肝细胞中HBV X基因的表达及其共培养的肝星状细胞的增殖和迁移

目的:研究乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBV X)基因在乙型肝炎病毒致肝纤维化中的作用.方法:构建HBV X基因真核表达载体pHBV-X-IRES2-EGFP,将其转染人肝细胞HL-7702后分成2组,一组经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株(L02/x),另一组予瞬时转染48 h(L02/48x).Real-time PCR、Western blot鉴定2组细胞HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,将L02/x和L02/48x细胞分别与肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)共培养36 h,并检测各组HSCs增殖和迁移情况.结果:Real-time PCR和Western blot实验显示,转染pHBV-X-IRES2-EGFP载体的L02/x和L02/48x细胞均有HBV X基因的表达.与转染空质粒和未转染的肝细胞组对照,与L02/x和L02/48x细胞共培养的HSCs的增殖和迁移均显著增多.结论:HBV X基因在肝细胞中的表达可以促进HSCs发生增殖和迁移,从而在乙型肝炎病毒致肝纤维化过程中起重要作用.     

B和C基因型HBV核心蛋白促细胞凋亡的比较

目的:比较B,C两种基因型HBV核心蛋白在促进肝细胞凋亡方面的差异,以期初步阐述HBV基因型与临床关系的发病机制.方法:用PCR扩增4份(B和C基因型各2份)HBV-C区DNA片段,通过基因重组、分子克隆和亚克隆等方法,合成4份不同基因型和临床表型的重组真核表达质粒.鉴定后,将他们分别转染至肝癌细胞系HepG2中,采用MTT法和流式细胞仪测定转染细胞的细胞增殖率和细胞凋亡率等指标.结果:4份重组真核表达质粒均构建成功,转染至HepG2后通过内参照EGFP可鉴定出均有HBV-C蛋白表达.流式细胞仪提示C型/重型HBV转染组的细胞凋亡率显著高于B型/携带HBV转染组(8.8%±2.0%vs6.4%±0.8%,P<0.05).结论:C型HBV核心蛋白较B型HBV更能促进肝细胞凋亡,HBV基因型与临床相关性可能与此有关.     

HBV基因型（B/C）是影响HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清HBsAg水平的重要因素

目的了解HBV基因型（HBV/B和HBV/C）对血清HBsAg水平的影响。方法对492例慢乙型肝炎患者应用亚培12000进行血清HBsAg定量检测,基因分型采用PCR联合限制性片段长度多态性方法。将不同基因型HBV复制质粒转染Huh7细胞,比较HBsAg分泌效率。结果HBV/B患者（n=260）血清HBsAg水平高于HBV/C（n=197）患者（P〈0.001）。以全部患者为研究对象的多变量回归分析发现,HBV DNA水平（B=0.098,P=0.002）、HBeAg状态（B=0.594,P〈0.001）和HBV基因型（B=-0.420,P〈0.001）决定血清HBsAg水平;在HBeAg（＋）患者中（n=337）,HBV DNA水平（B=0.136,P=0.001）、性别（B=0.441,P=0.011）和HBV基因型（B=-0.278,P=0.049）决定血清HBsAg水平;而在HBeAg（-）患者中（n=155）,仅HBV DNA水平（B=0.195,P=0.018）是影响血清HBsAg水平的因素。转染试验表明HBV/C的HBsAg的分泌效率仅有HBV/B的1/3（P=0.010）。结论HBV基因型因为不同的HBsAg分泌效率影响HBeAg阳性患者HBsAg水平。     

乙型肝炎病毒B和C基因型全基因组的克隆与真核细胞表达

目的 构建B和C基因型重组HBV表达载体,检测其在Huh7细胞内的DNA复制和HBsAg、HBeAg的表达.方法 扩增B和C基因型HBV全基因组,并将其连接于真核表达载体pHY106,将这2个载体分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照.Southern印迹法检测转染72 h后HBV DNA的复制,实时定量PCR检测转染后24、48、72、96和120 h Huh7细胞内HBV DNA水平,ELISA检测转染后24、48、72、96和120 h细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了B和C基因型HBV表达载体.转染Huh7细胞后72 h,Southern印迹法检测到细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括松弛环状DNA、双链DNA和单链DNA.实时定量PCR检测发现病毒DNA复制水平可达8 lg拷贝/mL、ELISA结果显示HBsAg和HBeAg的表达于转染后72 h达高峰,然后逐渐下降.结论 成功构建B和C基因型重组HBV真核表达载体,并能在Huh7细胞内高水平复制和表达,为进一步研究HBV的结构与功能、基因表达与调控,以及抗HBV药物的筛选等提供了良好的平台.     

HBV核心蛋白和B7.1分子嵌合质粒的构建及体表达的初步研究

目的 构建HBV核心蛋白和B7.1分子真核表达嵌合质粒,并检测其在体外的表达。方法 利用亚克隆技术,将HBV核心基因片段和B7.1基因片段构建至真核表达质粒pcDNA3中,测定序列后,用脂质体包裹转染细胞,采用间接免疫荧光法检测两种蛋白的表达。结果 核酸序列测定 证实实施所构建的质粒正确,嵌合质粒中所含 的HBc Ag和B7.1分子的核苷酸序列与HBVadr亚型标准株核心区及鼠B7.1分子的同源性分别为98.18%和99.89%。该嵌合质粒在体外转染细胞内可表达HB cAg和B7.1分子.结论 实验所构的HBcAg/B7.1嵌合质粒能在体外同时表达HBcAg和B7.1分子。     

1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对血管内皮细胞生长因子的影响

目的建立乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因（HBV X—HCV C）共表达HepG2细胞模型，并探讨其对血管内皮细胞生长因子表达的影响。方法双酶切质粒pXT1—X，得到完整的HBV X基因片段后，将其插入到质粒PBK—CMV和PBK—HCV C的相应酶切位点，得到重组质粒PBK—X和PBK—X—C；再将质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，逆转录聚合酶链反应、Western blot鉴定HBV X和HCV C蛋白表达，免疫组织化学、Western blot检测血管内皮细胞生长因子蛋白质表达。结果质粒PBK—CMV、PBK—X、PBK—HCV C和PBK—X—C在HepG2细胞中有稳定表达。共表达HBV X—HCV C蛋白的细胞血管内皮细胞生长因子蛋白质表达较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高。结论HBV X—HCV C共表达能显著上调血管内皮细胞生长因子蛋白质表达，提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用。     

pcDNA3-HBV瞬时转染对巨噬细胞活性的影响

目的利用HBV全基因真核细胞表达载体pcDNA3-HBV研究HBV感染后对巨噬细胞活性的影响,探讨慢性乙型肝炎患者免疫耐受发生的机制。方法常规制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3-HBV、pcDNA3质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNApEGFPN1以9∶1混合,利用脂质体转染试剂盒,共转染小鼠腹腔巨噬细胞。转染后72h,半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测HBV前S1、TNFα、白介素(IL)-1βmRNA的表达,流式细胞术测GFP的表达强度、检测核因子κB(NF-κB)蛋白的表达,利用Griess反应检测转染前后培养上清液中NO的水平。结果流式细胞术结果表明,pcDNA3-HBV与pcDNA3转染的巨噬细胞中GFP的表达率无明显差异,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中检测到前S1mRNA的表达。通过与βactin相比,pcDNA3-HBV转染的巨噬细胞中TNF-α、IL-1βmRNA的表达量显著低于空载体对照组(P<0.01);pcDNA3HBV转染的巨噬细胞表达NFκ-BRelA蛋白的百分数与空载体对照组相当,但平均荧光强度显著低于空载体对照组(pcDNA3HBV转染组为125.05;pcDNA3转染组为203.88);pcDNA3-HBV转染组巨噬细胞产生NO的水平显著低于pcDNA3转染组(分别为15.0±0.6,45.0±1.3,P<0.01)。结论pcDNA3HBV转染后使巨噬细胞NFκB活性显著降低,TNF-α、IL-1βmRNA的表达及NO的产生水平明显下降。     

硫酸类肝素-3-O-磺基转移酶B1对乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究硫酸类肝素-3-O-磺基转移酶B1(HS3ST381)对HBV复制的影响.方法 以HepG2细胞为阴性对照组,转染2.5μg pCH9-HBV(HBV表达质粒)的HepG2细胞为阳性对照组;转染了2.5μg pCH9-HBV、1.5 μg pcDNA3.1(HS3ST3B1表达质粒载体)和2.0μgpTZU6...     

Smac基因过表达对白血病耐药细胞株K562/AO2化疗敏感性的影响

目的 探讨Smac基因过表达对K562/A02细胞株化疗敏感性的影响.方法 构建重组腺病毒载体pAdeno-Smac,转染K562/A02细胞.实验分组:A组:pAdeno-Smac转染组;B组:空载体转染对照组;C组:正常对照组.Western blot检测转染前后细胞内Smac蛋白的表达水平.将终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5 mg/L的柔红霉素处理各组后,Annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡率.结果 成功构建腺病毒载体pAdeno-Smac质粒.Western blot结果证实,经Smac基因全长cDNA转染后,K562/A02细胞中的Smac蛋白表达显著升高.经不同浓度柔红霉素处理后,A组的细胞早期凋亡率明显高于B组和C组,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05),且随着柔红霉素浓度的升高,细胞凋亡率随之升高,B组和C组之间差异无统计学意义.结论 重组腺病毒载体pAdeno-Smac可通过使K562/A02细胞中的Smac蛋白表达增高,增强细胞对化疗药物的敏感性.     

B基因型乙型肝炎病毒感染性克隆的构建及其复制能力评价

目的 构建在亚太地区广泛流行的B基因型HBV可复制性克降,为该基因型相关研究奠定基础.方法 采用分子克隆的方法在体外分别扩增HBV基因组的相应片段,并进行连接,构建含1.3倍HBV基因组的可复制性克隆.体外转染Huh7细胞系以评价其抗原分泌和病毒复制的情况,使用高压尾静脉注射建立急性感染小鼠模型以评价体内病毒分泌情况以及肝内抗原表达的情况.结果 所构建的克隆体外转染Huh7细胞后可分泌高浓度的HBsAg和HBeAg,并可以检测到明显的转录子和复制中间体.高压尾静脉注射小鼠后肝组织内可检测到HBcAg表达,血清中可以检测到HBV DNA,其水平随时间发生动态变化.结论 所构建的克隆在体外及体内均可进行复制,具有良好的复制能力.     

Expression of hepatitis B virus 1.3-fold genome plasmid in an SV40 T-antigen-immortalized mouse hepatic cell line

AIM:To investigate the expression of the hepatitis B virus(HBV)1.3-fold genome plasmid(pHBV1.3)in an immortalized mouse hepatic cell line induced by SV40T-antigen(SV40T)expression.METHODS:Mouse hepatic cells were isolated from mouse liver tissue fragments from 3-5 d old Kunming mice by the direct collagenase digestion method and cultured in vitro.The pRSV-T plasmid was transfected into mouse hepatic cells to establish an SV40LT-immortalized mouse hepatic cell line.The SV40LT-immortalized mouse hepatic cells were identified and transfected with the pHBV1.3 plasmid.The levels of hepatitis B surface antigen(HBsAg)and hepatitis B e antigen(HBeAg)in the supernatant were determined by an electrochemiluminescence immunoassay at 24,48,72 and 96 h after transfection.The expressions of HBsAg and hepatitis B c antigen(HBcAg)in the cells were investigated by indirect immunofluorescence analysis.The presence of HBV DNA replication intermediates in the transfected cells and viral particles in the supernatant of the transfected cell cultures was monitored using the Southern hybridization assay and transmission electronic microscopy,respectively.RESULTS:The pRSV-T plasmid was used to immortalize mouse hepatocytes and an SV40LT-immortalized mouse hepatic cell line was successfully established.SV40LT-immortalized mouse hepatic cells have the same morphology and growth characteristics as primary mouse hepatic cells can be subcultured and produce albumin and cytokeratin-18 in vitro.Immortalized mouse hepatic cells did not show the characteristics of tumor cells,as alpha-fetoprotein levels were comparable(0.58±0.37 vs 0.61±0.31,P=0.37).SV40LTimmortalized mouse hepatic cells were then transfected with the pHBV1.3 plasmid,and it was found that the HBV genome replicated in SV40LT-immortalized mouse hepatic cells.The levels of HBsAg and HBeAg continuously increased in the supernatant after the transfection of pHBV1.3,and began to decrease 72 h after transfection.The expressions of HBsAg and HBcAg were observed in the pHBV1.3-transfect     

流体动力学法乙型肝炎病毒感染动物模型的建立

目的:建立一种简便、有效、稳定的乙型肝炎病毒(HBV)感染的动物模型,观察该模型动物体内不同时间点各种HBV标志物的表达情况．方法:以流体动力学法尾静脉注射BALB／c 小鼠pcDNA3．1-HBV,1 wk内检测各种HBV 标志物,时间分辨免疫荧光分析法(IFMA)检测血清中HBsAg,HBeAg,抗HBs,抗HBe,抗 HBc,荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测血清HBV DNA,免疫组织化学法检测肝组织HBsAg和 HBcAg．结果:成功建立一种急性HBV感染动物模型, 第1天血清中HBsAg表达达高峰,后逐渐降低, HBeAg表达量少,分别在第4、5、7天检测到抗HBc,抗HBe,抗HBs,d1 HBV DNA滴度亦达高峰,后渐下降,免疫组织化学示HBsAg呈胞质内弥漫性分布,HBcAg亦主要为胞质型分布．结论:以流体动力学法建立的HBV模型是一种新型有效的HBV感染动物模型,能稳定较高水平表达大部分HBV标志物．     

Construction and expression of eukaryotic plasmids containing lamivudine-resistant or wild-type strains of Hepatitis B Virus genotype C

AIM： To construct eukaryotic expression plasmids of full-length Hepatitis B Virus （HBV） genotype C genome, which contain lamivudine-resistant mutants （YIDD, YVDD） or wild-type strain （YMDD）, and to observe the expression of HBV DNA and antigens [hepatitis B surface antigen （HBsAg） and hepatitis B e antigen （HBeAg）] of the recombinant plasmids in HepG2 cells. METHODS： Three HBV full-length genomes were amplified from the plasmids pMD18T-HBV/YIDD, pMD18T-HBV/YVDD and pMD18T-HBV/YMDD, using PCR. Three recombinant plasmids were generated by inserting each of the PCR products into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 （＋）, between the EcoRI and HindⅢ sites. After being characterized by restriction endonuclease digestion, and DNA sequence analysis, the recombinant plasmids were transfected into HepG2 cells. At 48 and 72 h post-transfection, the levels of intracellular viral DNA replication were detected by real-time PCR, and the expression of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant was determined by ELISA.
RESULTS： Restriction endonuclease digestion and DNA sequence analysis confirmed that the three recombinant plasmids were correctly constructed. After transfecting the plasmids into HepG2 cells, high levels of intracellular viral DNA replication were observed, and HBsAg and HBeAg were secreted into the cell culture supernatant.
CONCLUSION： Eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1 （＋）-HBV/YIDD, pcDNA3.1 （＋）-HBV/YVDD or pcDNA3.1 （＋）-HBV/YMDD, which contained HBV genotype C full-length genome, were successfully constructed. After transfection into HepG2 cells, the recombinant plasmids efficiently expressed HBV DNA, HBsAg and HBeAg. Our results provide an experimental basis for the further study of HBV lamivudine-resistant mutants.     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周血B细胞中的表达

目的　体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ） 基因变异的生物学意义。方法　应用逆转录病毒载体ｐＸＴ１ 构建ＨＢＶ／Ｃ 基因表达载体,并转染永生化人外周血Ｂ 细胞使之稳定表达ＨＢｃＡｇ。结果　重组质粒ｐＸＴ１ＨＢＶ／Ｃ 经聚合酶链反应（ＰＣＲ） 和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性,转染后的永生化人外周血Ｂ 细胞ＰＣＲ 鉴定含目的ＤＮＡ,流式细胞仪分析显示,约４７ ．４ ％ 的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论　ＨＢＶ／Ｃ基因逆转录病毒表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中稳定表达,有利于系列研究ＨＢＶ／Ｃ基因变异的生物学意义。     

Intrahepatic distribution of hepatitis B virus antigens in patients with and without hepatocellular carcinoma

AIM: To study the intrahepatic expression of hepatitis B surface antigen(HBs Ag) and hepatitis B core antigen(HBc Ag) in chronic hepatitis B patients with and without hepatocellular carcinoma. METHODS: A total of 33 chronic hepatitis B patients(mean age of 40.3 ± 2.5 years), comprising of 14 HBe Ag positive and 19 HBe Ag negative patients; and 13 patients with hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma(mean age of 49.6 ± 4.7 years), were included in our study. Immunohistochemical staining for HBc Ag and HBs Ag was done using standard streptavidin-biotin-immunoperoxidase technique on paraffin-embedded liver biopsies. The HBc Agand HBs Ag staining distributions and patterns were described according to a modified classification system. RESULTS: Compared to the HBe Ag negative patients, the HBe Ag positive patients were younger, had higher mean HBV DNA and alanine transaminases levels. All the HBe Ag positive patients had intrahepatic HBc Ag staining; predominantly with "diffuse" distribution(79%) and "mixed cytoplasmic/nuclear " pattern(79%). In comparison, only 5% of the HBe Ag-negative patients had intrahepatic HBc Ag staining. However, the intrahepatic HBs Ag staining has wider distribution among the HBe Ag negative patients, namely; majority of the HBe Ag negative cases had "patchy" HBs Ag distribution compared to "rare" distribution among the HBe Ag positive cases. All but one patient with HCC were HBe Ag negative with either undetectable HBV DNA or very low level of viremia. Intrahepatic HBc Ag and HBs Ag were seen in 13(100%) and 10(77%) of the HCC patients respectively. Interestingly, among the 9 HCC patients on anti-viral therapy with suppressed HBV DNA, HBc Ag and HBs Ag were detected in tumor tissues but not the adjacent liver in 4(44%) and 1(11%) patient respectively. CONCLUSION: Isolated intrahepatic HBc Ag and HBs Ag can be present in tumors of patients with suppressed HBV DNA on antiviral therapy; that may predispose them to cancer development.     

乙型肝炎患者血清中HBcAg与HBV复制指标的关系

目的探讨乙型肝炎患者血清ＨＢｃＡｇ与ＨＢＶ复制指标的关系及临床意义．方法对３１１例乙型肝炎患者进行了ＨＢｃＡｇ检测，并同时进行酶联法乙肝五项、地高辛法ＨＢＶＤＮＡ检测，其中２３７例进行乙肝ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡＰ）检测．结果ＨＢｃＡｇ阳性组的ＨＢＶＤＮＡ检出率（７７６％），明显高于ＨＢｃＡｇ阴性组（３５５％，Ｐ＜００１）；在ＨＢｃＡｇ阴性组中，抗ＨＢｅ阳性者仍能检出２９９％（４４／１４７）ＨＢＶＤＮＡ者阳性；ＨＢｅＡｇ，ＨＢｃＡｇ均阳性者其ＨＢＶＤＮＡ和ＤＮＡＰ的检出率高达８５９％；其他依次为ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ和ＨＢｃＡｇ均阳性者７１４％，抗ＨＢｅ，ＨＢｃＡｇ阳性者６９２％，ＨＢｅＡｇ阳性，ＨＢｃＡｇ阴性者６８４％，抗ＨＢｅ阳性，ＨＢｃＡｇ阴性者２７６％．结论血清ＨＢＶＤＮＡ，ＤＮＡＰ，ＨＢｅＡｇ和ＨＢｃＡｇ均是反映乙肝病毒复制的敏感指标，抗ＨＢｅ的出现并不表示病毒复制停止，应参考其他病毒复制指标情况．各种指标的不同组合可以清楚地反映出患者体内病毒复制状况．     

甲胎蛋白启动子介导反义乙型肝炎病毒X基因在肝癌细胞中的表达及其作用

目的 构建含甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子的反义乙型肝炎病毒X基因(HBX)真核表达载体，研究其特异性和有效性，为开发肝癌细胞特异性HBX反义RNA基因治疗乙型肝炎病毒(HBV)奠定基础。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBX(1370—1872nt)基因，克隆至EB病毒表达载体，双轮PCR筛选、鉴定基因插入方向。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，Northernblot检测HBX mRNA的表达，酶联免疫试验(ELISA)检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果 成功构建正、反义RNA表达载体pEBAF—s—HBX、pEBAF—as—HBX。Northernblot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达。pEBAF—as—HBX转染3d后，可显著抑制2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，其HBsAg、HBeAg抗原表达较正义对照分别下降37．9％和36．8％，HBV DNA降低25％。结论 反义RNA表达载体pEBAF—as—HBX仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。