胞,重复上述步骤。结果：未经白介素-4和白三烯D4处理的细胞仅表达微量的Eot;用白介素-4刺激细胞并培养24 h后,Eot表达明显增强;LTD4预处理细胞1 h,可以使白介素-4的这种诱导作用加强;普仑斯特可以完全逆转LTD4的上调作用。结论：上调白介素-4诱导Eot在支气管上皮细胞的表达是白三烯参与支气管哮喘嗜酸性粒细胞炎症的机制之一;普仑斯特逆转对LTD4上调效应,是LTRAs治疗支气管哮喘的作用机理之一。     

IL-5上调体外培养的人嗜酸性粒细胞TGF-β1的表达

目的研究白细胞介素-5（IL-5）对人嗜酸性粒细胞（Eos）中转化生长因子-β1（TGF—β1）表达的调控作用。方法采用改良的密度梯度离心法分离并体外培养人外周血Eos，实验组加入相同浓度的白细胞介素-4（IL-4）、IL-5和干扰素γ（IFNγ）以及不同浓度的IL-5共同培养，ELISA和RT—PCR法检测细胞培养上清液TGF—β1蛋白和mRNA的表达。结果与对照组相比，浓度均为10^-9mol／L的IL-4、IL-5在蛋白水平和转录水平对TGF-β1的表达均有上调作用，而IFNγ则表现为抑制；10^-11，10^-9、10^-7mol／L IL-5均能显著增强体外培养的Eos中TGF—β1蛋白的表达。结论Th2型细胞因子IL-5可以上调人嗜酸性粒细胞中TGF—β1的表达。     

阿托伐他汀对脂多糖诱导的人肺上皮细胞分泌PGE2和IL-6的影响

目的：探讨阿托伐他汀（atorvastatin）对经脂多糖（LPS）诱导人肺上皮细胞(A549)的炎症细胞因子PGE2和IL-6分泌的影响。方法：对LPS诱导的人肺上皮细胞给予不同浓度的阿托伐他汀干预，同时设置对照组，分别收集其培养上清液，采用ELISA方法，比较PGE2和IL-6浓度。结果：①在不同浓度的LPS诱导下，肺泡上皮细胞不同时间分泌PGE2和IL-6浓度明显高于未经LPS诱导的对照组（P<0.05）。②阿托伐他汀不同浓度的干预，肺上皮细胞PGE2和IL-6的分泌浓度较无阿托伐他汀干预组均有不同程度的降低（P<0.05）。结论：阿托伐他汀能降低脂多糖诱导的人肺上皮细胞炎症因子PGE2和IL-6的分泌, 提示他汀类药物对肺上皮细胞有直接抗炎作用。     

IL-13在支气管哮喘中的致病作用

支气管哮喘（bronchial asthma）是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症.支气管哮喘是以Th2型细胞因子增高和气道高反应性为特征的变态反应性疾病,白细胞介素-13（IL-13）可诱导B细胞增殖和分化,促进IgE合成,活化嗜酸性粒细胞,延长嗜酸性粒细胞的存活,诱导气道高反应性等,在哮喘的发生中起重要的致病作用.     

麻黄碱对TNF-α诱导人支气管上皮细胞eotaxin表达的影响

目的：观察麻黄碱对肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）中嗜酸性粒细胞趋化因子（eotax‐in）表达的影响,探讨中药麻黄治疗哮喘的机制。方法将体外培养的16HBE细胞随机分为对照组、TNF‐α刺激组（TNF‐α20 ng／mL）、TNF‐α＋麻黄碱组（TNF‐α20 ng／mL＋麻黄碱300μg／mL）,每组细胞均设3个复孔培养18 h;荧光定量PCR检测各组细胞eotaxin mRNA的表达;免疫细胞化学染色法和Western blot检测各组细胞eotaxin蛋白的表达;双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组细胞培养上清液中eotaxin的浓度。结果与对照组比较,TNF‐α刺激组上皮细胞eotaxin mRNA及蛋白表达、细胞培养上清液中eotaxin的浓度明显增高,差异均有统计学意义（P＜0．01）;与TNF‐α刺激组比较,TNF‐α＋麻黄碱组以上各项指标均明显降低,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论麻黄碱能抑制前炎症因子 TNF‐α诱导的16HBE中eotaxin的表达及分泌,这可能是中药麻黄治疗哮喘的机制之一。     

NF-kB及p38MAPK信号通路对支气管上皮细胞与中性粒细胞共培养IL-6分泌的调控作用

目的探讨支气管上皮细胞（bronchial epithelial cells,BEAS-2B）与中性粒细胞（neutrophils,NEU）联合培养时IL-6分泌的机制。方法免疫磁珠法提取外周血中性粒细胞,建立中性粒细胞与BEAS-2B细胞联合培养体系。应用Roche cobas e411检测上清液中IL-6浓度。结果BEAS-2B和中性粒细胞联合培养时,上清液IL-6浓度为（3691±482．3）pg／ml,与细胞单独培养[BEAS-2B（313．4±34．7）pg／ml;NEU（219．1±11．3）pg／ml]差异有统计学意义（P〈0．001）;蛋白质印迹法（Western blotting）结果显示BEAS-2B和中性粒细胞联合培养可激活BEAS-2B细胞内NF—kB及p38MAPK的信号通路;而加入NF—kB通路抑制剂MG-132,可有效抑制上清液中IL-6的分泌[（1075．3±83．9）pg／ml vs （3691±482．3）pg／ml,P〈0．01];p38MAPK通路抑制剂SB203580亦能抑制IL-6的分泌[（1532．8±176．1）pg／ml vs （3691±482．3）pg/ml,P〈0．01];且MG-132的抑制效果明显好于SB2035580[（1075．3±83．9）pg／ml vs （1532．8±176．1）pg／ml,P〈0．01];当联合使用两种抑制剂（MG-132和SB203580）时可进一步减少IL-6的分泌[（353．1±33．5）pg/ml vs （1075．3±83．9）pg／ml,P〈0．01;（353．1±33．5）pg／ml vs（1532．8±176．1）pg/ml,P〈0．01]。结论BEAS-2B细胞与NEU细胞接触后激活BEAS-2B细胞体内NF—kB及p38MAPK通路,进而调控IL-6的分泌。     

Effect of puerarin on the release of interleukin-8 in co-culture of human bronchial epithelial cells and neutrophils

Objective:To investigate the effect of puerarin on interleukin(IL)-8 mRNA expression and the protein release in the co-culture of human bronchial epithelial(BEAS-2B) cells and human neutrophils.Methods:BEAS2B cells and neutrophills were cultured separately and co-cultured with puerarin(50,100,and 200μg/mL) for a predetermined time.Cytokines in culture supematant were evaluated by protein array and IL-8 quantified by enzymelinked immunosorbent assay(ELISA).IL-8 mRNA expression was evaluated by real-time quantitative polymerase chain reaction(real-time qPCR).Results:The co-culture of BEAS-2B cells and neutrophils exhibited synergistic effects on IL-8 mRNA expression in BEAS-2B cells,but not in neutrophils after 12 h incubation(P<0.01),as compared with that in BEAS-2B cells or neutrophils alone.IL-8 protein release in the culture supematant was obviously elevated when BEAS-2B cells were co-cultured with human neutrophils as compared with that in the supematant of BEAS-2B cells or neutrophils alone after incubated for 2,6,12,and 18 h(P<0.01).Treatment with puerarin could significantly down-regulate the expression of IL-8 mRNA in BEAS-2B cells and IL-8 release in the supernatant of the co-culture of BEAS-2B cells and neutrophils(P<0.01).Conclusion:Puerarin could exhibit anti-inflammatory activity by suppressing IL-8 production from the co-culture of human bronchial epithelial cells and neutrophils.     

双氢青蒿素对甲型流感病毒H1N1诱导人支气管上皮细胞TNF-α和IL-6表达的影响及机制研究

  目的  探讨双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）对甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）A/PR/8/34（H1N1）诱导人支气管上皮细胞（BEAS-2B）促炎症因子和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）信号通路蛋白表达的影响。  方法  采用不同浓度的DHA（即0、12.5、25、50和100 μmol/L）作用BEAS-2B细胞24 h ,CCK8法检测DHA对BEAS-2B细胞活性的影响。IAV吸附BEAS-2B细胞1 h ,分别采用不同浓度的DHA（低、中、高浓度DHA ,即12.5、25和50 μmol/L）作用24 h,同时设置正常对照组和IAV组。采用实时荧光定量PCR法（real time quantitative PCR, RT-qPCR）和酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分别检测肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin 6,IL-6）的mRNA和蛋白表达水平,蛋白质印迹法（Western blot）检测磷酸化ERK（phospho-ERK, p-ERK）蛋白表达水平。采用特异性ERK激动剂（ERK agonist,20 ng/mL）作用BEAS-2B细胞（分组为正常对照、IAV、DHA、DHA+IAV、ERK agonist、DHA+IAV+ERK agonist组）24 h,观察对DHA抑制IAV诱导BEAS-2B细胞TNF-α、IL-6和p-ERK表达的影响。  结果  DHA浓度在12.5、25、50 μmol/L时,BEAS-2B细胞存活率与正常对照组比较差异无统计学意义;与正常对照组比较,IAV组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白及p-ERK蛋白表达水平增高 (P<0.05),与IAV组比较,IAV+ DHA低、中、高浓度组细胞TNF-α、IL-6 mRNA和TNF-α、IL-6、p-ERK蛋白表达水平呈剂量依赖性的下降(P<0.05);而ERK激动剂减弱了DHA抑制IAV诱导BEAS-2B细胞ERK信号通路蛋白p-ERK表达和促炎症因子TNF-α、IL-6的分泌。  结论  DHA可通过ERK信号通路抑制IAV诱导BEAS-2B细胞TNF-α和IL-6的表达。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响。方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1 953 bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒,并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中;利用双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。将HEK293T、BEAS-2B细胞分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组,分别转染GATA3过表达质粒和空白对照质粒,用双荧光素酶报告基因技术检测荧光素酶活性;用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33 mRNA相对表达水平。结果:通过PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒;重组质粒的ADAM33启动子活性较pGL3-Basic对照组...     

肥大细胞和类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养对白细胞介素-6分泌的影响

目的 观察肥大细胞和关节成纤维样滑膜细胞(FLS)共培养对FLS分泌白细胞介素(IL)-6的影响及其作用机制.方法 应用免疫组化染色法观察肥大细胞在关节滑膜中的分布.分离培养RA患者的FLS,加入肥大细胞系LAD-2共培养或用Transwell小室隔离共培养,观察上清中FLS分泌的细胞因子IL-6的变化.结果 LAD-2几乎不产生IL-6,FIS组IL-6的浓度为(3019±57)μg/L,而FLS与等量LAD-2细胞共培养的IL-6浓度为(7150±114) μg/LL(P<0.01).且其增加程度与LAD-2细胞数量呈正相关.以4%甲醛固定和Transwell小室隔离两种方法分别阻断可溶性介质分泌和细胞间相互黏附,前一组中IL-6增加可被阻断,但在后一组中不受影响.结论 肥大细胞与FLS通过可溶性介质相互作用可增加FLS的IL-6分泌,在RA发病中可能有重要意义.     

脂氧素A4通过ERK1/2通路调控气道上皮细胞上皮间质转化

目的：研究脂氧素A4(LXA4)对气道上皮细胞上皮间质转化（EMT）和卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘小鼠模型气道重塑的影响及其可能机制。方法：将BALB/c小鼠分为4组：对照组、OVA组、LXA4组和OVA+LXA4组,HE和PAS染色观察肺组织病理改变。将BEAS-2B细胞分为6组：对照组、白介素（IL）-4组、IL-13组、转化生长因子β1(TGF-β1)组、IL-4/IL-13/TGF-β1联合刺激组和LXA4预处理组。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏附蛋白（E-cadherin）mRNA水平;Western blot检测α-SMA、E-cadherin及ERK1/2、pERK1/2蛋白表达水平。结果：小鼠体内实验中,与对照组相比,OVA诱导哮喘小鼠模型出现肺泡壁增厚、间质水肿、炎性细胞浸润和肺组织破坏,肺组织PAS染色强阳性,提示杯状细胞化生和气道黏液分泌增加,而LXA4预处理可以明显改善上述OVA诱导的小鼠气道病变。BEAS-2B细胞实验中,TGF-β1组与对照组相比,细胞连接变得松散,细胞间隙增加,形态呈长梭形;IL-4/I...     

葛根素通过下调P38 细胞分裂素活化蛋白激酶活性以及NF-β通道对共培养气道上皮细胞与中性粒细胞黏附分子表达的抑制作用

Objective:In this study,we aimed to investigate the expressions of adhesion molecules on human bronchial epithelial cells and neutrophils in co-culture system,assess the effects of puerarin on suppressing these adhesion molecules expressions,and explore the roles of two crucial signal-transduction elements p38mitogen-activated protein kinase(p38 MAPK)and nuclear factor kappa B(NF-k B)in modulating adhesion molecules expressions.Methods:Neutrophils and BEAS-2B cells(one human bronchial epithelial cell line)were co-cultured,and adhesion molecules expressions on cell surface were detected using flow cytometry.The mRNA levels of adhesion molecules were assessed by real-time quantitative polymerase chain reaction(real-time qPCR).Phosphorylated p38 MAPK and inhibitor k B were analyzed by Western blot.Results:In co-culture system,adhesion molecules expressions on BEAS-2B cells and neutrophils were enhanced significantly(P0.05).Correspondingly,the mRNA levels of adhesion molecules were also increased greatly.Moreover,the pretreatment of peurarin obviously suppressed adhesion molecules expressions on cell surface.Furthermore,phosphorylated p38 MAPK and inhibitor k B in BEAS-2B cells and neutrophils were elevated in co-culture system,but decreased significantly after upon the treatment of peurarin(P0.05).Conclusions:Coculture boosted the interactions between human bronchial epithelial cells and neutrophils mimicking airway inflammation,whereas peurarin decreased the expression of adhesion molecules on cell surface by suppressing the activities of d38 MAPK and NF-κB pathways,and exhibiting its anti-inflammation activity.     

Proteasome inhibitor MG-132 regulates the expression of VEGF in human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B

Objective： To explore the effects of MG-132 on the expression of VEGF in bronchial epithelial cell line, BEAS- 2B. Methods： Semi-quantitive RT-PCR for VEGF mRNA and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for VEGF protein were performed. Results： MG-132 increased the expression of VEGF mRNA and protein BEAS-2B cells in time-and concentration-dependent manners. After 24-h stimulation, 25 ktmol/L MG-132 increased the maximal levels of VEGF protein in cell-conditioned medium. When the ceUs were stimulated with cycloheximide（CHX） before treatment with MG-132, the MG-132-induced production of VEGF protein was inhibited compared to the unstimulated cells. Supematant of condition-medium treatment with MG-132 enhanced the growth of HUVEC. Conclusion： MG-132 induces VEGF gene expression in human bronchial epithelial cells line, BEAS-2B, and the MG-132-induced expression of VEGF may modulate lung tissue injury due to airway inflammation.