Ad-hBMP-2对促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原影响的实验研究

目的观察腺病毒-人骨形态发生蛋白-2-绿色荧光蛋白(Ad-hBMP-2-GFP)转染兔软骨细胞后,hBMP-2蛋白的表达和其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原功能的影响。方法包装hBMP-2-GFP腺病毒载体,测定病毒滴度。分离培养并鉴定原代兔软骨细胞,通过基因转染技术,转染Ad-hBMP-2-GFP至兔第三代软骨细胞,RT-PCR检测hBMP-2mRNA的表达,细胞免疫荧光法和Western印迹检测软骨细胞中hBMP-2蛋白的表达和Ⅱ型胶原的变化情况,用未转染组和空病毒组(Ad-GFP)做对照。结果转染后,hBMP-2的mRNA在48h有明显阳性条带表达,对照组呈阴性,hBMP-2蛋白在48、72h的表达量随时间而逐渐增强(P0.05),同时,软骨细胞分泌Ⅱ型胶原的量也逐渐增加(P0.05)。结论Ad-hBMP-2-GFP能成功转染兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,为软骨组织工程提供功能良好的种子细胞,且为hBMP-2基因治疗骨性关节炎提供实验依据。     

鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 观察鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞的增殖和软骨细胞分泌Ⅱ型胶原是否有协同作用.方法 分离培养原代兔软骨细胞,用第3代细胞为模型,实验分为未转染组、腺病毒-绿色荧光蛋白(Ad-GFP)组、Ad-hBMP2-GFP组、鹿瓜多肽+Ad-hBMP2-GFP组,培养48 h后.RT-PCR检测hBMP-2mRNA的表达,流式细胞仪检测软骨细胞的周期.培养48、72 h后.MTT法检测软骨细胞的增殖,Western印迹检测hBMP-2蛋白和Ⅱ型胶原的表达.结果 培养48 h后,Ad-hBMP2-GFP组和鹿瓜多肽+Ad-hBMP2-GFP组hBMP-2mRNA呈阳性,而未转染组、Ad-GFP组表达呈阴性;与未转染组、Ad-GFP组、Ad-hBMP2-GFP组比较,鹿瓜多肽+hBMP-2基因组能使软骨细胞S-G2/M期细胞比例增加,软骨细胞数量增加(P<0.05),软骨细胞hBMP-2蛋白表达和Ⅱ型胶原分泌增加(P<0.01);培养48与72 h比较,鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌无显著性差异(P>0.05).结论 鹿瓜多肽能促进hBMP-2基因在软骨细胞中合成hBMP-2蛋白,鹿瓜多肽联合hBMP-2基因对软骨细胞增殖和分泌Ⅱ型胶原的功能有协同作用.     

过表达Jagged1促老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移

目的 探讨过表达Jagged1对老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力的影响.方法 PBS冲洗1～2月龄和19～ 26月龄SD大鼠股骨和胫骨骨髓,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用含10％ FBS的DMEM/F12培养基差速贴壁法进行体外培养,以Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染和vWF免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为四组:对照组(未进行基因转染的老龄大鼠内皮祖细胞组)、PIRES2-EGFP转染组、PIRES2-EGFP-Jagged1转染组和未转染的年轻大鼠来源内皮祖细胞组.荧光显微镜下计数GFP表达细胞数并计算转染效率;免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测Jagged1 mRNA和蛋白表达;Transwell培养和MTT法分别检测细胞迁移和增殖能力.结果 免疫组织化学、RT-PCR和Western blot检测均显示转染后Jagged1显著增高,PIRES2-EGFP-Jagged1转染组mRNA和蛋白表达均较对照组显著增强(P＜0.01);与对照组相比,过表达Jagged1显著增强老龄大鼠来源内皮祖细胞迁移和增殖能力(P ＜0.05或P＜0.01).结论 过表达Jagged1增强老龄大鼠来源内皮祖细胞增殖和迁移能力.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白质5A抑制Hepcidin基因表达并促进肝细胞内铁储留

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白质5A (NS5A)对Hepcidin基因表达的影响. 方法 用含HCV NS5A基因的表达质粒pcNS5A瞬时转染QSG7701细胞,采用逆转录-聚合酶链反应及Western blot试验观察HCV NS5A和Hepcidin的mRNA转录水平及蛋白质表达水平,铁染色后观察细胞内铁储留情况.检测数据的多组间比较行单因素方差分析,两两比较行LSD-t检验.结果 转染pcNS5A质粒细胞内有HCV NS5A的mRNA和蛋白的表达,未转染质粒组和转染空白质粒pRc/CMV组细胞内无HCV NS5A的mRNA和蛋白的表达.未转染质粒组、转染pRc/CMV质粒组和转染pcNS5A质粒组细胞的Hepcidin mRNA相对表达量分别为0.711±0.049、0.718±0.052和0.264±0.030,转染pcNS5A组Hepcidin mRNA表达低于未转染质粒组和转染pRc/CMV质粒组(t值分别为- 13.523和- 13.045,P值均＜0.01).转染pcNS5A质粒组细胞Hepcidin蛋白表达较未转染质粒组及转染pRc/CMV质粒组下降,且随着转染pcNS5A质粒剂量的增加,Hepcidin蛋白表达下降更明显.铁染色结果显示,转染pcNS5A质粒细胞内铁较转染pRC/CMV质粒细胞和未转染质粒细胞高.结论 HCV NS5A蛋白能抑制Hepidin的mRNA和蛋白质表达,并引起细胞内铁的储留增加.     

Klotho基因转染骨髓间充质干细胞移植对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的观察Klotho基因(抗衰老基因)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法分离、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞。慢病毒介导Klotho转染至BMSC中,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BMSC中Klotho mRNA的表达。制备大鼠慢性心力衰竭模型,随机分为正常对照组、模型对照组、增强型绿色荧光蛋白-BMSC组(EGFP-BMSC组)、EGFP-Klotho-BMSC组。细胞移植28天后多普勒超声检测心功能,荧光显微镜观察细胞存活及分布,HE染色观察心肌组织病理变化。Masson染色检测心肌胶原沉积含量和心肌纤维化程度。结果 Klotho转染BMSC后,BMSC中Klotho mRNA表达明显增多(P0.05)。移植28天后超声心动图结果显示,与EGFP-BMSC组及模型对照组比较,EGFP-Klotho-BMSC组左心室射血分数(LVEF)提高(P0.05)。EGFP-BMSC组及EGFP-Klotho-BMSC组心肌纤维化程度较模型对照组减轻(P0.05),EGFP-KlothoBMSC组较EGFP-BMSC组心肌纤维化改善更为明显(P0.05)。结论 Klotho基因联合BMSC治疗可进一步抑制心肌纤维化,减少心肌间质胶原沉积,改善心功能。     

17-β雌二醇对大鼠成骨细胞β2肾上腺素受体表达的影响

目的探讨17-β雌二醇对大鼠成骨细胞β2肾上腺素受体(β2AdR)表达的影响。方法新生SD大鼠颅骨经多次酶消化、反复贴壁和分离纯化培养得到纯净成骨细胞并进行碱性磷酸酶(ALP)染色。加入不同浓度17-β雌二醇(10-6～10-9mmol/L)培养,在不同时间点采用RT-PCR法检测细胞β2AdR mRNA基因表达,采用Western blot法检测细胞中β2AdR蛋白的表达。结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明,随着17-β雌二醇浓度的升高,7、14d培养组成骨细胞β2AdR mRNA和β2AdR蛋白表达水平均逐渐下降,并呈现药物浓度依赖性,对照组表达水平最高。结论 17-β雌二醇可抑制成骨细胞β2AdR的表达,可能是其调控骨代谢的机制之一。     

腺病毒介导的shRNA下调SHP2表达对人肝星状细胞LX-2凋亡的影响

目的探讨腺病毒介导的短发夹RNA (shRNA)下调含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)对体外培养的人肝星状细胞LX-2凋亡的影响。方法将携带靶向SHP2的shRNA并表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP分别转染体外培养的LX-2细胞;实时荧光定量PCR检测LX-2细胞的SHP2 mRNA表达;用Western blot检测LX-2细胞的SHP2、Bax及Bcl-2蛋白表达;TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测LX-2细胞凋亡。实验分组:(1)对照组:以DMEM代替腺病毒转染LX-2细胞;(2)Ad-GFP组:转染空病毒Ad-GFP;(3)Ad-shRNA/SHP2组:转染重组腺病毒Ad-shRNA/SHP2。多组间均数比较用单因素方差分析, 组间比较采用LSD检验。结果靶向SHP2的shRNA显著下调LX-2细胞的SHP2蛋白及mRNA表达(P < 0.05);TUNEL及膜联蛋白-V/碘化丙啶双标记流式细胞术检测结果显示, 与对照组LX-2细胞凋亡率(3.077%±0.731%, 9...     

野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响

目的 探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用.方法 将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)体外转染至RPMI8226细胞.通过MTT法检测细胞生长曲线,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化,Western印迹检测PTEN、FAK及p-FAK蛋白变化,Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力.结果 Ad-PTEN-GFP以感染复数为100转染RPMI8226细胞后,第4天达到最大生长抑制率为42.01%,Ad-PTEN-GFP转染RPMI 8226细胞72 h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%,PTEN mRNA及蛋白表达升高,FAK mRNA以及FAK、p-FAK蛋白表达下调,与Ad-GFP组相比差异显著(P<0.01,P<0.05);Transwell小室结果显示,转染Ad-PTEN-GFP组漏入下室内及黏附于下室面细胞数量较Ad-GFP组显著减少(P<0.01).结论 转染野生型PTEN基因的RPMI8226细胞增殖受抑,凋亡增加,细胞侵袭力明显减弱,其作用可能与下调FAK、p-FAK表达有关.     

大鼠Cx43基因慢病毒表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞表达的观察

目的:构建大鼠缝隙连接蛋白43(Cx43)基因的重组慢病毒表达载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),观察Cx43的表达。方法:采用RT-PCR技术获得大鼠Cx43基因,并将其连接到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pGC-FU中,重组获得慢病毒质粒pGC-FU-Cx43,将其与辅助包装质粒(pHelper1.0、pHelper2.0)一起共转染293T细胞,包装生产病毒并测定滴度。所获慢病毒感染大鼠BMSC后,采用荧光显微镜和Western blot方法检测Cx43的表达。结果:酶切证实Cx43基因已定向连入目的载体,测序结果显示,所构建的pGC-FU-Cx43重组慢病毒质粒序列与目标序列完全一致。获得的病毒滴度为2×109TU/ml。经分离、纯化得到BMSC;pGC-FU-Cx43转染BMSC后,可见大量EGFP表达,Cx43的表达量明显增加。结论:成功构建并包装获得较高滴度的重组慢病毒pGC-FU-Cx43。pGC-FU-Cx43可高效转染BMSC,Cx43表达增加,且实现稳定转染。     

赖氨酸特异性的去甲基化酶3A对内皮祖细胞功能的影响

目的探讨赖氨酸特异性的去甲基化酶3A(KDM3A)对内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移、管形成能力及分泌促血管生成细胞因子功能的影响。方法从同基因型成年雄性SD大鼠的后肢长骨中分离出骨髓单核细胞,EGM-2培养基诱导形成EPCs,将EPCs按完全随机设计的方法分为3组:空白组、Ad-GFP转染对照组和Ad-KDM3A转染处理组。分别用CCK-8、Transwell检测EPCs的增殖和迁移能力,基质胶检测EPCs的管形成能力。免疫印记法检测KDM3A蛋白的表达及EPCs分泌血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子1(SDF-1)蛋白表达量,同时检测调控分泌机制相关的丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、p-Akt蛋白的表达。结果与Ad-GFP转染对照组比较,Ad-KDM3A转染处理组下调KDM3A的表达可显著增强EPCs的增殖能力(1.393±0.058比1.031±0.059)、迁移能力(1.89±0.12比1.21±0.11)和管形成功能(1.552±0.109比1.027±0.038),同时EPCs合成和分泌的促血管生成细胞因子VEGF(0.738±0.029比0.153±0.003)和SDF-1(0.333±0.013比0.163±0.005)增多。与Ad-GFP转染对照组比较,Ad-KDM3A转染处理组下调KDM3A可使Akt蛋白表达增加(0.553±0.005比0.169±0.001)。结论下调KDM3A蛋白的表达可增强EPCs的增殖、迁移、管形成能力及分泌促血管生成细胞因子的功能,这可能与增加Akt蛋白表达有关。     

高糖在联合转录因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞中的作用

目的 探讨高糖在胰-十二指肠同源盒因子-1(Pdx-1)、神经元素3(Ngn 3)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化为胰岛样细胞(IPC)中的作用.方法 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/(zeo)-Ngn 3、pcDNA3.1(+)-Pdx-1,贴壁培养法分离Sprauge-Dawley雄性大鼠BMSC,流式细胞术鉴定BMSC,脂质体介导转染BMSC,并筛选稳定转染细胞培养于高糖(4.5 g/L) DMEM培养液,RT-PCR检测Ngn 3、巢蛋白、Pdx-1 mRNA的表达,ELISA法检测胰岛素浓度.结果 分离的细胞表面高表达CD44、CD105,而低表达CD34,符合BMSC特征.诱导过程中BMSC形态上趋向IPC分化,高糖培养组较低糖培养组细胞上清胰岛素浓度明显提高(F=25.77,P＜0.05),高糖质粒培养组Pdx-1、Ngn 3及巢蛋白mRNA表达水平明显高于高糖培养组及质粒转染组(F=35.12、12.76、8.34,P均＜0.05).结论 高糖对Pdx-1联合Ngn 3诱导BMSC向IPC分化具有促进作用.     

重组骨形态发生蛋白7基因转染骨髓间充质干细胞及其在该细胞中的表达

目的将重组骨形态发生蛋白7质粒（pcDNA3．1-BMP7）转染至体外培养的兔骨髓间充质干细胞中．测定骨形态发生蛋白7基因在该细胞中的表达。方法骨形态发生蛋白7基因序列测定、拼接后与报道的骨形态发生蛋白7基因序列对照：脂质体介导pcDNA3．1-BMP7转染骨髓间充质干细胞，G418筛选14d，Western blot、PCR、原位杂交检测骨形态发生蛋白7基因的表达。结果序列测定证实与GenBank报道的骨形态发生蛋白7全长基因序列一致：转染pcDNA3．1-BMP7质粒的骨髓间充质干细胞有大量骨形态发生蛋白7蛋白及骨态发生蛋白7 mRNA表达。结论脂质体介导下，重组真核表达载体pcDNA3．1-BMP7能被转入骨髓间充质干细胞．且表达了骨形态发生蛋白7及骨形态发生蛋白7 mRNA。     

Lentiviral gene transfer ameliorates disease progression in Long-Evans cinnamon rats: an animal model for Wilson disease

OBJECTIVE: Wilson disease is a copper storage disorder caused by mutations in the ATP7B gene leading to liver cirrhosis. It has previously been shown that lentiviral vectors can govern an efficient delivery and stable expression of a transgene. The aim of this pilot study was to prove the principle of a lentiviral gene transfer in the Long-Evans cinnamon (LEC) rat, an animal model of Wilson disease. MATERIAL AND METHODS: LEC rats were treated either by systemic application of lentiviral vectors or by intrasplenic transplantation of LEC-rat hepatocytes lentivirally transduced with ATP7B. The ATP7B gene expression was analyzed by RT-PCR and immunofluorescence analysis. The therapeutic effect was assessed by analysis of liver histology, serum ceruloplasmin oxidase activity, and liver copper content. RESULTS: Hepatic expression of the transgene was detected at different time-points post-treatment and lasted for up to 24 weeks (end of experiment). Liver copper levels were lowered in all treatment groups compared to untreated LEC rats. Twenty-four weeks after treatment, the area of the examined liver-tissue sections occupied by fibrosis was 48.3-57.9% in untreated LEC rats and 10.7-19.8% in rats treated with cell therapy. In systemically treated rats, only small fibrous septa could be observed. CONCLUSIONS: These data prove for the first time that lentiviral ATP7B gene transfer is feasible in Wilson disease. In our pilot study the systemic approach was more promising in ameliorating disease progression than the transplantation of lentivirally transduced hepatocytes.     

部分肝切除后的肝损伤血清和肝细胞生长因子促进大鼠骨髓细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

目的 检测大鼠骨髓中是否存在肝脏干细胞，并用肝损伤血清和肝细胞生长因子(HGF)刺激骨髓细胞向肝细胞转化。方法 SD大鼠骨髓单个核细胞分3组进行培养：(1)单纯培养基对照组；(2)肝损伤血清组(15％，血清来自于2-AAF 75％肝切除大鼠)；(3)HGF(20ng／ml)组。用甲胎蛋白(AFP)和白蛋白作为细胞标志，用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应(PCR)、巢式PCR和western blot方法，观察大鼠肝损伤血清和HGF对骨髓细胞转化的促进作用。结果 肝损伤血清组和HGF组培养后10d和20d AFP免疫组织化学和western blot染色阳性；RT-PCR AFP mRNA阳性，新鲜骨髓细胞和单纯IMDM／F12培养基组AFP蛋白和mRNA均阴性。新鲜骨髓细胞存在白蛋白mRNA表达，在肝损伤血清组和HGF组培养后10d和20d，白蛋白mRNA表达增强。结论 大鼠肝损伤血清和HGF可促使体外培养骨髓细胞表达AFP mRNA和AFP。骨髓中可能存在骨髓源性肝干细胞，并微弱表达白蛋白mRNA；肝损伤血清和HGF可以促进骨髓细胞表达白蛋白mRNA。     

慢病毒载体介导人缝隙连接蛋白43基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体,并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应获得人缝隙连接蛋白43基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43,在脂质体介导下与包装质粒和包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下观察缝隙连接蛋白43蛋白表达情况。结果所获缝隙连接蛋白43基因经测序后与GeneBank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为1×1011TU/L;感染大鼠骨髓间充质干细胞后荧光显微镜观察到胞膜位置点线状荧光分布。结论成功构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体并实现在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗心肌梗死的应用奠定了基础。     

电针刺激联合骨髓间充质干细胞移植治疗对脑出血大鼠出血灶周边区基质金属蛋白酶9及血清白细胞介素2表达的影响

目的探讨电针刺激和骨髓间充质干细胞（BMSC）移植联合治疗对脑出血大鼠出血灶周边区基质金属蛋白酶9（MMP-9）及血清白细胞介素2（IL02）表达的影响。方法向成年SD大鼠右侧尾壳核注射肝素和胶原酶诱导脑出血模型,并于术后第3天向出血灶移植BMSC后施以电针刺激（Ea．BMSC组）,同时设置BMSC移植组（BMSC组）、电针刺激组（Ea组）和生理盐水注射组（NS组）作为对照。各组分别于治疗后1、3、5、7和14d收集血清和脑组织标本,采用免疫荧光法检测出血灶周边区MMP-9的表达变化,放射免疫法检测血清IL-2的含量。采用单因素方差分析中的LSD法进行统计分析。结果Ea—BMSC组的MMP-9表达在1～7d时低于NS组（t值分别为9．85、5．76、7．05、3．13,P均〈0．05）,在全部时间点均低于BMSC组（t值分别为8．91、11．68、11．20、10．11、2．76,P均〈0．05）,而在3—14d时则高于Ea组（t值分别为-3．38、-3．98、-5．66、-13．07,P均〈0．05）。Ea．BMSC组的血清IL-2含量在5d和7d时高于Ns组（t值分别为-4．15、-3．81,P均〈0．05）,在3d和5d时分别低于和高于BMSC组（t值分别为2．76、-3．69,P均〈0．05）,在3d和14d时分别高于和低于Ea组（t值分别为-2．90、5．64,P均〈0．05）。结论电针联合BMSC移植治疗可抑制因单纯BMSC移植治疗所引起的MMP-9表达增高,且较电针组和BMSC组更能使IL-2含量保持在较稳定的水平。     

Lentiviral gene transfer ameliorates disease progression in Long-Evans cinnamon rats: An animal model for Wilson disease

Objective. Wilson disease is a copper storage disorder caused by mutations in the ATP7B gene leading to liver cirrhosis. It has previously been shown that lentiviral vectors can govern an efficient delivery and stable expression of a transgene. The aim of this pilot study was to prove the principle of a lentiviral gene transfer in the Long-Evans cinnamon (LEC) rat, an animal model of Wilson disease. Material and methods. LEC rats were treated either by systemic application of lentiviral vectors or by intrasplenic transplantation of LEC-rat hepatocytes lentivirally transduced with ATP7B. The ATP7B gene expression was analyzed by RT-PCR and immunofluorescence analysis. The therapeutic effect was assessed by analysis of liver histology, serum ceruloplasmin oxidase activity, and liver copper content. Results, Hepatic expression of the transgene was detected at different time-points post-treatment and lasted for up to 24 weeks (end of experiment). Liver copper levels were lowered in all treatment groups compared to untreated LEC rats. Twenty-four weeks after treatment, the area of the examined liver-tissue sections occupied by fibrosis was 48.3–57.9% in untreated LEC rats and 10.7–19.8% in rats treated with cell therapy. In systemically treated rats, only small fibrous septa could be observed. Conclusions. These data prove for the first time that lentiviral ATP7B gene transfer is feasible in Wilson disease. In our pilot study the systemic approach was more promising in ameliorating disease progression than the transplantation of lentivirally transduced hepatocytes.