端粒酶小干扰RNA技术体外抑制Hut78细胞生长及诱导凋亡的研究

目的探讨针对端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）技术对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞株Hut78端粒酶活性和细胞生长的影响。方法用T7 RNA聚合酶介导的体外转录法合成两对hTERT—siRNA．将合成的siRNA转入Hut78细胞中，用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测Hut78细胞端粒酶活性及hTERT mRNA的表达。用MTT法和流式细胞仪分析细胞增殖及凋亡的变化。结果将合成的siRNA（250ng）转染入Hut78细胞48h后，端粒酶活性被明显抑制，抑制率分别为68％和64％；hTERT mRNA的表达下降。细胞生长抑制作用有明显的剂量依赖性，以1000ng剂量抑制效果最明显。同时观察到细胞凋亡，凋亡率分别为15、86％和11.10％（P〉0．05）。结论体外转录法合成的hTERT-siRNA能明显抑制Hut78细胞端粒酶的活性，降低hTERT基因表达．抑制细胞生长增殖及诱导细胞凋亡。     

喜树碱抑制HaCaT细胞增殖、诱导凋亡及对端粒酶活性的影响

目的探讨喜树碱对HaCaT细胞抑制增殖、诱导凋亡的作用及对端粒酶活性的影响。方法将不同浓度的喜树碱作用于HaCaT细胞24,48和72 h,用MTT法、光镜、电镜和流式细胞仪检测其对细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用;TRAP-ELISA法检测其对细胞端粒酶活性的影响。结果喜树碱能以时间和浓度依赖性的方式抑制HaCaT细胞增殖,作用24,48,72 h的最大抑制率分别为85.1%,94.3%,98.6%;且能以浓度依赖性的方式诱导HaCaT细胞凋亡,将细胞阻止于S期,并使细胞表现出典型的凋亡形态学特征,在诱导凋亡和低于诱导凋亡的浓度下均可抑制细胞端粒酶活性。结论喜树碱抗银屑病的机制与抑制角质形成细胞增殖、诱导凋亡有关,其作用可能是通过抑制端粒酶活性来实现的。     

hTERT反义寡核苷酸抑制Hut78细胞端粒酶活性及诱导细胞凋亡的研究

目的 探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因反义寡核苷酸对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株端粒酶活性及细胞生长的影响,为CTCL基因治疗提供新的基因靶点。方法 采用脂质体介导的基因转染方法,将不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)的寡核苷酸分别导入CTCL细胞株Hut78中;分别于不同的时间,应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法(PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪技术等动态观察转染细胞中端粒酶活性、hTERT mRNA表达以及细胞凋亡的变化。结果 经hTERT反义寡核苷酸(AODN)作用72h后,细胞端粒酶的活性明显下降,hTERT mRNA的表达减弱,并可观察到细胞凋亡,凋亡细胞发生率为13.05%。细胞生长抑制作用有明显的时效性,以30μmol/L、72h时下降最明显。而有义寡核苷酸(SODN)组和对照组以上指标均无明显变化(P>0.05)。结论 hTERT反义寡核苷酸可显著抑制CTCL细胞的端粒酶活性,抑制细胞生长增殖,诱导细胞凋亡。     

hTERT-siRNA及hTR-siRNA的合成及对Hut78细胞端粒酶活性的影响

目的探讨合成端粒酶逆转录酶(hTERT)基因及端粒酶RNA(hTR)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞株Hut78端粒酶活性的影响。方法采用体外转录法分别合成两条hTERT—siRNA及hTR—siRNA。采用siRNA直接处理细胞裂解液及磷酸钙共沉淀法将siRNA转染入Hut78细胞两种处理方式,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP—PCR) 及聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测端粒酶活性的变化。结果体外转录法能高效合成siRNA,产量达 22．4 μg／40μL siRNA合成体系。经250 ng siRNA直接处理细胞裂解液后,可高效降低端粒酶的活性,抑制率达87％左右。30 ng siRNA转染细胞36 h后,可降低端粒酶活性20％左右,而250 ng siRNA可降低 75％左右。结论体外转录法能高效、快速、大量合成siRNA,针对hTERT及hTR基因的siRNA可明显降低Hut78细胞株的端粒酶活性。     

西达本胺联合苦参碱对皮肤T细胞淋巴瘤细胞系增殖、凋亡的影响及可能的凋亡机制

【摘要】 目的 研究西达本胺联合苦参碱对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨其凋亡机制。方法 采用0.4 μmol/L西达本胺、0.6 g/L苦参碱单药或联合分别作用HH、Hut78细胞24、48、72 h后,MTS法检测HH、Hut78细胞增殖率。二甲基亚砜（DMSO）处理HH、Hut78细胞作为对照组。西达本胺、苦参碱单药或联合作用两细胞系48 h后,流式细胞仪检测HH和Hut78细胞凋亡率,Western免疫印迹法检测各组细胞凋亡相关蛋白的表达。统计分析采用重复测量、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 与对照组相比,西达本胺、苦参碱单药或联合均能一定程度抑制HH、Hut78细胞增殖（F = 15.88、558.26,P < 0.05、 < 0.001）。48 h时,Hut78细胞系苦参碱组（20.98% ± 1.53%）、西达本胺组（22.44% ± 7.74%）和联合组细胞凋亡率（44.53% ± 1.85%）均显著高于对照组（8.42% ± 4.23%;LSD-t = 4.76、5.31、13.69,均P < 0.05）,且联合组显著高于苦参碱组和西达本胺组（LSD-t = 8.93、8.37,均P < 0.01）。HH细胞系苦参碱组（13.98% ± 3.86%）、西达本胺组细胞凋亡率（13.61% ± 1.62%）与对照组（11.44% ± 1.43%）相比差异无统计学意义（均P > 0.05）,但联合组（20.94% ± 0.64%）显著高于对照组、苦参碱组和西达本胺组（LSD-t = 7.37、5.40、5.69,均P < 0.05）。HH细胞系中,联合组caspase-3剪切体蛋白表达显著高于对照组、苦参碱组和西达本胺组（均P < 0.05）,而E-cadherin、p65、p-Bad及Bcl-2蛋白表达显著低于其他3组（均P < 0.05）。Hut78细胞系中,苦参碱组、西达本胺组和联合组E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表达均显著低于对照组（均P < 0.05）,仅西达本胺组和联合组caspase-3剪切体蛋白表达显著高于对照组（均P < 0.05）。HH及Hut78细胞4组Bad蛋白表达差异均无统计学意义（均P > 0.05）。结论 西达本胺联合苦参碱可抑制HH、Hut78细胞增殖,诱导其凋亡,其机制可能与调控细胞凋亡相关蛋白E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2及caspase-3剪切体蛋白表达有关。     

IFN-α对人皮肤淋巴瘤细胞系Hut78的影响

目的研究IFN-α对人皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨IFN-α治疗CTCL的机制。方法分别用3000,5000,10000,20000U/mL的IFN-α作用Hut78细胞24,48,72h后,利用MTS法检测Hut78细胞的生存率;并用流式细胞术检测不同浓度IFN-α作用细胞24h后,Hut78细胞的凋亡情况。运用Real-time PCR检测不同时间点IFN-α作用后,BCL11B mRNA的表达情况,Western blot检测不同时间点IFN-α作用后BCL11B蛋白的表达情况,免疫荧光检测IFN-α不同时间点作用后,BCL11B蛋白在Hut78细胞表达程度和分布情况。结果 IFN-α能明显抑制Hut78细胞的增殖,且这种作用呈剂量依赖性和时间依赖性。其抑制效应在48h达到峰值。IFN-α还能显著诱导Hut78细胞的凋亡,其作用亦呈浓度依赖性。10000U/mL IFN-α作用细胞3,6,9,12h后,BCL11B mR-NA表达均显著降低,其中在6h时间点BCL11B的mRNA表达下降到最低点,10000U/mL IFN-α作用细胞6,12,24h后BCL11B的蛋白也明显降低,在12h时间点,BCL11B的蛋白表达量下降至最低。结论 IFN-α通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡对CTCL起到治疗作用,并可通过降低BCL11B的表达,促进细胞凋亡,并提高CTCL细胞对常规化疗的敏感性。     

白黎芦醇对人表皮样癌细胞端粒酶活性及其增殖、凋亡的影响

目的观察白藜芦醇诱导人表皮样癌A431细胞的凋亡情况,并探讨其对端粒酶活性和hTERT基因蛋白表达的影响。方法以不同浓度的白藜芦醇处理A431细胞,显微镜观察细胞的形态学改变;MTT法检测细胞增殖情况;采用TRAP-PCR-ELISA法测定A431细胞的端粒酶活性;蛋白质印迹法检测A431细胞hTERT蛋白水平。结果在白藜芦醇诱导A431细胞凋亡的过程中对端粒酶活性有显著抑制作用,且随着其浓度增加而抑制作用越强;白藜芦醇能降低A431细胞hTERT蛋白的表达,且呈浓度依赖性。结论白藜芦醇能下调hTERT蛋白表达,抑制A431细胞端粒酶活性,这可能是白藜芦醇抑制A431细胞增殖的重要机制之一。     

咪喹莫特对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的 探讨咪喹莫特对人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖及端粒酶活性的影响。方法 使用噻唑蓝（MTT）法检测药物处理后细胞生长抑制情况，细胞克隆形成试验检测药物处理后细胞增殖能力变化，倒置显微镜观察药物作用前后细胞形态改变；端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法（TRAP-ELISA）检测细胞端粒酶活性变化；细胞免疫组化和实时定量RT-PCR技术检测端粒酶活性相关c-Myc基因表达情况。结果 咪喹莫特能明显抑制SCL-1细胞增殖，并存在浓度依赖性。培养48 h时，0，0.05，0.10，0.15和0.20 g/L咪喹莫特组细胞增殖抑制率分别为0，31.3% ± 3.19%，44.7% ± 4.21%，49.2% ± 3.71%和71.6% ± 3.24%。咪喹莫特作用SCL-1细胞48 h，端粒酶活性随药物浓度增高呈显著的递减关系。48 h时，0.05和0.15 g/L咪喹莫特组c-Myc mRNA和蛋白表达均低于空白对照组（P ＜ 0.05）。结论 咪喹莫特可明显抑制SCL-1细胞的增殖，降低c-Myc基因表达，下调SCL-1肿瘤细胞端粒酶活性，可能是其抗癌作用的机制之一。     

重组免疫毒素hIL2- Luffin P1联合维A酸对Hut-78细胞的影响

目的:评价重组免疫毒素hIL2- Lufin P1联合维A酸乙酯对皮肤T淋巴瘤细胞(Hut - 78)增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法:将不同浓度hIL2- Luffin P1分别联合10-7 mol/L维A酸乙酯处理Hut - 78细胞,用MTr法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期.结果: 用浓度为0.5、1、10、20、30、40 μg/mL的hIL2- Luffin P1分别联合10-7 mol/L的芳维A酸乙酯作用Hut - 78细胞48h,对Hut- 78细胞的抑制率分别为21.33±1.65、28.30±2.42、40.58±1.69、51.57±2.54、63.15±2.41、72.45±1.76;用30μg/mL的hIL2 - Luffin P1联合10-7mol/L芳维A酸乙酯分别作用于Hut - 78细胞12、24、36、48h,对Hut - 78细胞的抑制率为26.96±1.91、38.05±1.64、51.22±0.57、64.30±2.19、72.48±2.23.经浓度为1、30μg/mL的hIL2- Luffin P1分别联合10-7 mol/L的维A酸乙酯作用Hut - 78细胞48h,细胞的凋亡率分别为15.94±1.66和34.89±2.11.经30μg/mL的hIL-2 - Luffin P1联合10-7 mol/L的维A酸乙酯作用Hut - 78细胞48h,主要表现为G1期细胞比例增加和S期减少.结论:hIL2- Luffin P1联合维A酸乙酯能够抑制Hut - 78细胞的增殖及凋亡.     

西达本胺联合姜黄素对人皮肤T细胞淋巴瘤细胞系Hut78的影响及其分子机制

目的 研究西达本胺联合姜黄素对皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨西达本胺联合姜黄素治疗CTCL的机制。 方法 分别用0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L西达本胺,10 μmol/L姜黄素,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素处理Hut78细胞24、48、72 h后,采用MTS法检测Hut78细胞的生存率。用0.6、1.2 μmol/L西达本胺,10 μmol/L姜黄素,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素分别处理Hut78细胞24 h,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期,用实时PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因Fas、caspase 8、NF-κB p65及细胞周期相关基因P21、CDK2、细胞周期蛋白E（cyclin E） mRNA和蛋白的表达。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析和LSD-t检验。 结果 西达本胺能明显抑制Hut78细胞的增殖,且呈剂量依赖性（F = 266.558,P < 0.001）和时间依赖性（F = 564.966,P < 0.001）。培养48 h和72 h时,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素对细胞增殖的抑制作用显著强于1.2 μmol/L西达本胺及10 μmol/L姜黄素（均P < 0.001）。流式细胞仪结果显示,联合组的凋亡细胞比例均显著高于0.6、1.2 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）。此外,联合组和1.2 μmol/L西达本胺组G0/G1期细胞比例明显高于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组,而其S期细胞比例及G2/M期细胞比例均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.05）,联合组与1.2 μmol/L西达本胺组各细胞周期比例差异均无统计学意义（均P > 0.05）。实时PCR结果显示,联合组和1.2 μmol/L西达本胺组Fas、caspase 8、P21 mRNA的表达均明显高于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）,而其NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表达均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组（均P < 0.001）。联合组Fas mRNA的表达明显高于1.2 μmol/L西达本胺组（P < 0.001）,而caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表达与1.2 μmol/L西达本胺组差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹结果显示,联合组与0.6、1.2 μmol/L西达本胺、不加药物的对照组比较,Fas、caspase 8、P21蛋白的表达明显增加,而NF-κB p65、CDK2、CyclinE蛋白的表达明显降低,与以上基因mRNA的表达一致。 结论 西达本胺通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制CTCL细胞系Hut78生长,联合姜黄素能明显提高抑制CTCL细胞系Hut78的生长率。     

Antitumour effects in mycosis fungoides of the immunomodulatory, tellurium-based compound, AS101

BACKGROUND: The immunomodulator AS101 [ammonium trichloro (dioxoethylene-O,O') tellurate], a nontoxic tellurium (IV) compound, has antitumoral effects which were demonstrated in several preclinical and clinical studies. OBJECTIVES: To investigate the antitumour activity of AS101 on cutaneous T-cell lymphoma (CTCL), of which mycosis fungoides (MF) is the most frequent disease variant. METHODS: We used a newly established mouse xenograft model for MF to test the effect of AS101 in vivo and analysed apoptosis induction in vitro. RESULTS: When injected intratumorally, AS101 delayed tumour growth in a dose-dependent manner. In vitro, AS101 induced a dose-dependent G2/M arrest in the CTCL cell lines Hut78 and MyLa. Moreover, higher concentrations of AS101 induced apoptosis in MyLa cells. Programmed cell death was associated with the loss of mitochondrial transmembrane potential and activation of caspase 9 and caspase 3. AS101 also elevated intracellular reactive oxygen species (ROS) production; the antioxidant, Mn superoxide dismutase, significantly reduced the degree of apoptosis, suggesting that ROS play a key role in apoptosis induction. CONCLUSIONS: These findings indicate that AS101 may be a promising antitumour drug for CTCL.     

The retinoid derivant ECPIRM selectively exhibited anti-proliferation effects in cutaneous T-Cell lymphoma via ITK-mediated signaling pathway

BackgroundThe treatment of Cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) met huge challenges because of the heterogeneity and the scarcity of targeted drugs. ECPIRM derived from isotretinoin exhibited strong anti-proliferation effects in Hut78 and MJ cells rather than Myla cells. However, there was no data regarding the potential target of ECPIRM for its selective activity.ObjectivesTo investigate the potential target of ECPIRM for its selective anti-proliferation activity.MethodsWe evaluated the cell viability of CTCL cells after ECPIRM treatment, and detected the effects of ECPIRM on the biomarker genes of CTCL. Subsequently, the mRNA and protein level of Interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) was determined. Then the induction of apoptosis triggered by ITK inhibitor BMS-509744 and ITK siRNAs were detected, and the docking of ECPIRM interacted with ITK and the effects of ECPIRM on ITK-mediated signaling pathway were analyzed. Finally, we evaluated the anti-growth activity of ECPIRM in Hut78-xenografted nude mice, and the relative expression of cleaved caspase-3, ITK, p-ERK and p-Akt were determined.ResultsITK was highly expressed in Hut78 and MJ cells rather than Myla cells, and targeted inhibition of ITK triggered cell apoptosis. ECPIRM efficiently bound the hydrophobic active pocket of ITK, and significantly inhibited ITK-mediated signaling pathway. In addition, ECPIRM suppressed tumor growth in Hut78-xenografted model, and upregulated the expression of cleaved caspase 3 and inhibited the expression of ITK, p-ERK and p-Akt in tumor tissues, which was consistent with in vitro study.ConclusionECPIRM might provide a novel strategy for CTCL by inhibiting ITK-mediated signaling pathway.     

重组免疫毒素hIL2-LuffinPl联合维A酸对Hut-78细胞的影响

目的：评价重组免疫毒素hIL2-Ltttlin P1联合维A酸乙酯对皮肤T淋巴瘤细胞（Hut-78）增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法：将不同浓度hIL2-LttffinP1分别联合10^-7mol／L维A酸乙酯处理Hut-78细胞,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。结果：用浓度为0．5、1、10、20、30、40μmL的hI心-LuflinP1分别联合10^-7mol／L的芳维A酸乙酯作用Hut-78细胞48h,对Hut-78细胞的抑制率分别为21．33±1．65、28．30±2．42、40．58±1．69、51．57±2．54、63．15±2．41、72．454±1．76;用30μ／mL的hIL2-LuffinP1联合10^-7mol／L芳维A酸乙酯分别作用于Hut-78细胞12、24、36、48h,对Hut-78细胞的抑制率为26．96±1．91、38．05±1．64、51．22±0．57、64．30±2．19、72．48±2．23。经浓度为1、30μg／mL的hIL2-LuffinP1分别联合10^-7mol／L的维A酸乙酯作用Hut-78细胞48h,细胞的凋亡率分别为15．94±1．66和34．89±2．11。经30μg／mL的hIL-2-LuffinP1联合10^-7mol／L的维A酸乙酯作用Hut-78细胞48h,主要表现为G1期细胞比例增加和s期减少。结论：hIL2-Luf．6nP1联合维A酸乙酯能够抑制Hut-78细胞的增殖及凋亡。     

Selective induction of apoptosis by histone deacetylase inhibitor SAHA in cutaneous T-cell lymphoma cells: relevance to mechanism of therapeutic action

Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), an orally administered inhibitor of histone deacetylases, is currently in phase II clinical trials for cutaneous T cell lymphomas (CTCL), but the mechanism of SAHA action is unknown. In this study, we investigated the anti-tumor effects of SAHA in CTCL cell lines and freshly isolated peripheral blood lymphocytes (PBL) from CTCL patients with high percentage of circulating malignant T cells. Three cell lines (MJ, Hut78, and HH) and PBL from 11 patients and three healthy donors were treated with SAHA (1, 2.5, and 5 microM) for 24 and/or 48 h. Apoptosis was determined by flow cytometry analysis of sub-G1 hypodiploid nuclei and/or annexin V binding populations. Acetylated histones and apoptosis-associated proteins were detected by Western blotting. SAHA at 1-5 microM for 24 and 48 h induced apoptosis in a concentration- and time-dependent manner in three cell lines: MJ (0%-7% and 1%-32%), Hut78 (4%-36% and 5%-54%), and HH (4%-67% and 8%-81%). SAHA at 1-5 muM for 48 h also induced more apoptosis of patients' PBL than healthy donors' (15%-32%versus 6%-13%, p < 0.05). SAHA treatment caused an accumulation of acetylated histones (H2B, H3, and H4), an increase of p21(WAF1) and bax proteins, a decrease of Stat6 and phospho-Stat6 proteins, and activation of caspase-3 in CTCL cells. Our data suggest that selective induction of malignant T cell apoptosis and modulation of acetylated histones, p21(WAF1), bax, Stat6, and caspase-3 may underlie the therapeutic action of SAHA in CTCL patients.     

茅莓总皂苷对三种皮肤肿瘤的体外抗肿瘤作用

目的评价茅莓总皂苷对三种皮肤肿瘤的体外抗肿瘤药效作用。方法用A375黑色素瘤细胞、Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤细胞和A431人表皮癌细胞为癌细胞株,观察茅莓总皂苷的体外抗肿瘤作用。结果茅莓总皂苷对A375黑色素瘤细胞和Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤两种皮肤肿瘤细胞的增殖有明显的抑制作用,与对照组比较差异有显著性(P<0.05);对人表皮肤癌细胞无明显抑制作用。结论茅莓总皂苷对A375黑色素瘤细胞和Hut-78人皮肤T细胞淋巴瘤两种皮肤肿瘤细胞有明显的抗肿瘤活性。